▼ De acordo com a extensão do cinetócoro, os cromossomos podem ser divididos em monocêntricos, com cinetócoro localizado, e holocinéticos, com cinetócoro difuso. Diversos organismos com cromossomos holocinéticos, incluindo todas as plantas com este tipo cromossômico, apresentam uma meiose bastante peculiar, na qual são observadas 2n cromátides individualizadas na prófase II. Este tipo de meiose é denominado meiose invertida ou pós-reducional, baseado na hipótese de que a segregação das cromátides irmãs na anáfase I seria a causa das cromátides individualizadas na prófase II. Neste trabalho, foi analisado o curso meiótico de duas espécies de Cyperaceae, Rhynchospora pubera (2n = 10) e R. tenuis (2n = 4), que apresentam meiose quiasmática e aquiasmática, respectivamente. Foram encontrados fortes indícios de meiose invertida nas duas espécies, uma vez que os cinetócoros das cromátides irmãs apresentaram ligação anfitélica com o fuso na metáfase I tanto nos univalentes de R. tenuis como nos bivalentes de R. pubera. A ligação anfitélica dos cinetócoros irmãos é um pré-requisito para a segregação das cromátides irmãs na anáfase I. Adicionalmente, foram investigados neste trabalho dois aspectos da prófase I que poderiam interferir na formação de quiasmas na meiose de R. tenuis. Neste caso, foi avaliada a presença de Rad51, uma enzima que atua no reparo de quebras na dupla fita de DNA, necessária para a formação do quiasma, e de ASY1, uma das proteínas que compõe o elemento axial dos cromossomos meióticos e é necessária para a sinapse. A formação de quebras na dupla fita de DNA na prófase I parece ocorrer normalmente, com base na distribuição dos sinais da recombinase Rad51. No entanto, a imunolocalização da ASY1 revelou a formação de filamentos anormais, com aspecto borrado, em R. tenuis, contrastando com os filamentos nítidos observados em R. pubera. A análise da distribuição dos sítios de DNAr 5S e das bandas CMA+ confirmou que a meiose de R. tenuis é assináptica. Baseado nos defeitos sinápticos observados em R. tenuis, é possível que a ausência de quiasmas deva-se a uma falha na formação do complexo sinaptonêmico, uma vez que as etapadas inicias de recombinação estão presentes na espécie Advisors/Committee Members: dos Santos Guerra Filho, Marcelo (advisor).

▼ 

O conhecimento sobre a interações entre células somáticas e células germinativas é importante para a melhoria na eficácia da maturação oocitária in vitro. O oócito é um regulador da diferenciação das células foliculares e através dos fatores secretados pelo oócito (FSO) regula eventos importantes que ocorrem dentro foliculo. O fator de crescimento dos fibroblastos 2 (FGF2) é expresso pelas células do cumulus (CC) e teca e estimula a expansão das CC em bovinos e em roedores, além de ter ação antiapoptótica em células da granulosa, mas suas funções no complexo cumulus-oócito bovino não são muito conhecidas. Uma vez que há receptores de FGF em CC e granulosa sugere que há regulação parácrina e autócrina pelo FGF2. O objetivo desse trabalho foi avaliar a adição de doses crescentes de FGF2 ao meio de maturação in vitro e avaliar a taxa de quebra da vesícula germinativa (GVBD), estágio da meiose, grau de expansão das CC, grau de coesividade da matriz extracelular, além de genes relacionados com a maturação. Também avaliar a apoptose das CC, através de marcadores para caspase 3 e análise de genes relacionados a apoptose. Foi observado que a taxa de GVBD é aumentada às 6 horas de maturação, no entanto não alterou os níveis de mRNA de NPPC ou NPR2 às 6 horas; da mesma forma não alterou a porcentagem de oócitos em MII às 22 horas. Não houve diferenças significativas no grau de expansão das CC às 22 horas de cultivo, mas há um aumento na coesão da matriz extracelular dessas células. FGF2 diminuiu COX2 mRNA às 6 horas de cultivo, além de diminuir a HAS2 mRNA e elevou o CD44 mRNA, sem interferir na expressão de VERS mRNA às 22 horas de cultivo. Ainda, houve uma diminuição nas CC marcadas para caspase 3 às 22 horas, mas sem alteração na marcação de anexina V. FGF2 não alterou a expressão de FAS mRNA, mas aumentou a quantidade de transcritos de nPR mRNA e a relação anti-apoptótica BCL2/BAX. O presente estudo sugere que FGF2 está envolvido na maturação do COC bovino e a expressão do RNA nas CC é influenciada pelo oócito, o qual induz a retomada da meiose, alterações na matriz extra celular e atividade da caspase.

The knowledge about interactions between somatic cells and germ cells is important to improve the oocyte in vitro maturation. The oocyte is a regulator of the differentiation of follicle cells and through oocyte secreted factors (OSF) regulates important events that occurs inside follicle. The Fibroblast growth factor 2 (FGF2) is expressed by cumulus cells (CC) and theca cells and stimulates the expansion of CC in bovine and rodents, also have anti-apoptotic action on granulosa cells, but it functions on cumulus-oocyte complexes remains unclear. Once there are receptors for FGF on CC and granulosa cells it suggest that there is a paracrine and autocrine regulation by FGF2. The aim of this study was evaluate the addition of grade doses of FGF2 on maturation medium and assess the germinal vesicle break down (GVBD) rate, meiosis stage, expansion grade of CC, grade of cohesiveness of extra cellular matrix, besides genes…

Advisors/Committee Members: Buratini Júnior, José [UNESP], Universidade Estadual Paulista (UNESP).

▼ Les crossing-overs (CO) sont issus d’échange réciproque de matériel génétique entre les chromosomes homologues. Les COs produisent de la diversité génétique et sont essentiels chez la plupart des eucaryotes, pour la distribution équilibrée des chromosomes lors de la méiose. Malgré leur importance, et un large excès de précurseurs moléculaires, le nombre de CO est très limité dans la grande majorité des espèces (Typiquement 1 à 4 par paire de chromosomes). Cela suggère que les COs sont étroitement régulés, mais les mécanismes sous-jacents sont mal connus. Pour identifier les gènes qui limitent la formation des CO, l’équipe a mené un crible génétique chez Arabidopsis thaliana. Ces travaux ont mené à l’identification de plusieurs facteurs anti-CO, définissant trois voies : (i) L’hélicase FANCM et ses co-facteurs ; (ii) L’AAA-ATPase FIDGETIN-LIKE-1 (FIGL1) ; (iii) Le complexe RECQ4-Topoisomerase 3α-RMI1.Le premier objectif de ma thèse est d’explorer les relations entre ces trois voies en s’attachant aux questions suivantes ; (1) Jusqu’où peut-on augmenter la recombinaison en combinant les mutations dans FANCM, FIGL1 et RECQ4 ? Nous avons montré que la plus forte augmentation de recombinaison était obtenue dans recq4 figl1, atteignant 7,5 fois la fréquence du sauvage en moyenne sur le génome. (2) Quel est la distribution de ces extra-COs ? L’augmentation de recombinaison n’est pas homogène le long du génome : Les fréquences de CO augmente fortement des centromères vers les télomères, avec les plus hautes fréquences observées dans les régions distales. (3) La modification des fréquences de recombinaison est-elle identique lors des méioses mâles et femelle ? Chez le sauvage, la fréquence de recombinaison est plus élevée lors de la méiose mâle que femelle. Au contraire, la recombinaison femelle devient plus élevée que la recombinaison mâle chez les mutants recq4 et recq4 figl1. Ceci suggère que des contraintes qui s’appliquent sur la formation des CO lors de la méiose femelle sont relâchées chez ces mutants. En poursuivant le crible génétique, un nouveau mutant hyper-recombinant a été identifié. Le second objectif de ma thèse fut d’identifier et de caractériser fonctionnellement le gène correspondant. Une cartographie génétique et des études d’interactions protéine-protéine, ont mené à l’identification d’un facteur qui interagit directement avec FIGL1 et semble former un complexe conservé depuis les plantes jusqu’au mammifères. Nous avons baptisé cette protéine FLIP (Fidgetin-like-1 interacting protein). Les fréquences de recombinaisons sont augmentées dans flip-1, confirmant que FLIP1 limite la formation des COs. Des études d’épistasie ont montré que FLIP et FIGL1 agissent dans la même voie. De plus les protéines FIGL1/FLIP d’Arabidopsis ou humaine, interagissent avec RAD51 et DMC1, les deux protéines qui catalyse une étape clef de la recombinaison, l’invasion d’un ADN homologue. Finalement, dans flip comme dans figl1, la dynamique de DMC1 est modifiée. Nous proposons donc un modèle dans lequel le complexe FLIP-FIGL1 régule… Advisors/Committee Members: Mercier, Raphaël (thesis director).

▼ 

Os objetivos deste estudo foram: (1) avaliar os efeitos da cilostamida e das metades foliculares sobre o bloqueio da retomada da meiose de oÃcitos in vitro no complexo cumulus oÃcito bovinos (COC) , (2) investigar a reversibilidade do efeito da cilostamida na retomada da meiose, e (3) quantificar os nÃveis de AMPc em COCs, oÃcitos desnudos (OD) e cÃlulas do cumulus (CC) apÃs o cultivo de COCs na presenÃa de cilostamida e metades foliculares. Para este fim, os oÃcitos de bovino foram submetidos a um perÃodo de prÃ-maturaÃÃo de 12 h em meio contendo 10 μM cilostamida, metades foliculares ou combinaÃÃo de ambos e, em seguida, submetidos a maturaÃÃo in vitro. Para avaliar a reversibilidade do efeito da cilostamida, no final deste perÃodo de cultura, COC foram lavados e colocados em meio de maturaÃÃo, sem cilostamida por 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 horas. Para avaliar os nÃveis de AMPc, COCs submetidos a prÃ-maturaÃÃo por 6 h foram utilizados para a quantificaÃÃo do nÃvel de AMPc. ApÃs 12 horas de cultivo, grupos de COCs foram fixados para avaliar a configuraÃÃo da cromatina e progressÃo da meiose. Os resultados mostraram que COCs cultivados em presenÃa de cilostamida e metades foliculares apresentaram percentuais significativamente maiores de oÃcitos em vesÃcula germinativa (94%), depois de um perÃodo de 12 h de prÃ-maturaÃÃo, do que COCs cultivados em outros tratamentos. ApÃs o bloqueio, 75% dos oÃcitos atingiram metÃfase II apÃs 16 horas de maturaÃÃo, enfatizando que o tratamento nÃo à tÃxico para os oÃcitos. AlÃm disso, os oÃcitos cultivados em meio contendo cilostamida e metades foliculares tinham nÃveis significativamente mais elevados de AMPc quando comparado com outros tratamentos. Concluiu-se que a cilostamida e metades foliculares interagem e promovem a manutenÃÃo de oÃcitos no estÃgio de vesÃcula germinativa, aumentando os nÃveis de AMPc em COCs cultivados.

The aims of this study were (1) to evaluate the effects of cilostamide and follicular hemisections on the blockage of in vitro oocyte meiotic resumption in bovine cumulus oocyte complexs (COCs), (2) to investigate the reversibility of cilostamide effect on meiotic resumption, and (3) to quantify the levels of cAMP in COCs, denuded oocytes (DO) and cumulus cells (CC) after culturing COCs in presence of cilostamide and follicular hemisections. To this end, bovine oocytes were subjected to a pre-maturation period of 12 h in medium containing 10 ÂM cilostamide, follicular hemisections or combination of both and,then, submitted to in vitro maturation. To evaluate the reversibility of cilostamide effect, at the end of this culture period, COCs were washed and placed in maturation medium without cilostamide for 12, 14, 16, 18, 20, 22 and 24 hours. To investigate the levels of cAMPc, COCs subject to pre-maturation for 6 h were used to measure the levels of cAMP. After 12 hours of culture, groups COCs were fixed to assess chromatin configuration and meiotic rogression. The results showed that COCs cultured in presence of cilostamide and follicular…

Advisors/Committee Members: JoÃo Garcia Alves Filho, MÃrcia Viviane Alves Saraiva, Josà Roberto Viana Silva.

