▼ Neutropenia febril é uma complicaçã<em class="hilite">oem> infecciosa frequente em oncologia clínica, no entanto, só consegue-se isolar <em class="hilite">oem> agente etiológico, causador da infecçã<em class="hilite">oem>, em 20 a 30% dos casos, desses, apenas 5 % deve-se a infecçã<em class="hilite">oem> fúngica invasiva. Essa infecçã<em class="hilite">oem> é a principal causa de letalidade em neutropênicos febris. <em class="hilite">Oem> isolamento de fungos por hemocultura é um processo demorado e nem sempre viável. Dessa forma, na prática clínica, utiliza-se critérios clínicos, radiológicos e a presença de fatores de risco para definir-se doença fúngica invasiva (DFI) e iniciar antifúngicos. Objetivo: Avaliar a frequência de fungemia e sua etiologia em pacientes onco-hematológicos com episódios de neutropenia febril utilizando-se de hemocultura e multiplex PCR (MT-PCR) panfúngica no Hemocentro de Pernambuco (HEMOPE) e descrever as características oncológicas e os fatores de risco dos pacientes. Método: Estudo descritivo, do tipo série de casos, avaliando os resultados de hemocultura e MT-PCR após coleta de sangue durante episódios de neutropenia febril em pacientes onco-hematológicos, no período entre fevereiro e novembro de 2010. Neutropenia febril foi definida conforme critérios da IDSA 2010, considerando-se neutropenia um número de neutrófilos < 500/mm3 ou entre 500 a 1000/mm3 com tendência a declínio. Febre foi definida por uma mensuraçã<em class="hilite">oem> maior ou igual a 37,8°C ou maior ou igual a 37,5°C por mais de uma hora. Novo episódio de neutropenia febril foi determinado por reinício da febre após um período de 72 horas afebril. DFI foi definida como comprovada, provável ou possível de acordo com <em class="hilite">oem> EORTC-MSG, no dia da coleta da amostra de sangue para realizaçã<em class="hilite">oem> da MT-PCR. Para avaliaçã<em class="hilite">oem> estatística utilizou-se <em class="hilite">oem> programa SPSS versã<em class="hilite">oem> 13, com a qual obteve-se a análise descritiva dos dados. Resultados: Foram constatados 74 episódios de neutropenia febril em 44 pacientes portadores de doença onco-hematológica, com e sem critérios para doença fúngica invasiva. A hemocultura foi positiva em dois episódios de doença fúngica comprovada, decorrentes de Candida parapsilosis e tropicalis, enquanto a MT-PCR foi positiva em um dos episódios. Ocorreram ainda mais 16 casos com critérios clínicos para infecçã<em class="hilite">oem> fúngica, (3 prováveis e 13 possíveis) com a MT-PCR identificando fungemia em 12. Entre os 50 episódios negativos para critérios de DFI, a MT-PCR foi positiva em 20 (40%). A PCR conseguiu registrar quarenta e duas infecções fúngicas através da presença de ITS positivo na reaçã<em class="hilite">oem>, com a determinaçã<em class="hilite">oem> por MT-PCR de vinte e três espécies em 21 análises (duas PCRs identificaram duas espécies de fungo no mesmo episódio), assim distribuídos: C. parapsilosis 10 (43,5%), Cryptococcus neoformans 6 (26,1%), C. glabrata 4 (17,4%), C. tropicalis 2 (8,7%) e C. albicans 1(4,3%). Em 11 (61,2%) episódios de DFI os pacientes apresentavam leucemia mielóide aguda (LMA) como doença oncológica. A mediana de dias de neutropenia foi de 9, 20 e 20, para DFI comprovada, provável e possível, respectivamente. Conclusã<em class="hilite">oem>: A utilizaçã<em class="hilite">oem> da MT-PCR associada a… <em>Advisors/Committee Members: SILVEIRA, Vera Magalhães da (advisor).em>