▼ 

Dissertação de Mestrado em Recursos Genéticos e Melhoramento de Espécies Agrícolas e Florestais

A hibridação interespecífica permite a criação de linhas com interesse agronómico e o aumento da variabilidade genética. Os triticales são alopoliplóides criados pelo Homem com o objectivo de reunir a elevada produtividade e boa qualidade do trigo para panificação com a rusticidade, adaptabilidade (nomeadamente a solos pobres, ácidos e arenosos) e teor em lisina superior do centeio. O triticale (xTriticosecale Wittmack) resulta do cruzamento entre espécies do género Triticum L. e do género Secale L. Os tritodeuns (xTritordeum Ascherson et Graebner) são anfiplóides entre Hordeum chilense e diferentes Triticum spp, que servem de ponte para transferir genes de H. chilense para o trigo ou para o triticale. Cruzamentos interespecíficos entre tritordeum e triticale permitem a criação de mixogenomas de cromossomas de centeio e H. chilense ou translocações entre estes genomas. Os genes ribossomais constituem o sistema ideal para estudar a expressão génica a nível citológico, uma vez que é possível visualizar microscopicamente o resultado da sua expressão, tanto em células interfásicas como metafásicas, utilizando a técnica de coloração pelo nitrato de prata. Os genes ribossomais activos formam uma segunda constrição visível em cromossomas metafásicos. A metilação do DNA é uma modificação epigenética crucial do genoma que está envolvida na regulação de muitos processos celulares. Estes incluem o desenvolvimento embrionário, a transcrição, a estrutura da cromatina, a inactivação do cromossoma X, o “imprinting” genómico e a estabilidade cromossómica. Os fenómenos epigenéticos são transmissíveis e representam um estado alternativo da actividade génica que não é explicável por mutação, alterações sequenciais ou regulação normal do desenvolvimento. A metilação faz parte de um sistema tão importante quanto o conjunto de genes de um genoma que as células usam para determinar onde e quando um determinado gene vai ser expresso durante o desenvolvimento. Este sistema é colocado no DNA na forma de marcas epigénicas que são herdadas durante a divisão celular, mas não alteram a sequência de DNA. No presente trabalho efectuaram-se cruzamentos de triticale hexaplóide (cultivar 'Douro') com tritordeum hexaplóide (linhas avançadas HT9, HT31 e HT67) e estudou-se a cruzabilidade. Os cruzamentos sujeitos a tratamento com dicamba e tiossulfato de prata tiveram uma maior produção de sementes híbridas relativamente ao controlo (sem tratamento hormonal) e que esse tratamento conduzia a uma maior taxa de germinação das sementes híbridas. Em ambos os casos (com e sem tratamento hormonal) o cruzamento 'Douro' x HT31 foi o que apresentou uma cruzabilidade triticale x tritordeum mais elevada. Verificou-se também o efeito ano na cruzabilidade. Estudámos a actividade nucleolar dos progenitores triticale (AABBRR) e tritordeum (AABBHchHch) e dos híbridos F1 (AABBRHch ) usando a técnica de coloração pelo nitrato de prata. Os genes ribossomais provenientes dos…

Advisors/Committee Members: Lima-Brito, José Eduardo.

▼ 

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2014

It has been postulated that speciation can occur without geographical isolation. Chromosome rearrangements, such as inversions and translocations, have been proposed as drivers for speciation without isolation (sympatry). In sexual populations, meiosis between structurally different genomes would have high lethality. Recombination between non-linear genomes may produce progeny with imbalanced DNA content. Therefore, only meiotic products which maintain the breakpoints are viable. This causes linkage between the breakpoints, and with alleles of nearby genes. The latest models propose that rearrangements can entrap mutations which accumulate over time near the breakpoints. If recombination leads to epistasis between mutations in linkage with the breakpoints and others which are not, then selection for suppression of recombination can appear. Suppression of recombination will cause further divergence between karyotypes, and ultimately speciation. An experimental evolution setup was designed to test the chromosome speciation model, using Schizosaccharomyces pombe. Cells containing an inversion in one chromosome were mixed with wild type (WT) cells to create sympatric circumstances. Long periods of mitotic adaptive evolution were intercalated with controlled cycles of meiosis, for a total of 500 generations. We observed that the evolution of sterility was a recurrent phenotype under direct selection caused by sympatric sexual reproduction, appearing in half of the populations. In some populations sterility was fixed. In the remaining, it was maintained as a polymorphism with mating-proficient cells. In this is case, polymorphism for structure and mating type was present, unlike in the former. In one of the polymorphic populations, we also observed an increase in the frequency of healthy asci (a proxy for meiotic success) produced by heterozygous crosses. Interestingly, this was uncoupled from spore viability, which suffered no changes relatively to the ancestral crosses. Additionally, we did not observe any change in recombination rates. Our results suggest that the most common solution to meiotic incompatibility in microbial sexual populations in sympatry is sterility. This phenomenon abolishes meiotic fitness depression by completely eliminating sex, leaving karyotypes’ fates under exclusive control of adaptive forces. We thus found a new mechanism that may lead to genetic divergence between different karyotypes in facultative sexual populations.

Os genomas eucariotas estão organizados em unidades individuais de ADN compactado, os cromossomas. A conformação e ordem de genes em cada cromossoma são características de cada espécie. Não obstante, é possível encontrar variabilidade na configuração cromossómica de indivíduo para indivíduo dentro de uma espécie. Uma alteração na configuração cromossómica é denominada rearranjo cromossómico. Rearranjos cromossómicos incluem duplicações ou delecções de secções do…

Advisors/Committee Members: Ferreira, Miguel Godinho, Duarte, Júlio António Bargão, 1957-.

▼ 

The Manihot genus belongs to Euphorbiaceae family, has about 98 species and native to tropical regions of the Americas, with greatest diversity center in Brazil, with 80% of Manihot species, showing a large vegetative polymorphism and a potential source for cassava breeding programs. Cassava (Manihot esculenta Crantz) is the only commercially cultivated species, with the shoots and the tuber roots used for both human food and animal feed. Cassava roots are also used in the manufacture of flour or in the composition of other products. Karyotypic analysis in mitotic or meiotic cells concerning to chromosomal homology, numerical and structural variations, polyploidy and evolution mechanisms of the karyotypes can provide useful information for breeding programs aimed at achieving improved cultivars. In addition, a karyotype study in many cases contributes to the increase cytogenetic markers that while certain aspects related to horticultural assist in the cultivars characterization. Manihot species are considered allotetraploid, with 2n=36 chromosome and x=9 as basic number. Natural interspecific crosses can be found frequently, making in some cases infertile hybrids. Infertility is not easily detected using phenotypic analysis. However, it is believed that these species undergone diploidization process along the evolution, now showing a meiotic behavior of a diploid. This work aimed the mitotic and meiotic analysis in nine species of the genus Manihot in order to confirm the karyotypic stability described at literature data. Three varieties of cassava and eight wild species were analised. The analysis revealed strong mitotic stability among species regarding the number and chromosome morphology, average size of chromosomes of 1.75 and maximum of two pairs of satellites. The meiosis was regular in wild species and irregular in varieties of M. esculenta manipeba , showing univalent, bivalent and trivalent at metaphase-anaphase I, showing typical behavior of a triploid and partly irregular meiosis in pornunça , producing polyads in microsporogenesis. An additional study was performed with molecular marker ISSR (Inter simple sequence repeat). Polymorphism was observed in 89.7% among the locus of the species, but as expected, there was a great genetic similarity between varieties of M. esculenta cultivated for the wild species.

O gênero Manihot pertence a família Euphorbiaceae, possui cerca de 98 espécies e é nativo das regiões tropicais das Américas, apresentando um grande centro de diversidade genética no Brasil. Cerca de 80% das espécies de Manihot ocorrem no país, exibindo amplo polimorfismo vegetativo e reunindo potencial para utilização em programas de melhoramento genético do gênero. A mandioca (M. esculenta Crantz) é a única espécie comercialmente cultivada, e dela se aproveita tanto a parte aérea como suas raízes reserva para consumo humano e animal, sendo utilizada na fabricação de farinha ou como parte da composição de diversos outros produtos e subprodutos. Análise cariotípica em células mitóticas ou meióticas…

Advisors/Committee Members: Terezinha de Jesus Rangel Camara, Péricles de Albuquerque Melo Filho, Reginaldo Carvalho.

▼ La recombinaison méiotique est au cœur de l'hérédité Mendélienne, de l'évolution et de l'amélioration des plantes, car elle assure, grâce aux crossovers, une transmission fidèle des chromosomes et le brassage de l’information génétique au fil des générations. Deux voies de formation des crossovers coexistent chez les plantes. La voie principale (voie I) dépend de la protéine MSH4 (et de quelques autres). La voie secondaire ne produit que quelques crossovers (dits de voie II) au cours de la méiose d’une plante de type sauvage ; ils sont indépendants de MSH4 et leur nombre est limité par des protéines telles que FANCM. Si ces deux voies ont été bien décrites chez des espèces diploïdes, ce n’est pas le cas chez des plantes allopolyploïdes, pourtant très fréquentes parmi les plantes cultivées. Il s'agit là d'une lacune importante, car la présence de plusieurs jeux de chromosomes apparentés conduit à augmenter le nombre de partenaires susceptibles de former des crossovers et le nombre de copies de tous les gènes méiotiques, rendant la recombinaison méiotique plus complexe. Cette thèse vise à explorer l'interaction entre les voies de formation des crossovers et la polyploïdie en utilisant des mutants de colza (Brassica napus; AACC) et d’un de ces parents diploïdes (B. rapa; AA) pour deux gènes de la recombinaison méiotique.J'ai tout d'abord testé dans quelle mesure la formation de crossovers entre chromosomes homologues et entre homéologues (chromosomes A et C) est tributaire des voies I et II en évaluant l’effet d’une diminution du nombre de copies fonctionnelles de MSH4 sur le nombre de crossovers. J'ai montré que ce dernier n'est altéré que lorsque les deux copies MSH4 sont inactivées, toute autre combinaison de mutations conduisant au même nombre de crossovers inter-homologues que chez le sauvage. J'ai également montré que la proportion de crossovers de voie II chez des mutants msh4 de colza est bien supérieure à celles observées chez d’autres plantes mutantes pour msh4. Cette observation reste vraie chez des mutants msh4 de B. rapa, suggérant que la proportion accrue de crossovers de voie II n’est pas spécifique au colza, mais probablement une caractéristique des Brassicaceae. Chez des plantes allohaploïdes (AC) de colza, chez lesquelles les crossovers ne peuvent se former qu’entre homéologues, les copies MSH4 ne se compensent plus complétement ; le nombre de crossovers de voie I fluctue au contraire proportionnellement au dosage de MSH4, devenant presque nul lorsque toutes les copies sont inactivées. Mes résultats illustrent deux nouvelles propriétés spécifiques des crossovers entre homéologues: une plus grande sensibilité vis-à-vis du dosage MSH4 pour les crossovers de voie I et une plus faible efficacité des crossovers de voie II.Dans un second temps, j'ai caractérisé cytologiquement des mutants fancm de colza pour vérifier que l'augmentation des crossovers de voie II ne nuit pas à au bon déroulement de sa méiose. Cette question est restée en suspens, les mutants fancm de colza n’étant pas complètement nuls. Cet… Advisors/Committee Members: Jenczewski, Eric (thesis director).

▼ Apesar do grande volume de pesquisas e dos avanços da produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, a eficiência da técnica ainda está distante do desejável, principalmente quando comparada a embriões produzidos in vivo. A maturação in vitro é etapa importante da PIV, visto que a qualidade dos embriões é dependente da qualidade do oócito e, assim, modificações nas condições de maturação in vitro podem trazer avanços à produção de embriões. A melatonina é um hormônio que foi detectado no fluido folicular de humanos, suínos e, mais recentemente, de bovinos. Ainda, seus receptores foram localizados em oócitos e células da granulosa. Estudos in vitro apontam efeitos benéficos de sua utilização na maturação e cultivo in vitro de oócitos e embriões, embora os resultados sejam por vezes contraditórios. O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito da melatonina na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos e também seu potencial como indutor de genes de enzimas antioxidantes e inibidor de fragmentação nuclear em células do cumulus. Para tanto, complexos cumulus-oócitos (CCOs), obtidos de ovários de abatedouro, foram maturados in vitro na presença de melatonina (10-9 e 10-6 M), FSH (controle positivo) ou sem hormônios (controle negativo). As taxas de maturação nuclear foram avaliadas às 6, 12, 18 e 24 horas de cultivo (Experimento 1). No Experimento 2, os mesmos grupos experimentais foram avaliados quanto à abundância relativa de transcritos de genes de enzimas antioxidantes (Cu,ZnSOD, MnSOD e GPx) em oócitos e células do cumulus (24 horas de MIV) por PCR em tempo real. No Experimento 3 foi avaliado o efeito dos tratamentos sobre a fragmentação nuclear em células do cumulus pela técnica de TUNEL e citometria de fluxo (24 horas de MIV). A taxa de maturação avaliada às 6 h de MIV foi de 100% de oócitos imaturos em vesícula germinativa (VG) (P>0,05). Às 12 horas de cultivo foi observado o efeito da melatonina similar ao FSH, variando a proporção de oócitos em metáfase I (MI) de 54,0 a 80,7 % entre os grupos (P<0,05). Após 18 h de MIV observou-se que a maioria dos oócitos já havia atingindo o estádio de metáfase II (MII) variando de 57,2 a 74,2 % (P>0,05). Após 24 h de MIV, observou-se que a maioria dos oócitos atingiu o estádio de MII (50,7 a 89,5%), sendo que a melatonina na maior concentração apresentou efeito similar ao da gonadotrofina (P<0,05). Em relação à expressão de enzimas antioxidantes em oócitos não houve efeito de nenhum tratamento (P>0,05%). Já em células do cumulus houve maior expressão do MnSOD no grupo com FSH em relação ao grupo maturado sem hormônios ou imaturo (P<0,05). A melatonina nas diferentes concentrações apresentou efeito similar ao da gonadotrofina (P>0,05). Transcritos para a enzima Cu,ZnSOD foram mais abundantes em cumulus de CCOs maturados com a maior concentração de melatonina (10-6 M) em relação ao grupo imaturo (P<0,05), não havendo variação nos demais (P>0,05). GPX4 não foi afetado pelos tratamentos (P>0,05). A quantidade de células do cumulus com… Advisors/Committee Members: Leal, Cláudia Lima Verde.

▼ 

A ordem Gymnotiformes compreende os peixes elétricos, que estão amplamente distribuídos pelas Américas Central e do Sul. A família Gymnotidae possui apenas dois gêneros Gymnotus e Eletrophurus, sendo que este último foi recentemente incluído à família. O gênero Gymnotus é o mais especioso da ordem com 33 espécies, e é também o que comporta maior número de estudos citogenéticos. O presente trabalho teve por objetivos analisar o comportamento meiótico do sistema de cromossomos sexuais múltiplo X1X1X2X2/X1X2Y em G. pantanal. Isolar sequências de DNA repetitivo das três espécies que habitam em simpatria o rio Piquiri Paraná Brasil: G. sylvius, G. paraguensis e G. pantanal, e neste último a possível associação dessas sequências aos cromossomos sexuais. E mapear o DNAr 5S em G. paraguensis e G. pantanal. A Análise meiótica revelou a formação de um trivalente no estágio de paquíteno da Prófase I em G. pantanal formado pelos cromossomos X1, X2 e Y, pareados complementarmente caracterizando um sistema de determinação sexual recente. A metáfase II apresentou células com 18+Y e 18+X1X2 cromossomos, caracterizando uma disjunção típica dos cromossomos sexuais, dando origem a gametas balanceados. O mapeamento de sequências de DNA repetitivos isolados por C0t 1 apresentou localização em região centromérica e na região das regiões organizadoras de nucléolos de todas as espécies analisadas, inclusive nos cromossomos sexuais de G. pantanal, padrão coincidente com blocos heterocromáticos. A hibridização com sondas de DNAr 5S revelou padrão de marcação próprio em todas as espécies analisadas. Nossos dados sugerem uma origem recente para os cromossomos sexuais de G. pantanal e uma dinâmica evolutiva diferenciada para distribuição do DNAr 5S no cariótipo das espécies analisadas. Sugerindo que este caráter possa ser mais amplamente utilizado entre os Gymnotidae como marcador citotaxonômico.

The order Gymnotiformes ranges the electrical fish. Its distributed by South and Central America. Family Gymnotidae show two genus; Gymnotus and Eletrophurus, the last one was recently included in this family. Genus Gymnotus is the most widespread and show 33 species and present great number of cytogenetics studies. Our objectives in the present study were analyse the meiotic behaviour of multiple sexual chromosomes system X1X1X2X2/X1X2Y of G. pantanal, isolate sequences of repetitive DNA from three species of Gymnotus; G. sylvius, G. paraguensis and G. pantanal, inhabiting in simpatry at Piquiri River - PR BR, verify the association of these sequences with sexual chromosomes and mapping the rDNA 5S gene at G. paraguensis and G. pantanal. Meiotic analysis of G. pantanal presented one trivalent in pachytene of profase I formed by X1, X2 and Y chromosomes, totally paired characterizing a recent sexual chromosomes system. In the metaphase II was visualized cells 18+Y and 18+X1X2 chromosomes with normal disjunction of sexual chromosomes and balanced gametes. The mapping of repetitive DNA sequences, isolated by Cot1, presented location in centromeric and…

Advisors/Committee Members: Roberto Ferreira Artoni, Vladimir Pavan Margarido, Orlando Moreira Filho, Mara Cristina de Almeida.

▼ 

Cyperaceae é considerada a terceira maior família de monocotiledôneas compreendendo cerca de 120 gêneros, com 4.000 a 5.000 espécies com distribuiçãocosmopolita. No Brasil, existem de 500 a 600 espécies organizadas em 44 gêneros,preferencialmente de terrenos úmidos e alagados. Esta família apresenta algumascaracterísticas citológicas importantes como: presença de cromossomos holocinéticos eocorrência de meiose pós-reducional. Além disso, durante o processo de androsporogênesenão ocorre a formação de tétrade e os quatro núcleos resultantes da meiose são contidos emuma única célula chamada Pseudomônade. Três dos quatro núcleos degeneram e apenasum se torna viável, originando a célula vegetativa e a célula generativa. Neste trabalho,buscamos compreender a androsporogênese e androgametogênese de Rhynchosporapubera (Vahl) Boeckler nos estágios iniciais da meiose, o processo de isolamento de trêsdos quatro núcleos para posterior degeneração, a formação da Pseudomônade e odesenvolvimento do androgametófito maduro. Para tal, anteras de R. pubera foramcoletadas em Recife (PE), fixadas para microscopia de luz convencional, paraimunocitoquímica para detecção de elementos de parede celular e para microscopiaeletrônica de transmissão. Em R. pubera, a célula mãe de andrósporo passa por umprocesso de polarização, com a migração de seu núcleo para a região basal da célula,oposto ao que ocorre com os outros gêneros da família. Este núcleo também passa por umprocesso de polarização, direcionando seus complexos de poros para a região apical,voltada ao citoplasma. Após a polarização, a célula sofre meiose e apenas um núcleo migrapara região central. Os núcleos que permanecem na região basal são isolados por vesículas8do Complexo de Golgi, formando cisternas ao redor dos núcleos degenerativos. Estascisternas originam uma parede celular, que aparece interna à Pseudomônade. Esta paredefoi marcada positivamente com os anticorpos JIM7 e JIM13 que reconhecemrespectivamente pectina e proteína Arabinogalactano (AGPs). Após o isolamento, osnúcleos degenerativos mostraram características ultraestruturais indicativas de mortecelular programada. O núcleo funcional sofre a primeira mitose ainda na presença dosnúcleos degenerativos, formando a célula vegetativa e a célula generativa. A célulagenerativa sofre a segunda mitose, originando os núcleos gaméticos, após a degeneraçãocompleta dos três núcleos e antes do grão de pólen ser liberado da antera.

Cyperaceae is considered the third largest family of monocotyledonous plantscomprising about 120 genera, with 4000 to 5000 species with cosmopolitan distribution. InBrazil, there are 500 to 600 species arranged in 44 genera, preferably in moist and floodedland. This family has some important cytologic features such as presence of holocentricchromosomes and occurrence of post-reductional meiosis. Moreover, during the pollengrain development not occur the formation of tetrad and the four nuclei resulting frommeiosis are contained in a single cell called pseudomonad. Three of the four nucleidegenerate and…

Advisors/Committee Members: André Luis Laforga Vanzela ., Jorge Ernesto de Araujo Mariath, Paulo Mauricio Ruas.

▼ 

The aim of the present study was to examine the role of oxytocin (OT) on the control of oocyte meiotic resumption in the events that involves progesterone (P4) and prostaglandins (PGs). Oocytes were co-cultured with follicular hemisections for 15 h to determine the effect of different doses of OT or atosiban (ATO; oxytocin receptor antagonist) on the oocyte meiotic resumption. In another experiment, we examine the effect of P4, OT and PGs interaction on the regulatory cascade of the induction of oocyte meiotic resumption. Oxytocin in the concentration of 1 μM was effective in inducing the resumption of meiosis of oocytes co-cultured with follicular cells (84.0%), not differing statistically from the positive control group (74.4%). Similarly, atosiban inhibited the positive effect of OT on meiotic resumption in a dose-dependent manner, in which the metaphase I (MI) rate was only 27.6% in the presence of 10 μM ATO, not differing from the negative control group (25.5%). The possible toxic effect of ATO was tested in a 15 or 24 h-cumulus-oocyte complex culture system. In the third experiment, we demonstrated that P4 was able to induce the oocyte meiotic resumption, which was inhibited by ATO. However, the positive effect of OT was not blocked by mifepristone (P4 antagonist) but was inhibited by indometacine (a non-selective PTGS2 inhibitor). Collectively, these results evidenced that P4 is upstream to OT and PGs are required for the positive effect of OT to induce oocyte meiotic resumption. In conclusion, our results evince that together with Ang II, already proved by our group as involved in oocyte meiotic resumption, P4, OT and PGs are sequential steps in the hormonal cascade that culminates with resumption of meiosis in cattle.