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<em class="hilite">Oem> papel dualístico exercido por Enterococcus na natureza estimula a pesquisa dos fatores que determinam sua virulência. <em class="hilite">Oem> objetivo desse estudo foi investigar a distribuiçã<em class="hilite">oem> de genes envolvidos com fatores de virulência entre isolados de Enterococcus e sua correlaçã<em class="hilite">oem> com a capacidade de formaçã<em class="hilite">oem> de biofilme e confirmar a identificaçã<em class="hilite">oem> de E. casseliflavus e E. gallinarum por PCRRFLP. Foram analisados 66 isolados clínicos e 70 alimentares quanto a presença dos genes gelE, esp, agg, ace e cylA por PCR e atividade de gelatinase e citolisina. Isolados clínicos apresentaram maior incidência de fatores de virulência quando comparados com alimentares, exceto para os genes gelE e ace. Em ambas amostragens houve a ocorrência de isolados positivos para os genes gelE e cylA, porém sem atividade enzimática, indicando a presença de genes silenciosos. A maioria dos isolados apresentou capacidade de formaçã<em class="hilite">oem> de biofilme, entretanto nã<em class="hilite">oem> houve uma correlaçã<em class="hilite">oem> entre os genes analisados e <em class="hilite">oem> fenótipo de formaçã<em class="hilite">oem> de biofilme, porém é possível que <em class="hilite">oem> gene ace e gelE atuem como potencializadores na formaçã<em class="hilite">oem> de biofilmes em Enterococcus. Para testar a técnica de PCR-RFLP, 32 e 20 isolados de E. gallinarum e E. casseliflavus, respectivamente, identifcados bioquimicamente foram avaliados. <em class="hilite">Oem> fragmento de 661 bp correspondente a uma regiã<em class="hilite">oem> conservada do 16S rDNA foi clivado com HinfI e 47% E. gallinarum e 25% E. casseliflavus apresentaram fragmentos de 589bp e 72bp, padrã<em class="hilite">oem> esperado para <em class="hilite">oem> PCR-RFLP. Assim sendo, a PCR-RFLP mostrou ser uma ferramenta molecular útil na confirmaçã<em class="hilite">oem> das espécies E. casseliflavus e E. gallinarum.

The dualistic role played by enterococci in the nature, encourages the study of virulence factors. The aim of this study was to investigate the distribution of genes involved in virulence among Enterococcus isolates and to correlate with biofilm formation ability and to confirm the identification of Enterococcus gallinarum and Enterococcus casseliflavus isolated from clinical and food samples by PCR-RFLP. Sixty six clinical and 70 food isolates were analyzed for the presence of gelE, esp, agg, ace and cylA genes by PCR and the gelatinase and cytolysin activities. Clinical isolates showed a higher incidence of virulence factors when compared to food isolates, except for gelE and ace genes. In both samples was observed the occurrence of isolates positive for gelE and cylA genes, but with no enzymatic activities, indicating the presence of silent genes. Most isolates showed ability to form biofilm, although there was no correlation between the presence of the genes and the phenotype of biofilm formation, but it is possible that ace and gelE genes perform as enhancers in biofilm formation in Enterococcus. To test the PCR-RFLP tecnhique, 32 and 20 strains identified by conventional biochemical exams as E. casseliflavus E. gallinarum, respectively, were were submitted to PCR amplification and digested with HinfI.. The DNA fragment of 661 bp corresponding to a conserved region of 16S rDNA was cleaved with HinfI and 47% and 25% of…

<em>Advisors/Committee Members: Frazzon, Ana Paula Guedes.em>

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Realizaram-se estudos de casos de mionecroses causados por Clostridium chauvoei, Clostridium septicum e Clostridium sordelli, utilizando diferentes métodos laboratoriais. Fez-se estudo retrospectivo, empregando <em class="hilite">oem> complexo imunoenzimático estreptavidina-biotina peroxidase, em amostras clínicas parafinizadas de 33 casos de bovinos e suinos com suspeita clínica de mionecroses. padronizou-se uma técnica de PCR multiplex para detecçã<em class="hilite">oem> de C. chauvoei e C.septicum e, realizaram-se sequenciamento e análise filogenética de cinco isolados de campo e quatro sementes vacinais de C. septicum. No estudo retrospectivo, detectaram-se: C. Chauvoei, C. septicum, C.chauvoei mais Clostridium novyi tipo A e C. chauvoei mais C. sordellii em 21. oito, doi, um e um casos, respectivamente. A técnica de PCR multiplex amplificou eficientemente sequencias gênicas de C. chauvoei e C. septicum, apresentando sensibilidade de 45pg/uL e 30pg/uL, respectivamente. Nã<em class="hilite">oem> foram observadas reações cruzadas com outras espécies de clostridios, outras espécies bacterianas e, entre ambos os agentes. Pelo sequenciamento e análise filogenética, observou-se a existência de dois diferentes grupos de C. septicum.