O objetivo do presente estudo foi examinar o papel da ocitocina (OT) no controle da retomada meiótica de oócitos bovinos, além da interação desse peptídeo com a progesterona (P4) e prostaglandinas (PGs) neste evento fisiológico. Nesse estudo, verificamos a interação da P4, OT e PGs na cascata de indução de retomada meiótica do oócito. Oócitos foram co-cultivados com metades foliculares por 15 h para determinar o efeito de diferentes doses de OT ou atosiban (ATO; antagonista do receptor de ocitocina) no reinício da maturação meiótica A OT na concentração de 1 μM foi eficaz em induzir a retomada da meiose de oócitos co-cultivados com células foliculares (84,0%), não diferindo estatisticamente do grupo controle positivo (74,4%). O ATO inibiu o efeito positivo da OT sobre o reinício da meiose de uma forma dose-dependente onde a porcentagem de oócitos que atingiu o estádio de metáfase I (MI), foi apenas 27,6% na presença de 10 μM de ATO, não diferindo do grupo controle negativo (25,5%). Para confirmar que este efeito não era resultante de toxicidade ocasionada pelo ATO, foi realizado um experimento onde o efeito tóxico do ATO foi testado em um cultivo durante 15 e 24 horas, e foi possível observar que ele não apresenta efeitos tóxicos aos oócitos em cultivo, permitindo a…

Advisors/Committee Members: Rogério Ferreira, Katia Padilha Barreto, Paulo Bayard Dias Goncalves.

▼ O imprinting genómico é um mecanismo epigenético, no qual os alelos parentais são expressos diferencialmente, resultando em expressão monoalélica dos genes imprinted. Uma das marcas de imprinting é a metilação do DNA em dinucleótidos CpG, que permite a transcrição ou repressão dos genes. Na linha germinal masculina, as marcas de imprinting herdadas são apagadas e são restabelecidas as marcas paternas. A infertilidade masculina é um problema que afecta muitos casais, podendo ter várias causas. A azoospermia secretora devido a paragem de maturação meiótica é caracterizada pela presença de células germinativas que não completam o desenvolvimento espermatogénico, parando no estadio de espermatócito primário. A paragem de maturação (PM) pode ser completa, sem produção de espermatozóides (PM pura), ou incompleta, com focos de espermatozóides visíveis em bíopsias testiculares (PM não pura). Com este trabalho pretendeu-se estudar, por tratamento com bissulfito de sódio, clonagem molecular e sequenciação de DNA, os perfis de metilação dos genes imprinted H19 e MEST, em pacientes com azoospermia secretora devido a PM meiótica, e comparar estes perfis em espermatócitos primários de PMs puras e não puras. Os resultados obtidos para os espermatócitos primários de PMs puras e PMs não puras sugerem que não existem diferenças entre os dois grupos em termos de metilação dos genes imprinted. No entanto, estes resultados revelam que as células espermatogénicas dos pacientes de ambos os grupos apresentam erros de imprinting tais como alguma desmetilação no gene H19, incluindo o local de ligação-6 da proteína CTCF, e alguma metilação do gene MEST, suportando uma associação entre espermatogénese anormal e ocorrência de erros de imprinting. ABSTRACT: Genomic imprinting is an epigenetic mechanism that leads to the differential expression of parental alleles, resulting in mono-allelic expression of imprinted genes. DNA methylation at CpG dinucleotides is an imprinting mark that allows the transcription or repression of the genes. In the male germ line the heritable imprinting marks are erased and re-established the paternal marks. Male infertility is a problem affecting many couples and may have different causes. Non obstructive azoospermia with meiotic maturation arrest is characterized by the presence of germ cells that do not complete the spermatogenic development, stopping at primary spermatocyte stage. The maturation arrest (MA) may be complete, with no spermatozoa produced (pure MA), or incomplete, with rare spermatozoa in the testis (non pure MA). We studied the methylation status of the imprinted genes H19 and MEST, by sodium bisulphite treatment, molecular cloning and DNA sequencing, in patients with meiotic MA. We also compared the methylation profiles obtained for primary spermatocytes of pure MA with those obtained for non pure MA. The results obtained for primary spermatocytes of pure MA and non pure MA suggests that these groups are not different in terms of methylation of the imprinted genes. However, these results reveal… Advisors/Committee Members: Sousa, Mário Manuel da Silva Leite de (advisor), Pereira, Maria de Lourdes Gomes (advisor).

▼ Considerando a importância do comportamento meiótico e da recombinação para regular os níveis de variabilidade genética, realizamos o primeiro estudo sobre a meiose masculina e feminina de seis membros do grupo da Drosophila willistoni, um dos mais representativos da família Drosophilidae na região Neotropical. Como ponto de partida, foi necessário padronizar condições técnicas para tal, adaptando protocolos pré-existentes e estabelecidos por outros autores para espécies procedentes do Hemisfério Norte, como a cosmopolita Drosophila melanogaster e a D. ananassae. A qualidade dos preparados e a resolução por nós encontradas para as espécies do grupo willistoni, foi muito superior às obtidas para D. melanogaster, sendo comparável com a excelência das figuras meióticas propiciadas pela D. ananassae. Apesar do baixo número de células em divisão (cerca de 45% dos machos, em média) detectadas, conseguimos caracterizar as fases da divisão meiótica em primórdios das gônadas de larvas macho de D. willistoni e o padrão de sinapse do par sexual e dos autossomos. Inicialmente, foi realizada a análise de duas diferentes populações, cuja prole apresenta sinais de instabilidade genética (como hipermutabilidade e atrofia gonadal), sob condições de cultivo em temperaturas fisiológica e restritiva. Em machos de ambas as linhagens (exceto em uma delas, onde observou-se um indivíduo aneuplóide XO), e nos machos da primeira geração de cruzamento entre as duas populações, não foram observadas irregularidades meióticas nem aberrações cromossômicas, tanto sob temperatura fisiológica, quanto restritiva. Análise posterior da população híbrida, mantida em laboratório, entretanto, permitiu a detecção de quebras, de pontes anafásicas, e de figuras compatíveis com quiasmas no segundo par cromossômico No braço esquerdo do cromossomo II (o chamado IIL) nesta população híbrida, segregam três inversões, a IILF (sub-terminal) e as inversões IILD+E, (na região mediana). Analisando paralelamente as configurações dos cromossomos politênicos interfásicos das glândulas salivares larvais e os meióticos dos primórdios das gônadas de cada larva macho individualmente, observou-se que sempre que ocorreram pontes anafásicas, os indivíduos eram heterozigotos para pelo menos a inversão IILF, e que as quebras detectadas no segundo cromossomo ocorreram na região subterminal de um dos braços. Estes achados fazem supor que nestes machos, estaria havendo recombinação dentro da alça de inversão formada em heterozigotos para a inversão IILF, o que necessita ser testado através de dados genéticos, em estudos futuros. Em machos de uma população natural desta espécie, também observou-se figuras compatíveis com quiasmas na parte terminal do mesmo braço esquerdo do segundo cromossomo, onde segrega a inversão IILH. Já a meiose de machos de uma população de cada uma das espécies crípticas D. paulistorum, D. tropicalis, D. equinoxialis, D. insularis e da não críptica D. nebulosa, mostrou-se regular, não sendo encontradas evidências de não-disjunções, quebras e pontes… Advisors/Committee Members: Gaiesky, Vera Lucia da Silva Valente.

▼ O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da suplementação do meio com diferentes fontes de macromoléculas, com bloqueadores da meiose e com antioxidantes durante o transporte de oócitos bovinos por 6 horas sobre: 1) progressão da maturação nuclear; 2) maturação citoplasmática e 3) competência no desenvolvimento e criotolerância dos embriões produzidos. Para tanto, o meio de transporte de oócitos foi suplementado com bloqueadores da meiose (forscolina e IBMX; Experimento 1) ou com diferentes tipos de macromoléculas (SFB ou BSA; Experimento 2), sendo que estes tratamentos ainda receberam ou não a suplementação com antioxidantes (mistura de cisteína, cisteamina e catalase). Os oócitos foram incubados em incubadora portátil (Minitub®) para simulação de transporte. Posteriormente, foram submetidos à maturação in vitro (MIV) em incubadora a 5% de CO2 em ar até completar 24h e, em seguida, foram fecundados e os prováveis zigotos foram cultivados in vitro durante 7 dias. Foi feito um grupo controle adicional no experimento I: MIV em incubadora com 10% de SFB por 24h. No experimento II foram feitos dois grupos controle adicionais MIV em incubadora com 10% de SFB por 24h sem e com antioxidantes (cisteína, cisteamina e catalase). Nos experimentos 1 e 2 foi avaliada a cinética da maturação nuclear e a maturação citoplasmática (através do posicionamento de mitocôndrias, do potencial de membrana mitocondrial e do conteúdo intracelular de espécies reativas do oxigênio) após o transporte e após a MIV. Avaliou-se a taxa de clivagem (48 hpi) e de desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos (168 hpi) e re-expansão após 24 horas de re-cultivo. No experimento 1, a taxa de oócitos em GV foi maior nos oócitos (P<0,05) do grupo Transporte com bloqueador (37,9%) e menor no grupo Transporte sem bloqueador (10,1%), ambos estes grupos difeririam do grupo Controle (20,0%). Enquanto a taxa de GVBD foi maior (P<0,05) no grupo Transporte sem bloqueador (82,8%) e menor nos grupos Controle (77,0%) e Transporte com bloqueador (62,0%). Nos oócitos dos grupos tratados com antioxidantes, após 6h de transporte, a concentração intracelular de ROS foi maior (P<0,05) no grupo Transporte sem antioxidantes (1,5) e menor nos grupos Controle (1,0) e Transporte com antioxidantes (1,1). Com relação ao tratamento com bloqueadores, a contração de ROS foi maior (P<0,05) nos oócitos do grupo Transporte sem bloqueador (1,5) e menor nos grupos Controle (1,0) e Transporte com bloqueador (1,2). Após 24 horas de MIV houve interação entre os tratamentos (bloqueadores+antioxidantes), sendo que os oócitos dos grupos Transporte Pré-MIV com antioxidantes (1,0) e Controle (1,0) apresentaram a maior concentração de ROS (P<0,05), enquanto que os grupos Transporte controle (0,6) e Transporte Pré-MIV sem antioxidantes (0,5) exibiram as menores concentrações de ROS. Com relação ao potencial de membrana de mitocondrial (PMM), houve interação entre os tratamentos quando os oócitos foram valiados após 6 e 24 horas. Após 6 horas Transporte Pré-MIV sem antioxidantes… Advisors/Committee Members: Mingoti, Gisele Zoccal [UNESP], Universidade Estadual Paulista (UNESP).

▼ Introdução: O fuso meiótico dos oócitos de mamíferos pode se despolimerizar quando exposto a pequenas variações de temperatura. Este fato já está bem estabelecido e estudado em oócitos maduros em metáfase II (MII). No entanto, pouco se sabe a respeito da influência da diminuição da temperatura sobre o fuso meiótico dos oócitos imaturos. Desse modo, este estudo tem como objetivos: 1) avaliar a influência da diminuição da temperatura sobre o fuso meiótico de oócitos de camundongas maturados in vitro e 2) avaliar o fuso meiótico em oócitos humanos maturados in vitro submetidos à criopreservação pela técnica de congelação lenta ou por vitrificação quando em estágio de vesícula germinativa. Métodos: Realizaram-se dois experimentos, denominados 1 e 2, sendo o primeiro em oócitos de camundongas e o segundo em oócitos humanos. No experimento 1 oócitos imaturos de camundongas nos estágios de metáfase I (MI), telófase I(TI) e MII foram cultivados nas seguintes temperaturas: 37º C (controle), temperatura ambiente (22 °C) e 4º C por 0, 10, 30 e 60 minutos. Após este período de tempo o fuso meiótico oocitário foi avaliado por meio de microscopia de luz polarizada (MLP) (LC-Polscope-Oosight image software) e imunocitoquímica (IC). No experimento 2 oócitos em estágio de vesícula germinativa (GV) coletados de pacientes submetidas à indução da ovulação e fertilização in vitro, foram divididos de forma randômica em três grupos: oócitos a fresco (A), oócitos congelados pela técnica de congelação lenta (B) e oócitos congelados pela técnica de vitrificação (C). Os oócitos a fresco, os descongelados e os aquecidos foram maturados in vitro até estágio de (MII). A análise do fuso meiótico foi realizada por microscópio invertido equipado com uma câmera de vídeo analógica e um sistema de imagens que combina luz polarizada em cristal líquido (ICSI Guard Octax). Resultados: Experimento 1: No tempo 0 e à 37º C, todos os oócitos apresentavam o fuso meiótico visível tanto pela MLP quanto pela IC. À 4º C, o número de oócitos em MI com fuso meiótico visível por meio da MLP foi menor do que com a IC, e descresceu com o tempo, fato que também ocorreu, em menor proporção, com os oócitos em TI. No entanto, a 4º C, o reconhecimento do fuso meiótico dos oócitos em TI foi semelhante tanto para MLP como para IC. Quando os oócitos MII foram expostos à 4º C, a detecção do fuso meiótico teve descréscimo diretamente proporcional ao tempo de cultura quando foi utilizada a MLP, sendo que o mesmo ocorreu para a IC, porém de forma menos pronunciada. À temperatura ambiente houve um pequeno descéscimo na visualização do fuso meiótico tanto por MLP quanto por IC, porém este não foi estatisticamente significativo para os oócitos em TI. Experimento 2: A taxa de sobrevivência imediatamente após o descongelamento/ aquecimento foi de 44,6% para o grupo B e de 79% para o grupo C. Após 24 horas em cultura , estas taxas passaram para 29,2% e 69%, respectivamente. A mediana de tempo para maturação foi de 26 horas para os grupos A e C, e de 27 horas para o grupo B. Ao final da… Advisors/Committee Members: Baracat, Edmund Chada, Hassun Filho, Péricles Assad.

▼ 

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico gerado pela atividade da enzima óxido nítrico sintase (NOS) a qual foi detectada em vários órgãos incluído o sistema reprodutor. O sistema NOS/NO parece desempenhar papel importante na maturação oocitária entre outras funções. No entanto, apesar das evidências, há poucos estudos sobre o papel desse sistema em oócitos da espécie bovina. Sabe-se que o NO atua pela via da guanilato ciclase (GC) estimulando a produção do nucleotídeo GMPc, que por sua vez é capaz de influenciar os níveis de outro nucleotídeo, o AMPc, que é um importante elemento da via de sinalização das gonadotrofinas nos oócitos e no controle da maturação oocitária. O objetivo do presente estudo foi de investigar o envolvimento da via do GMPc na ação do sistema NOS/NO na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos e seu efeito sobre a via do AMPc. Com a maior concentração estudada do doador de NO (10-7M de SNAP), apenas 36% dos oócitos conseguiram alcançar o estágio de RVG (P< 0,05), após 9 horas de maturação. Esse atraso também foi observado com diferentes concentrações do estimulador de GC (5, 10 ou 50μM de Proptoporfirina IX) e pelo análogo de GMPc (1, 2 e 4mM de 8-Br-GMPc ), que apresentaram uma taxa média de RVG de 50% para os tratamentos e 70% para os grupos controles sem as drogas (P<0,05). No início da maturação (0h), os níveis de GMPc foram de 5,29 pmol/oócito sofrendo uma queda logo na primeira hora de cultivo para 2,97 pmol nos oócitos do grupo controle e 1,54 pmol nos cultivados com associação de 10-7M de SNAP (doador de NO) e 100μM de OQD (inibidor de GC (P<0,05). No grupo de oócitos cultivados apenas com SNAP, os níveis de GMPc se mantiveram em 4,51 pmol/oócito, semelhante ao grupo imaturo (0h de cultivo, P>0,05). O doador de NO manteve estável o nível de GMPc somente na primeira hora de maturação. Após 3 e 6 h de MIV, os níveis de GMPc permaneceram baixos e similares (0,07 a 2,46 pmol/oócito, P>0,05) nos grupos controle (sem drogas), tratado com doador de NO (10-7M de SNAP) associado ou não ao inibidor de guanilato ciclase (100μM de OQD). Também foi observada uma queda nos níveis de AMPc em relação ao grupo imaturo (32,42 fmol de AMPc/oócito) para os demais grupos (P<0,05), que apresentaram aproximadamente, 12,0 a 16,0 fmol de AMPc/oócito durante a primeira hora, 3,3 a 8,0 fmol/oócito durante a terceira hora e 7,4 a 18,3 durante a sexta hora de maturação (P>0,05). O NO afetou os níveis de GMPc no início da maturação, mas não os níveis de AMPc. O NO e o GMPc podem atuar no controle da expressão gênica de uma série de proteínas envolvidas no controles dos níveis de AMPc e GMPc ou suas funções. Esse controle pode ser efeito direto do NO (PKG2, PDE3A, PDE4D e PDE8A), do GMPc (ADCY6) ou do NO via GMPc (PKA1) e varia com o compartimento considerado (oócito ou células do cumulus). Esses resultados demonstraram a inter-relação das vias NO/GMPc/AMPc e toda a sua complexidade dependendo do tipo celular e da fase da maturação de oócitos bovinos.

The NOS/NO system seems to play an important…

Advisors/Committee Members: Leal, Cláudia Lima Verde.

▼ 

A famÃlia Fabaceae, terceira maior famÃlia de plantas com flores, com centros de diversidade nas regiÃes tropicais e subtropicais, à dividida em trÃs grandes grupos: Caesalpinioideae, Mimosoideae e Faboideae. Faboideae, considerada monofilÃtica, derivada de dentro da subfamÃlia Caesalpinioideae, inclui o gÃnero Crotalaria, sendo este importante na indÃstria de papel e celulose, na agricultura em sistemas de rotaÃÃo de culturas como fixadores de nitrogÃnio, na alimentaÃÃo animal, no controle biolÃgico de nematoides, na remoÃÃo de metais tÃxicos e na ornamentaÃÃo. Caesalpinioideae, considerada parafilÃtica, inclui os gÃneros Peltophorum, Cassia sensu stricto e Senna, com o Ãltimo tendo grande potencial medicinal, ornamental, produÃÃo de madeira e recuperaÃÃo de Ãreas degradadas. Os gÃneros Cassia sensu stricto, Senna Mill. e Chamaecrista Moench. compÃem o complexo gÃnero Cassia sensu lato. Cassia s.l. à considerado multibÃsico, tendo x = 7 como o nÃmero primÃrio bÃsico, responsÃvel pelo estabelecimento do nÃmero bÃsico secundÃrio x = 14, do qual x = 13 e 12 derivaram por aneuploidizaÃÃo. Para o gÃnero Crotalaria tÃm sido propostos x= 7 e x= 8, sendo ainda polÃmica a definiÃÃo do nÃmero bÃsico para o gÃnero. As relaÃÃes filogenÃticas que envolvem diferentes nÃveis taxonÃmicos da famÃlia Fabaceae ainda nÃo sÃo bem explicadas, necessitando de novos modelos baseados em informaÃÃes adicionais Ãs morfolÃgicas e Ãs moleculares. DescriÃÃo do nÃmero cromossÃmico, anÃlise do comportamento meiÃtico, viabilidade do grÃo de pÃlen e palinologia foram realizados em espÃcies das subfamÃlias Caesalpinioideae e Faboideae incidentes no Sul de Minas Gerais. Para o gÃnero Senna, a maioria das espÃcies analisadas apresentou comportamento meiÃtico regular, alto Ãndice meiÃtico e elevada viabilidade do grÃo de pÃlen. O nÃmero bÃsico do gÃnero Senna à discutido levando em conta a disploidia e a autopoliploidizaÃÃo no seu processo evolutivo. As espÃcies do gÃnero Crotalaria tiveram comportamento meiÃtico irregular, com anormalidades tÃpicas em cada uma delas, resultando em baixa viabilidade dos grÃos de pÃlen. Foi descrita variabilidade para caracterÃsticas polÃnicas, as quais foram usadas para anÃlise filogenÃtica, que revelou falta de consistÃncia no agrupamento do gÃnero Senna.

Fabaceae, the third largest family of flowering plants, has its centers of diversity in tropical and subtropical regions and is divided in three major groups: Caesalpinioideae, Mimosoideae and Faboideae. Faboideae, considered as monophyletic and derived from subfamily Caesalpinioideae, includes the genus Crotalaria. This genus is important in industry of paper and cellulose, in agriculture as nitrogen fixer, as animal feed and as biological control of nematodes, in heavy metal bioremediation and in landscaping. Caesalpinioideae considered paraphyletic, includes the genera Peltophorum, Cassia sensu stricto and Senna. The last one have great potential for medicinal, ornamental, wood and degraded areas restoration. The genera Cassia sensu stricto, Senna Mill. and…

Advisors/Committee Members: Aparecida CÃlia Paula dos Santos, Giovana Augusta Torres, Mateus Mondin.

▼ 

A strategy of the breeding programs of the elephant grass (Pennisetum purpureum 2n = 2x = 28), is the hybrid production between elephant grass and pearl millet (P. glaucum, 2n = 2x = 14), originating triploids hybrids and sterile, however presenting forage quality and providing the obtaining of cultivars superiors to intensify the dairy production. The sterility of triploid hybrid, due to impairing of the chromosomes in meiosis, constitutes a barrier to breeding programs, because it disables your propagation through seeds. Fertility can be restored by doubling the chromosomes. This made possible propagation through seeds. However, is common after doubling chromosome, the instability of the material due to the chromosome elimination. This work describes meiosis of ten hexaploids hybrid between elephant grass and pearl millet, being five from american origin and five national, aiming to assess the hybrid regarding the meiotic stability and pollen grain viability. The most frequent abnormalities were incorrect pairing during diakinesis, early ascension of chromosomes during metaphase, irregular segregation during anaphase and formation of micronucleus in telophase and in tetrads. Such abnormalities in the research compromise pollen fertility by generating aneuploids gametes, presenting low pollen viability rates so much for staining as germination in vitro. ParaÃso hybrid (commercial cultivar), in spite of present high rate of meiotic irregularities, presented 49.96% of viability for the staining tests and 86.17% for germination in vitro. The use of those hybrids in breeding programs of elephant grass is discussed.

Uma estratÃgia dos programas de melhoramento do capim-elefante (Pennisetum purpureum, 2n = 2x = 28) à a produÃÃo de hÃbridos entre o capim-elefante e milheto (P. glaucum, 2n = 2x = 14), originando hÃbridos triplÃides e estÃreis, porÃm apresentando qualidade forrageira e proporcionando a obtenÃÃo de cultivares superiores para intensificar a produÃÃo leiteira. A esterilidade do hÃbrido triplÃide, devido ao nÃo pareamento dos cromossomos na meiose, constitui uma barreira nos programas de melhoramento do capim-elefante, pois impossibilita sua propagaÃÃo via semente. A restauraÃÃo da fertilidade desses hÃbridos pode ser conseguida atravÃs da duplicaÃÃo cromossÃmica, propiciando sua propagaÃÃo via semente. Entretanto, à comum apÃs a duplicaÃÃo cromossÃmica, a instabilidade do material devido à eliminaÃÃo cromossÃmica. Neste trabalho, foi avaliada a meiose de dez hÃbridos hexaplÃides entre capim-elefante e milheto, sendo cinco de origem americana e cinco nacionais, objetivando avaliar os hÃbridos quanto à estabilidade meiÃtica e a viabilidade do grÃo de pÃlen. As anormalidades mais freqÃentes foram: pareamento irregular na diacinese, ascensÃo precoce de cromossomos na metÃfase, segregaÃÃo irregular na anÃfase e formaÃÃo de micronÃcleos na telÃfase e em tÃtrades. Tais anormalidades afetaram diretamente a fertilidade do pÃlen pela produÃÃo de gametas aneuplÃides, o que foi observado pelas baixas taxas de…

Advisors/Committee Members: Lisete Chamma Davide, Antonio Vander Pereira, Sandro Barbosa.