A study of natural cases of myonecroses by Clostridium chauvoei, Clostridium septicum and Clostridium sordellii was performed. In addition, a retrospective study employing the streptavidin-biotin peroxidase technique was made on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues of 33 field cases from cattle and swine suspected of myonecrosis. A multiplex PCR tecnique for detection of C. chauvoei and C. septicum was standardized, and sequencing and phylogenetic analyses of five isolates and four vaccine strains of C. septicum was made. The results of the retrospective study revealed the presence of C. chauvoei, C. septicum, C. chauvoei plus C. septicum, C. chauvoei plus Clostridium novyi type A and C. chauvoei plus C. sordelli in 21, eight, two one and one cases, respectively. The multiplex PCR technique showed to be efficient for amplifyng genomic sequences of C. chauvoei and C. septicum isolates presenting a sensitivity of 45pg/uL, respectively. No cross reactions were observed toi other Clostridia, other bacterial species or between both agents. By the sequencing and phylogenetic analyses, the existence of two different genotypic groups of C. septicum was determined.

<em>Advisors/Committee Members: Francisco Carlos Faria Lobato, Francisco Alejandro Uzal, Francisco Carlos Faria Lobato, Vera Lucia Viegas de Abreu, Romulo Cerqueira Leite, Maurilio Andrade Rocha, Luiz Guilherme Dias Heneine.em>

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Esta pesqusisa teve como objetivo demonstrar a expressã<em class="hilite">oem> diferencial do fator tecidual (FT) em tumor de Wilms (TW), através de um estudo do tipo transversal. <em class="hilite">Oem> TW é a neoplasia renal maligna mais comum na infância. Os estudos sobre angiogênese em neoplasias malignas pediátricas apresentam possíveis vias de terapias antiangiogênicas, com menor agressividade e melhor especificidade tumoral. E, entre os fatores angiogênicos possíveis, foi estudo <em class="hilite">oem> Fator Tecidual (FT), proteína transmebrana com sua principal funçã<em class="hilite">oem> no processo de hemostasia, mas que demonstra ter importante papel nos processos patológicos de tumorigênese, angiogênese e microambiente tumoral favorável à disseminaçã<em class="hilite">oem> neoplásica. Sua expressã<em class="hilite">oem> vem sendo associada às metástases e piora no prognóstico. Contuto, só a partir da pesquisa de Maciel et al (1) que a associaçã<em class="hilite">oem> do FT com TW foi observada, onde se encontrou, utilizando imunoistoquímica, a correlaçã<em class="hilite">oem> positiva entre a expressã<em class="hilite">oem> do FT, recidiva tumoral e óbito. Entã<em class="hilite">oem>, a partir desses dados iniciais, a presente pesquisa analisou uma amostra com 27 espécimes fixadas em parafina de TW e 26 controles (á<em class="hilite">reaem> sem TW), para demonstrar a expressã<em class="hilite">oem> diferencial do FT em TW, através da técnica de quantificaçã<em class="hilite">oem> de ácidos nucléicos (RNAm) por Reaçã<em class="hilite">oem> Cadeia de DNA Polimerase em Tempo Real (RT-PCR), avaliar a expressã<em class="hilite">oem> do FT em diferentes componentes tumorais, com a densidade microvascular (DMV) do TW e a ocorrência de metástases. Foi observado aumento da expressã<em class="hilite">oem> diferencial do FT no TW, sua maior variaçã<em class="hilite">oem> do FT foi encontrada nos componentes blastematoso e epitelial, enquanto no componente estromal apresentou variaçã<em class="hilite">oem> mínima em relaçã<em class="hilite">oem> ao tecido nã<em class="hilite">oem> tumoral, em lesões metastáticas <em class="hilite">oem> FT se mostrou significativamente mais elevado, sugerindo um papel importante para essa proteína no processo de disseminaçã<em class="hilite">oem> dessas células malignas, <em class="hilite">oem> aumento da DMV apresentou associaçã<em class="hilite">oem> positiva com a expressã<em class="hilite">oem> do FT. Os resultados apresentados corroboram os achados de Maciel et al (1) de forma mais concisa e quantitativa, enfatizando a importância do FT na biologia do TW