▼ O gênero Rhynchospora pertence a família Cyperaceae, a terceira maior família das monocotiledôneas. Rhynchospora apresenta cerca de 270 espécies organizadas em 27 seções, entre elas a seção Tenues a qual inclui de 17 a 20 espécies, sendo que 14 delas ocorrem no Brasil. Esta diferença observada no número de espécies descritas para a seção é devida principalmente ao complexo Rhynchospora tenuis, o qual pode englobar ou não R. tenuis subsp. austro-brasiliensis, R. enmanuelis, R. riparia e R. emaciata, de acordo com os critérios diagnósticos de cada taxonomista. Rhynchospora riparia e R. emaciata apresentam características marcantes que as distinguem de R. tenuis, sendo a maior confusão taxonômica, presente nas delimitações entre R. tenuis, R. tenuis subsp. austro-brasiliensis e R. enmanuelis. Estudos citogenéticos desenvolvidos em Rhynchospora mostraram que este, assim como a família Cyperaceae, apresenta cromossomos holocêntricos. A condição holocinética favorece a manutenção de variações cromossômicas numéricas associadas a eventos de disploidia. Embora, variações associadas a disploidia ocorram em Rhynchospora, a poliploidia é considerada como o principal mecanismo envolvido na evolução cariotípica do grupo. Neste estudo, amostras de R. tenuis, R. tenuis subsp. austro-brasiliensis, R. enmanuelis e de R. junciformis foram analisadas de modo comparativo, empregando análises morfológicas, citogenéticas e de marcadores moleculares (ISSR). As relações entre esses táxons foram discutidas baseadas no valor dos caracteres diagnósticos comumente empregados na identificação dessas espécies, buscando uma melhor resolução taxonômica para o complexo Rhynchospora tenuis. As medidas morfológicas obtidas para as espécies estudadas exibiram sobreposições nos valores para praticamente todos os caracteres avaliados. Contudo, a forma dos aquênios e dos estilopódios, o número de espiguetas terminais, o número cromossômico e a análise de marcadores ISSR, quando observados conjuntamente, mostraram-se úteis para propor uma nova relação entre estes quatro táxons da seção Tenues. Nas análises citogenéticas, R. tenuis apresentou 2n = 4, com dois sinais terminais de DNAr 45S enquanto que R. tenuis subsp. austro-brasiliensis, R. enmanuelis e R. junciformis apresentaram 2n = 18, com seis sinais terminais de DNAr 45S. A análise meiótica feita em R. tenuis subsp. austro-brasiliensis mostrou sete bivalentes e um tetravalente, sugerindo que a origem do número cromossômico 2n = 18 esteja envolvida com eventos de poliploidia associado a disploidia. Os dendogramas obtidos com os dados de ISSR mostraram Rhynchospora tenuis alocada separadamente de R. tenuis subsp. austro-brasiliensis e R. enmanuelis, as quais foram agrupadas em um mesmo ramo. Estas duas espécies apareceram mais próximas de R. junciformis do que de R. tenuis. O uso conjunto de análises morfológicas, citogenéticas e de genética molecular gerou resultados que apontaram para um novo caminho em direção à resolução de problemas taxonômicos relacionados à seção Tenues. Esses resultados… Advisors/Committee Members: André Luis Laforga Vanzela ., Andréa Beatriz Mendes Bonato, Lúcia Giuliano Caetano.

▼ 

The objectives of this study were: to determine the presence of prorenin and the receptor of (pro)renin [(P)RR] in cumulus cells (CC) and oocytes; evaluate the role of prorenin in the resumption of oocyte meiosis, ovulation and on levels of plasma progesterone (P4). The mRNA expression of prorenin and (P) RR was evaluated in oocytes and cumulus cells of the bovine species. The mRNA of prorenin and (P)RR was detected in CC, in oocytes only mRNA expression of (P)RR was found. The role of prorenin in the resumption of meiosis was determined from 3 experiments using a co-culture of cumulus-oocyte complex (COC) and follicular halves. In the first experiment, three different concentrations of prorenin (10-10, 10-9, and 10-8M) were tested, which stimulated the resumption of meiosis similar to the positive control and angiotensin II (Ang II). In experiment 2, the co-culture was supplemented with prorenin (10-10M) and aliskiren (direct inhibitor of renin, 10-3M, 10-5M and 10-7M). The aliskiren blocked the resumption of meiosis-induced by prorenin in all concentrations tested. The aliskiren (10-5M and 10-7M) was also evaluated in isolation in a culture system of COCs without follicular halves and the rate of oocytes that resumed meiosis was not different of the positive control. The third experiment was conducted to evaluate the stimulation of meiosis resumption by prorenin independent of Ang II using the combination of prorenin (10-10M) and saralasin [nonspecific Ang II receptor antagonist - Sar (10-5M)], which obtained a rate of oocytes at metaphase I (MI) similar to the positive control and treatments of AngII and prorenin. The prorenin also resumed the oocyte meiosis in a culture system of COCs suplemmented with forskolin, wicth blocks the meiosis by intracellular cAMP accumulation. To evaluate the regulation of (P)RR mRNA in the theca and granulosa cells by LH, cows who achieved follicular diameter ≥12mm after synchronization were submitted to the ovariectomy 0, 3, 6, 12 and 24 hours after GnRH analogue treatment. There was a higher mRNA expression of (P)RR in the theca cells at hour 6; and at hour 3 in the granulosa cells. The effect of (P)RR in ovulation and plasma P4 during luteinization was observed cows that were synchronized and induced by GnRH analogue (IM) associated for intrafollicular aliskiren (10-5M) or PBS (0hour/0day) and the ovulation was evaluated at 24, 48 and 72 hours by ultrasound, wicth was not different of the control (PBS). The leves of plasma P4 was analysed at day 6 and 8 after GnRH and intrafollicular treatment only in the cows that ovulated. The intrafollicular (P)RR blocks decreased plasma P4 at day 6. It was concluded that the prorenin / (P)RR participates in the peri-ovulatory period: in the resumption of oocyte meiosis independently of AngII, in the ovulation by LH stimulation to (P)RR mRNA and in the P4 synthesis during luteinization.

Os objetivos deste estudo foram: determinar a presença de prorenina e receptor de (pro)renina [(P)RR] nas células do cumulus (CC) e em oócitos;…

Advisors/Committee Members: Paulo Bayard Dias Goncalves, Rafael Gianella Mondadori, Fabio Vasconcellos Comim.

▼ 

O processo de retomada da meiose no oócito, bloqueada desde a vida fetal, e a expansão de compactas camadas de células do cumulus que o envolvem é desencadeado por mediadores intrafoliculares estimulados pelo LH, sendo eventos extremamente complexos. Em camundongos, dentre os componentes do sistema peptídeos natriuréticos (NP) somente o NP tipo C (CNP) apresenta função, bloqueando a retomada da meiose. Entretanto, em espécie monovular, o conhecimento sobre a ação dos NP, na maturação nuclear de oócitos e expansão do cumulus, é extremamente escasso. O objetivo do presente estudo foi caracterizar o sistema peptídeo natriurético, demonstrar sua função na retomada da meiose e expansão do cumulus, além de propor um novo modelo para estudo da expansão do cumulus. Inicialmente, demonstramos a presença de RNAm para ANP, CNP, receptor peptídeo natriurético 1 (NPR-1), NPR-2 e NPR-3 nas células do cumulus, sendo que no oócito somente foi detectado RNAm do NPR-2. Utilizando um modelo in vitro, no qual os oócitos permanecem bloqueados em vesícula germitava (VG) por ação do forskolin (100 μM), demonstramos que os ANP, BNP e CNP, isoladamente ou em associação, induzem o reinício da meiose após 12 h de maturação. Em outros experimentos, observamos que a concentração de 100 μM de forskolin inibiu, por 12 h, a expansão das células do cumulus estimulada por FSH e que o ANP, BNP e CNP revertem o efeito inibitório do forskolin sobre a expansão do cumulus. Dessa forma, demonstramos pela primeira vez a localização de RNAm para o sistema NP em CCOs. Além disso, foi demonstrado que em espécie monovuluar, utilizando o bovino como modelo animal, os peptídeos natriuréticos (ANP, BNP e CNP) apresentam função de mediadores intrafoliculares do LH, na qual estimulam a retomada da meiose e expansão do cumulus.

The process of meiotic resumption in oocytes, arrested since fetal life, and the expansion of compact layers of cumulus cells is triggered by intrafollicular mediators stimulated by LH. These events are extremely complex. In mice, among system components of natriuretic peptides (NP), only the C-type NP (CNP) has a role to inhibit the resumption of meiosis. However, little is know about the function of NPs on resumption of meiosis, nuclear maturation and cumulus expansion in monovular species. The aim of this study was to characterize the natriuretic peptide system, studing its role in the resumption of meiosis and cumulus expansion. We also proposed a new model to study cumulus expansion. Initially, we detected the presence of mRNA for the ANP, CNP, natriuretic peptide receptor 1 (NPR-1), NPR-2 and NPR-3 in the cumulus cells and NPR-2 mRNA in the oocyte. Using an in vitro model, in which the oocytes are arrested in germinal vesicle (VG) by the action of forskolin (100 μM), we demonstrated that ANP, BNP and CNP, alone or in combination, induce resumption of meiosis after 12 h of maturation. In another experiments, we observed that the concentration of 100 μM forskolin inhibited cumulus expansion stimulated by FSH for12 h,…

Advisors/Committee Members: Arnaldo Diniz Vieira, Fábio Gallas Leivas, Paulo Bayard Dias Goncalves.

▼ 

O presente trabalho teve por objetivo averiguar o papel do fator de crescimento fibroblástico 10 (FGF10) no reinício da meiose de oócitos bovinos, utilizando um modelo in vitro de co-cultivo de oócitos e células foliculares. Em um primeiro estudo, foi estabelecido um sistema de cultivo capaz de manter a osmolalidade dos meios constante na ausência de óleo. A adição de água entre os poços de placas de cultivo foi eficiente na prevenção da evaporação dos meios sendo uma alternativa na experimentação científica e produção in vitro de embriões. Com este sistema, se obteve uma taxa média de 30% de desenvolvimento embrionário, resultado similar ao obtido no sistema convencional (33% blastocistos). Após o estabelecimento do sistema, avaliou-se a participação do FGF10 no reinício da meiose de oócitos bovinos e sua interação com a maturação nuclear induzida por angiotensina II (AngII; 10-11M) e progesterona (100ng mL-1). Todas as concentrações de FGF10 testadas foram eficientes na inibição do reinício da meiose induzido por AngII (P ≤ 0,05). As maiores taxas de rompimento de vesícula germinativa (RVG) foram observadas na ausência de FGF10 (45,3%). Nas concentrações de 10, 100, e 1000ng mL-1 de FGF10, as taxas de RVG foram 30,2, 29,6 e 27%, respectivamente. Após o estabelecimento da dose ideal, foi verificado que a adição de FGF10 (100ng mL-1) ao cultivo de complexos cumulus-oócitos acarretou em diminuição na taxa de reinício da meiose somente na presença de células foliculares e AngII (37,8% e 62,6% de RVG com e sem FGF10, respectivamente; P ≤ 0,05). A partir dos resultados dos experimentos anteriores, o terceiro experimento foi delineado para testar se o FGF10 é capaz de inibir o reinício da divisão meiótica induzido por progesterona. A adição de FGF10 não afetou a taxa de reinício da meiose induzida pela progesterona (41,1% e 41,7% de RVG com e sem FGF10, respectivamente; P ≥ 0,05). Entretanto, a adição de indometacina (10μM) bloqueou (20,1% de RVG; P ≤ 0,05) o efeito positivo da progesterona. Este bloqueio demonstra que a progesterona, assim como já foi demonstrado para AngII, utiliza a via das ciclooxigenases para induzir o reinício da meiose e este evento parece não ser regulado pelo FGF10. Os resultados demonstram que o FGF10 interage com as células foliculares para inibir o reinício da meiose estimulado pela AngII mas não pela progesterona.

The aim of this study was to evaluate the effect of fibroblast growth factor 10 (FGF10) on bovine oocyte meiotic resumption in an in vitro oocyte and follicular cells co-culture system. At first, an oil-free culture system able to maintain a stable osmolality of the medium without the negative interference of the oil was established. The maintenance of osmotic equilibrium confirms that fourwell plate with water in the central hole can be a feasible alternative to replace oil for scientific experimentation and embryo culture. The embryo development rate in the alternative system (near 30% blastocyst) was similar to that obtained in the conventional…

Advisors/Committee Members: Paulo Bayard Dias Goncalves, Luís Fabiano Santos da Costa, João Francisco Coelho de Oliveira, Lígia Margareth Cantarelli Pegoraro.

▼ Cromossomos holocêntricos são caracterizados pela ausência de constrição primária e apresentam normalmente a proteína centromérica CENH3 distribuída ao longo de um eixo em cada cromátide. Embora muitos organismos com cromossomos monocêntricos apresentem sequências de DNA centroméricas específicas e associadas com a CENH3, nenhuma sequência centromérica havia sido identificada em organismos com cromossomos holocêntricos até o momento. Além disso, vários estudos reportam adaptações meióticas em espécies com cromossomos holocêntricos. Sendo observada em alguns casos uma inversão da ordem dos eventos meióticos (meiose invertida ou pós-reducional). Assim, o presente trabalho objetivou estudar a organização centromérica e a meiose de espécies com cromossomos holocêntricos do gênero Rhynchospora (Cyperaceae). Foi realizada uma análise citogenômica da organização e composição dos holocentrômeros de Rhynchospora pubera (2n = 10), sendo reportada a primeira descoberta de sequências centroméricas em espécies com cromossomos holocêntricos. Foi observado que os holocentrômeros de R. pubera são compostos principalmente por arranjos de DNA satélite (Tyba) e retroelementos centroméricos (CRRh) distribuídos pelo genoma. A análise detalhada da sucessão dos eventos meióticos de R. pubera e R. tenuis (2n = 4) reportou uma prófase inicial semelhante a de monocêntricos. No entanto, foi verificado que as cromátides-irmãs separam para polos opostos durante a anáfase I e os homólogos segregam somente durante a meiose II, comprovando uma meiose invertida para ambas as espécies. Curiosamente, durante a meiose de R. pubera foi observado uma organização diferencial dos centrômeros. Ao contrário do observado em mitose, durante meiose não foi observado a formação de holocentrômeros em forma de linha, sendo, na verdade, observado estruturas centroméricas aglomeradas. O restabelecimento de holocentrômeros em forma de linha se deu durante a primeira mitose do pólen. Advisors/Committee Members: PEDROSA-HARAND, Andrea (advisor), HOUBEN, Andreas (advisor).

▼ 

Meiose ist eine spezielle Form der Zellteilung die den diploiden Chromosomensatz auf einen haploiden reduziert. Zwei Kernteilungen folgen einer prämeiotischen DNA Replikation, so dass schließlich vier haploide Tochterzellen vorliegen. Während in der ersten meiotischen Teilung die Trennung der homologen Chromosomen erfolgt, werden in der zweiten meiotischen Teilung die Schwesterchromatiden getrennt. In der Meiose kommt es zum reziproken Austausch genetischer Information, ein Prozess der homologe Rekombination genannt wird. Spo11, ein verwandtes Protein der archeabakteriellen Topoisomeraseuntereinheit Top6A, leitet die HR durch die kontrollierte Einfügung von Doppelstrangbrüchen ein. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae sind die Proteine Mre11, Rad50, Xrs2 und Com1/Sae2 essentiell um diese Doppelstrangbrüche zu prozessieren und in weitere Folge, deren Reparatur zu ermöglichen. Die Arabidopsis thaliana Atcom1-1 Mutante ist steril. Darüber hinaus reichert sich AtSPO11-1 während der meiotischen Prophase I an. Das Fehlen von AtRAD51 in der Atcom1-1 Mutante deutet auf nicht reparierte Doppelstrangbrüche hin. Die für Atcom1-1 typische DNA Fragmentierung kann durch Mutation von AtSPO11-1 unterdrückt werden. In dieser Studie konnten wir interessanterweise eine Interaktion von AtCOM1 mit AtNBS1, einem Protein der DNA Reparaturmaschinerie, nachweisen. Nach erfolgter Prozessierung der Doppelstrangbrüche dient die einzelsträngige DNA (ssDNA) als Sonde zum Auffinden des homologen Partnerchromosoms. Für diesen entscheidenden Schritt der DNA Homologiesuche sind mehrere Proteine nötig. Unter anderem wurde Mnd1 als eines für den Strangaustausch essentielles Protein identifiziert. Das homologe Protein in Arabidopsis, AtMND1, ist, gemeinsam mit AHP2, dem Homologen von Hop2 der Hefe, wichtig für die Meiose. Weitere Proteine, wie die RecA Homologen DMC1, RAD51 und XRCC3 sind essentiell für den korrekten Austausch des genetischen Materials. Über das Zusammenspiel dieser Proteine ist bis jetzt wenig bekannt. Das Fehlen von AtMND1 verursacht schwere DNA Fragmentierung. Eine Akkumulierung von AtRAD51, wie auch von AtDMC1 kann in der Atmnd1 Mutante beobachtet werden. Dies ist auf nicht reparierte DSB zurückzuführen. Immunolokalisationsstudien zeigen die funktionellen Unterschiede von AtRAD51 and AtXRCC3 während der Meiose auf. AtXRCC3 ist für die Nukleoproteinfilamentbildung des AtDMC1 Proteins in einer Atmnd1 Mutante entbehrlich, während AtXRCC3 unverzichtbar für eine effiziente Anlagerung von AtRAD51 an die prozessierten ssDNA Enden ist.

Meiosis is a specialized nuclear division characteristic for sexually reproducing eukaryotes. Each diploid progenitor generates four genetically different haploid cells proceeding through two successive nuclear divisions that follow a single round of genome replication. This process relies on meiotic homologous recombination (HR) that establishes a physical connection between pairs of homologs and allows the correct alignment of bivalents. Moreover, genetic…

▼ 

La grand majorité des espèces forment très peu de crossovers (CO) par chromosome en méiose, et ce quelle que soit la taille des chromosomes et en dépit de l'excès de précurseurs de recombinaison disponibles. Les mécanismes qui sous-tendent cette limitation restent, pour une grande part, inconnus. Pour identifier des facteurs limitant la formation des CO en méiose, nous avons mis en place un crible permettant d'isoler des mutants formant plus de CO que le sauvage. Chez Arabidopsis thaliana, les mutants présentant un défaut de CO (ex: les mutants zmm) présentent une réduction de fertilité directement observable sur la longueur des fruits. Notre crible repose sur l'idée qu'une mutation augmentant la formation des CO devrait restaurer la fertilité des mutants zmm.Le premier suppresseur identifié nous a permis de montrer que FANCM est un régulateur majeur de la formation des CO méiotiques, en limitant la voie dépendante de MUS81, normalement minoritaire chez Arabidopsis (Crismani et al., 2012). Nous avons ensuite montré que deux des cofacteurs de FANCM au sein de la voie de l'anémie de Fanconi (FA), MHF1 et MHF2, agissent dans la même voie pour limiter les CO. En dehors de ces trois protéines, les autres protéines FA ne sont pas des protéines anti-CO (Girard et al., 2014).Nous avons ensuite identifié FIDGETIN-Like-1 comme une protéine anti-CO agissant en parallèle de FANCM. En effet, si les deux mutations figl1 et fancm alimentent la voie dépendante de MUS81 de formation des CO, leurs effets sont cumulatifs et mènent à une augmentation d'un facteur 6 du nombre CO par méiose, et ce sans affecter la ségrégation des chromosomes. Ce résultat montre que FIGL1 et FANCM agissent à deux étapes indépendantes de la recombinaison, et nos données suggèrent que FIGL1 pourrait agir en amont de FANCM.Ce travail a révélé l'existence d'au moins deux mécanismes de limitation des CO méiotiques, et montre que la fréquence de CO peut être largement augmentée sans que la ségrégation des chromosomes ne soit affectée.

Most species only few meiotic crossovers (COs) per chromosome irrespective of their physical size and despite an excess of recombination precursors. However, the underlying mechanisms constraining CO frequency remain largely unknown. In order to find factors limiting meiotic COs, we performed a genetic screen to find mutants with increased CO frequency. CO-deficient mutants (e.g. zmm) of Arabidopsis thaliana display reduced fertility, easily noticeable by their obvious reduction in fruit length. We designed a screen based on the idea that mutations that increase CO frequency will restore the fertility of the zmm mutants.We showed first identified FANCM as a major anti-CO protein limiting MUS81-dependent COs, a normally minor pathway in Arabidopsis (Crismani et al., 2012). We then showed that two of FANCM's cofactors from the Fanconi anemia pathway of DNA repair, namely MHF1 and MHF2, act along FANCM to limit meiotic crossovers, whereas the other Fanconi proteins do not (Girard:2014).Another mutant revealed FIDGETIN-Like-1…

Advisors/Committee Members: Mercier, Raphaël (thesis director).