The Wilms Tumors (WT) is the most frequent renal tumors of children, and although curable, fatal outcomes may occur. A number a genetic alterations have been suggested as associated factors but still, the exact pathogenesis of WT remains to be fully characterized. Tissue factor (TF) is a glycoprotein which happens to be a key receptor for factor VII/VIIa and is the primary initiator of blood coagulation. Also important, TF has been associated with processes that lead to angiogenesis. It is widely expressed among cells and tissues and recent evidences pointed out an important role for TF in cancer progression and metastasis. Recent evidences suggested that TF may have a role in WT since its immunodetection was associated with poor prognosis. In the present investigation the differential expression of TF was assessed in WT using real-time PCR of RNA retrieved from paraffin sections using microdissection. Different histological components of WT - (blastema, epithelial…

<em>Advisors/Committee Members: Vinícius Duval da Silva.em>

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<em class="hilite">Oem> silenciamento de RNA refere-se a uma série de processos nucleares e citoplasmáticos envolvidos na regulaçã<em class="hilite">oem> da expressã<em class="hilite">oem> gênica pós-transcricional ou silenciamento pós-transcricional (PTGS), degradando ou silenciando seqüências específicas de mRNA. <em class="hilite">Oem> mecanismo é conservado em animais incluindo alguns pontos distintos e vários pontos coincidentes, envolvidos tanto no silenciamento de pequenos RNAs por via endógena quanto por via exógena. <em class="hilite">Oem> pequeno RNA melhor caracterizado é <em class="hilite">oem> microRNA (miRNAs), que predominantemente silencia genes através de uma regulaçã<em class="hilite">oem> pós-transcricional. Neste trabalho, utilizamos bioinformática para identificar possíveis genes envolvidos na via de silenciamento gênico pós-transcricional mediado por miRNA em S. mansoni. Nós pesquisamos os bancos de dados do genoma e do transcriptoma de S. mansoni, com as seqüências de aminoácidos proteínas ortólogas relacionadas à via de miRNA. Identificamos <em class="hilite">oem> total de 13 prováveis proteínas envolvidas na via miRNA no parasito. Em seguida, <em class="hilite">oem> níveis de SmDicer1 e SmAgo 2, 3 e 4 foram identificados por qRT-PCR utilizando cercárias, vermes adultos, ovos e esquistossômulos com os seguintes períodos de cultivo in vitro 3,5; 8,5; 18,5; 24; 48 e 72 horas. Este resultado demonstrou que, os dois genes sã<em class="hilite">oem> diferencialmente expressos através do período de diferenciaçã<em class="hilite">oem> cercária-esquistossômulo, tendo níveis similares em ovos e vermes adultos. Em cercárias SmDicer1 tem baixa expressã<em class="hilite">oem>. Estes resultados sugerem que esta via é um importante mecanismo de regulaçã<em class="hilite">oem> da expressã<em class="hilite">oem> gênica neste parasita. Futuros experimentos sã<em class="hilite">oem> necessários para provar esta hipótese.

RNA silencing refers to a series of nuclear and cytoplasmatic processes involved in the post-transcriptional regulation of gene expression or post-transcriptional gene silencing (PTGS), either by sequence-specific mRNA degradation or by translational arrest. The mechanism is conserved in animals and includes at least distinct pathways with several overlapping points, involved on silencing of endogenous or exogenous sequences. The best characterized small RNA is microRNAs (miRNAs), which predominantly makes genes silencing through post-transcriptional mechanisms. In this work we used bioinformatics approach to identity gene products in parasitic trematode S. mansoni with sharing similarities with enzymes involved in the post-transcriptional gene silencing mediated by miRNA pathway. We searched the S. mansoni genome and transcriptome databases, with the amino acid sequences of othologs proteins related to the miRNA pathway. We identified the total of 13 putative proteins involved in miRNA pathway in the parasite. Next, the levels of SmDicer1 and SmAgo 2, 3 and 4 were identified by qRT-PCR using cercariae, adult worms, eggs and schistosomula with the following times of in vitro cultivation 3,5; 8,5; 18,5; 24; 48 and 72 hours. This results shown that, the two genes are differentially expressed through cercariae-schistosomula differenciation, and have similar levels in eggs, and adult worms. In cercariae SmDicer1 is…