▼ 

Cohesin ist ein konservierter Proteinkomplex mit Funktionen bei der Chromosomensegregation, Genomorganisation, DNA Reparatur und Genregulation. Dieser Komplex besteht aus Smc1, Smc3, einem α-Kleisin und einer HEAT-Repeat Untereinheit. Bei den meisten Eukaryoten bilden unterschiedliche Untereinheiten unterschiedliche Varianten des Komplexes mit spezifischen Funktionen, jedoch nur eine Variante findet sich beim Protisten Tetrahymena thermophila. Tetrahymena hat zwei Genome: einen transkriptorisch inaktiven Keimbahn-Kern, welcher Mitosen und Meiose durchführt, und einen aktiven Soma-Kern; Cohesin wurde nur im Keimbahn-Kern gefunden. Um zu verstehen, wie ein Organismus mit einem einzigen Cohesin-Komplex auskommt, untersuchten wir die Interaktionspartner und post-transkriptionelle Modifikationen, die die Funktionen von Cohesin regulieren. Wir zeigen, dass ein vermutliches Homologes des HEAT-Repeat Proteins Scc3 mit allen bisher bekannten Cohesin-Untereinheiten interagieren kann. Der Entzug von Scc3 durch RNA-Interferenz zeigte, dass Scc3 für die Reparatur von meiotischen DNA Doppelstrangbrüchen (DSBs), die Phosphorylierung des Kleisins Rec8, und die Chromatin-Assoziation von Smc1 und Rec8 nötig ist. Weiters untersuchten wir ein Homologes von Scc2, welches bei anderen Organismen Teil des Scc2/Scc4 Cohesin Lade-Komplexes ist. Der Entzug von Scc2 enthüllte seine essentielle Rolle bei der mitotischen Chromosomensegregation, der meiotischen Teilung und der DSB Reparatur. Obwohl Tetrahymena Scc2 mit Scc3 und Rec8 interagiert, ist es nicht für ihre Assoziation mit Chromatin nötig, daher mag es eine andere Bedeutung für die Funktion des Cohesins haben. Schließlich haben wir zahlreiche post-transkriptionell modifizierte Reste an verschiedenen Cohesin-Untereinheiten gefunden. Um die Effekte reduzierter Cohesin SUMOylierung zu untersuchen, fusionierten wir die katalytische Domäne der SUMO Isopeptidase Ulp1 mit Rec8. Zellen mit dem Fusionsprotein zeigten meiotische Defekte und verminderte Chromatin-Assoziation von Rec8 bzw. Cohesin. Zusammenfassend zeigt dieser Beitrag die zahlreichen Unterschiede zwischen dem minimalistischen Cohesin Apparat des evolutionär weit entfernten Modellorganismus Tetrahymena und dem der traditionell studierten Organismen auf.

Cohesin is a conserved protein complex required for chromosome segregation, genome organization, DNA repair, and gene regulation. The complex consists of Smc1, Smc3, an a-kleisin and a HEAT repeat subunit. Most eukaryotes have different variants of cohesin subunits that form specific complexes to perform distinct functions. However, only a single cohesin complex is used in the protist Tetrahymena thermophila. Tetrahymena has two genomes: a transcriptionally silent germline nucleus and a transcriptionally active somatic nucleus. Cohesin has been detected only in the germline nucleus, which undergoes mitosis and meiosis. To understand how a single cohesin complex is able to function in different cellular processes, we investigated the interaction partners and post-translational…

▼ 

Foram realizados estudos citogenéticos mitóticos e meióticos das espécies: Symphysodon aequifasciatus do rio Manacapuru- Manacapuru (AM) e Symphysodon discus do rio Negro- Novo Airão (AM). Todos os indivíduos apresentaram número diplóide igual a 60 cromossomos e não foram verificados cromossomos heteromórficos com características indicativas de cromossomos sexuais nas espécies analisadas. Em relação à fórmula cromossômica, S. aequifasciatus mostrou 46 M-SM + 14 microcromossomos e S. discus 50 M-SM + 10ST-A. Porém, alguns indivíduos de S. aequifasciatus exibiram constrições secundárias que não se coravam com Giemsa, parecendo haver uma variabilidade cariotípica. Quanto à heterocromatina constitutiva, ambas as espécies exibiram grandes blocos pericentroméricos em quase todos os cromossomos do complemento, porém, somente S. aequifasciatus apresentou seis pares cromossômicos inteiramente heterocromáticos. Com relação às regiões organizadoras de nucléolo, ambas as espécies evidenciaram RON múltiplas, contudo, sítios ribossomais foram detectados nos pares cromossômicos 4, 5, 11 e 21 em S. aequifasciatus e nos pares 17 e 23 em S. discus, porém nunca mais que dois sítios estiveram ativos. Na meiose, a diferença mais marcante encontrada entre as duas espécies foi durante o diplóteno/diacinese, visto que S. aequifasciatus apresentou, além de 20 bivalentes, uma cadeia envolvendo 20 cromossomos e S. discus apenas 30 bivalentes. Assim, 2n=60 cromossomos em ambas as espécies e a presença de cadeia cromossômica na meiose de S. aequifasciatus podem ser explicados por uma origem poliplóide para as duas espécies do gênero Symphysodon, uma vez que o número ancestral para a família Cichlidae é 2n=48 cromossomos, a maioria do tipo acrocêntrico. A cadeia cromossômica, encontrada apenas em S. aequifasciatus, pode indicar que esta se encontra em um período transiente, enquanto S. discus já teria terminado a sua diploidização, provavelmente por ser mais antiga que a primeira.

Meiotic and mitotic cytogenetics studies were carried out on species: Symphysodon aequifasciatus collected from the Manacapuru River- Manacapuru (AM) and Symphysodon discus from the Negro River- Novo Airão (AM). All individuals showed a modal number of 2n=60 chromosomes and there was no sex chromosomal heteromorphism in these species. Regarding the chromosomal formulae, S. aequifasciatus showed 46 M-SM + 14 microchromosomes and S. discus 50 M-SM + 10ST-A. However, some S. aequifasciatus individuals showed a Giemsa non-stained secondary constriction, looking like a chromosomal polymorphism. The constitutive heterochromatin was seen as large pericentromeric blocks on most chromosomes, of both species, however only S. aequifasciatus showed six wholly heterochromatic pairs. Multiple nucleolus organizing regions were identified in both species, S. aequifasciatus presented ribosomal sites on chromosomal pairs 4, 5, 11 and 21, and S. discus on the pairs 17 and 23, but never more than two sites showed to be active. In the meiosis, the greater difference observed between the…

Advisors/Committee Members: Feldberg, Eliana, Cella, Doralice Maria, Almeida, Mara Cristina de, Farias, Izeni Pires, Bertollo, Luiz Antonio Carlos.

▼ 

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico detectado em vários tipos celulares como células endoteliais, neurônios e macrófagos, desempenhando também funções variadas como vasodilatação, neurotransmissão e indução de morte celular. O NO é gerado pela atividade da enzima óxido nítrico sintase (NOS), a qual foi detectada em vários órgãos incluindo o sistema reprodutor. O sistema NOS/NO parece desempenhar papel importante na maturação oocitária entre outras funções. No entanto, apesar das evidências, há poucos estudos sobre o possível papel desse sistema em oócitos da espécie bovina. O presente estudo teve por objetivo investigar a importância do sistema NOS/NO na maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos. Para isso, foram avaliados os efeitos da inibição da NOS durante a MIV na presença de concentrações crescentes do inibidor de NOS (L-NAME, 0-1mM) e do aumento do NO durante a MIV na presença de concentrações crescentes do doador de NO (SNAP, 0-1mM) sobre a taxa de maturação (metáfase II) e formação de blastocistos após a fecundação in vitro. Também foi avaliado o efeito da pré-maturação com butirolactona (10µM BLI), seguida de MIV, na presença ou não de doador ou inibidor de NO em cada fase de cultivo, sobre o desenvolvimento de blastocistos. Após 22h de MIV os grupos tratados com L-NAME apresentaram uma taxa de metáfase II (MII) inferior (~80%, P<0,05) ao controle (95,5%). A taxa de blastocisto foi similar entre os grupos (34 a 41,5%, P>0,05). Apenas 7,2% (P<0,05) dos oócitos maturados com a maior concentração de SNAP (10-3M), atingiram o estádio de MII. Os demais tratamentos (71,6; 72,4 e 54,8% para controle, 10-7 e 10-5M, respectivamente) não diferiram entre si (P>0,05). Altos níveis de SNAP (10-3M) bloquearam o desenvolvimento embrionário, enquanto os demais tratamentos apresentaram cerca de 38% de blastocistos (P>0,05). As taxas de blastocistos (26,3 a 34,1%) e de eclosão (14,8 a 22,0%) adicionando ou não L-NAME em baixa concentração (10-7M) durante a pré-maturação, a maturação ou ambas as fases foram similares (P>0,05). Também não houve diferença (P>0,05) na taxa de blastocistos (25,5 a 39,7%) com a adição ou não de baixa concentração de SNAP (10-7M) durante a pré-maturação, a maturação ou ambas as fases. O grupo com SNAP (10-7M) na pré-maturação e MIV superou a taxa de eclosão (27,5%, P<0,05) dos demais grupos que tiveram SNAP adicionado somente no bloqueio, na MIV ou sem adição de SNAP (14,2 a 18,6 %, P>0,05). Esses resultados exibiram o duplo efeito do NO sobre oócitos bovinos, que tiveram a maturação reduzida com a inibição da síntese de NO e a maturação nuclear e citoplasmática bloqueadas pelo excesso de NO.

Nitric oxide (NO) is a chemical messenger detected in several cell types such as endothelial cells, neurons and macrophages, performing also varied functions as vasodilatation, neurotransmission and induction of cell death. NO is generated by the activity of the enzyme nitric oxide synthase (NOS), which has been detected in several organs including the reproductive system. The NOS/NO system seems…

Advisors/Committee Members: Leal, Cláudia Lima Verde.

▼ 

O arsênio inorgânico, um contaminante ambiental, produz uma série de respostas de estresse em células de mamíferos, incluindo o comprometimento da função mitocondrial, acompanhado por inibição do crescimento celular e carcinogênese. Como previamente identificamos efeitos deletérios do comprometimento da função mitocondrial e dos radicais livres do oxigênio na oogênese, investigamos os efeitos do arsenito na meiose, no desenvolvimento embrionário pré-implantação e na apoptose embrionária em camundongos. Camundongas com 6 semanas de idade foram tratadas com baixa (0,16 mg) ou média dose de arsenito (0,32 mg), por meio de 7 injeções intraperitoneais, 1 a cada 2 dias, durante 14 dias. Os controles foram injetados com solvente. A incidência de anomalias meióticas, caracterizadas por anormalidades do fuso celular e/ou mal alinhamento cromossômico, foi significantemente aumentada tanto nos oócitos in vivo ovulados, como nos in vitro maturados, oriundos dos animais tratados com arsenito. Foram detectadas reduções significativas das taxas de clivagem (24 horas de cultivo), de formação de mórula (72 h) e de desenvolvimento para blastocisto (96 h), nos embriões dos grupos tratados com arsenito. Apesar do número total de núcleos não ter diferido significativamente entre os blastocistos dos grupos controle e de tratamento, a percentagem de núcleos apoptóticos foi significantivamente maior nos blastocistos derivados dos animais tratados com a dose média de arsenito. Estes dados sugerem que o arsenito causa aberrações meióticas, que podem contribuir tanto para o comprometimento do desenvolvimento embrionário pré-implantação, como para a apoptose embrionária.

Inorganic arsenic, an environmental contaminant, produces a variety of stress responses in mammalian cells, including mitochondrial uncoupling accompanied by growth inhibition and carcinogenesis. Because previously we identified detrimental effects of mitochondrial uncoupling, and reactive oxygen species (ROS) on oogenesis, we investigated effects of arsenite on meiosis, early embryo development, and apoptosis in mice. Six-week-old CD-1 mice were treated with either low (0.16mg) or medium (0.32mg) doses of arsenite every two days by 7 intraperitoneal injections for 14 days, and controls were injected with solvent. The incidence of meiotic anomalies, characterized by spindle disruption and/or chromosomal misalignment or spreading, was significantly increased in both in vivo and in vitro treated oocytes. Further, we found a significant decrease in cleavage rates at 24h, morula formation at 72h, and development to blastocyst at 96h in treated groups. Although the total number of nuclei in developed blastocysts did not significantly differ between the treated and control groups, the percentage of apoptotic nuclei was significantly increased in blastocysts derived from the medium dose treated group. These data suggest that arsenite causes meiotic aberrations, which may contribute to decreased cleavage and preimplantation development, as well as increased apoptosis.

Advisors/Committee Members: Ferriani, Rui Alberto.