<em>Advisors/Committee Members: Elio Hideo Babá, Guilherme Corrêa Oliveira, Rogélio Lopes Brandã<em class="hilite">oem>, Renata Guerra de Sá.em>

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The cattle egret (Bubulcus ibis), native from Africa, invaded the American continent by the end of the XIX century, initiating the process of colonization through the north of South America and spreading throughout the continent. Haemoparasites are found in all continents in the world, with the exception of Antarctica, and in preliminary tests it was verified they are present in the cattle egret population. The objectives of this work were to estimate the prevalence of the haemoparasites Plasmodium and Haemoproteus on African and Brazilian populations of B. ibis and to identify the repertoire of the lineages in these populations. Blood samples and blood slides were acquired from B. ibis nestlings in six brazilian populations and in 15 african populations, located at the west coast, totalling around 859 individuals. For the molecular diagnosis, fragments of the cytochrome B gene of the Plasmodium spp. and the Haemoproteus spp. were amplified. The DNA of the parasite in the infected individuals was sequenced and the identification of the genus and the lineages present was performed through phylogenetic analysis via the bayesian method using the Mr. Bayes software. These results were partially confirmed by the morphological diagnosis. The prevalences in Africa for the Plasmodium genus decreased from Senegal and Guinea-Bissau to South Africa, while Brazilian prevalences increased from Pará to Rio Grande do Sul. The diversities of African lineages of Plasmodium spp. were higher in regions close to and above the Equator line; the highest Brazilian diversity was also found near the Equator. The G pair to pair statistical test did not reveal difference between the prevalences of African and Brazilian cattle egret populations, both for the Plasmodium and for the Haemoproteus genera. Significant difference was detected relative to the richness of the lineages of the Plasmodium genus found in Africa and Brazil, partially confirming the predictions of the Enemy Release Hypothesis. Some evidence points to African countries near and above the Equator line as African source-founder populations of the cattle egret that colonized Brazil.

A garça-vaqueira (Bubulcus ibis), nativa da África, invadiu <em class="hilite">oem> continente americano no final do século XIX, iniciando <em class="hilite">oem> processo de colonizaçã<em class="hilite">oem> pelo norte da América do Sul e se espalhando por toda a á<em class="hilite">reaem> do continente. Os hemoparasitas sã<em class="hilite">oem> encontrados em todos os continentes do mundo, com exceçã<em class="hilite">oem> da Antártida e em testes preliminares verificamos que estã<em class="hilite">oem> presentes na populaçã<em class="hilite">oem> de garça vaqueira. Os objetivos desse trabalho foram estimar a prevalência dos hemoparasitas, Plasmodium e Haemoproteus, nas populações de B. ibis africanas e brasileiras e identificar <em class="hilite">oem> repertório das linhagens nessas populações. Amostras de sangue e lâminas foram obtidas de ninhegos de B. ibis em seis populações brasileiras e em 14 populações africanas, localizadas na costa oeste, totalizando cerca 859 indivíduos. Para <em class="hilite">oem> diagnóstico molecular, foram amplificados fragmentos do gene do citocromo B do Plasmodium spp e do…

<em>Advisors/Committee Members: Sílvia Nassif Del Lama.em>

Avaliação, Padronização e Aplicação da Técnica de Pcr No Diagnóstico Diferencial Entre Entamoeba Histolytica e Entamoeba Díspar, Em Amostra Fecais Provivenientes De Pacientes Brasileiros Advisors/Committee Members: Maria Aparecida Gomes, Maria Aparecida Gomes, Maria Norma Melo, Alvaro Cantini Nunes.

▼ Resumo A identificaçã<em class="hilite">oem> de infecções por Entamoeba histolytica constitui assunto prioritário em amebíase desde que a E. dispar foi reconhecida como espécie em 1997 pela Organizaçã<em class="hilite">oem> Mundial de Saúde (OMS). A E. histolytica é a única ameba no intestino humano que invade os tecidos, produzindo no indivíduo infectado graus de morbidade variados, que se nã<em class="hilite">oem> prontamente diagnosticado e tratado pode ser fatal. A E. dispar é considerada uma espécie comensal e <em class="hilite">oem> tratamento com imidazólicos é dispensável. As diversas taxas de prevalência da infecçã<em class="hilite">oem> relatadas na literatura em sua grande maioria foram obtidas antes do reconhecimento desta nova espécie de Entamoeba, existindo a necessidade da padronizaçã<em class="hilite">oem> de novas técnicas de diagnóstico a fim de se diferenciar as duas espécies. Entre os diversos métodos moleculares de diagnóstico, a PCR é tida como uma técnica altamente sensível e específica. Neste trabalho avaliamos a aplicabilidade da PCR como método diagnóstico de infecções por E. histolytica e E. dispar. A PCR foi comparada à microscopia e a técnica de ELISA para coproantígenos. Verificamos uma sensibilidade menor da PCR quando comparados aos métodos de microscopia (69.811%) e de ELISA (64.286%). No entanto estes resultados podem estar relacionados ao modelo tomado como padrã<em class="hilite">oem>, a microscopia ótica e <em class="hilite">oem> ELISA. A microscopia ótica depende muito da experiência do microscopista, culminando principalmente, em resultados falso positivos. Tomando como padrã<em class="hilite">oem> o perfil de zimodemas foi obtida uma concordância de 100% Experimentalmente, a técnica de ELISA para coproantígenos mais sensível apresenta resultados positivos com no mínimo 100 trofozoítos por poç<em class="hilite">oem>. A PCR é capaz de identificar menos que um trofozoíto. Estes resultados sinalizam para a superioridade da PCR como método diagnóstico e estimulam a continuidade de estudos envolvendo sua padronizaçã<em class="hilite">oem> e otimizaçã<em class="hilite">oem>. <em>Advisors/Committee Members: Maria Aparecida Gomes, Maria Aparecida Gomes, Maria Norma Melo, Edward Felix Silva, Alvaro Cantini Nunes.em>

▼ A reacçã<em class="hilite">oem> em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica fundamental nos laboratórios actuais, que revolucionou a detecçã<em class="hilite">oem> de RNA e DNA. Recentemente, uma nova técnica designada PCR em tempo real, evoluiu da técnica de PCR convencional, com <em class="hilite">oem> objectivo de minimizar as suas numerosas limitações. Esta técnica, também conhecida como PCR Quantitativa ou PCR em tempo real Quantitativa é um método de quantificaçã<em class="hilite">oem> e amplificaçã<em class="hilite">oem> simultânea do DNA. A PCR em tempo real é baseada na detecçã<em class="hilite">oem> e quantificaçã<em class="hilite">oem> de um composto fluorescente (durante as primeiras fases da PCR), assentando num princípio básico de que <em class="hilite">oem> aumento significativo da quantidade de produto da PCR está correlacionado com a quantidade inicial do controle. A PCR em tempo real apresenta inúmeras vantagens relativamente à PCR tradicional. A recolha de dados ocorre durante a fase exponencial de crescimento da PCR, sendo por tal uma análise rápida e simples. Trata-se de uma técnica sem influência da amplificaçã<em class="hilite">oem> nã<em class="hilite">oem> específica, podendo a amplificaçã<em class="hilite">oem> ser controlada em tempo real. <em class="hilite">Oem> risco de contaminaçã<em class="hilite">oem> é baixo devido à ausência de processamento pós-PCR dos produtos resultantes. Além do mais, esta técnica requer apenas 3 picogramas de material, <em class="hilite">oem> que é cerca de 1000 vezes menos material genético face a ensaios convencionais. Finalmente, é uma técnica mais específica, sensível e reprodutível. No entanto, a PCR em tempo real apresenta algumas desvantagens designadamente, <em class="hilite">oem> elevado custo do equipamento e as elevadas exigências técnicas e científicas requeridas para <em class="hilite">oem> correcto manuseamento e manutençã<em class="hilite">oem> do equipamento. A técnica da PCR em tempo real pode ser aplicada tanto em utilizações mais tradicionais da PCR como em novas aplicações às quais a PCR convencional responde de forma pouco ou menos eficaz, em áreas tã<em class="hilite">oem> diversas como, saúde, forense e agricultura. As principais aplicações estã<em class="hilite">oem> relacionadas com a quantificaçã<em class="hilite">oem> da expressã<em class="hilite">oem> génica, controle de qualidade e validaçã<em class="hilite">oem> de ensaios, quantificaçã<em class="hilite">oem> viral, detecçã<em class="hilite">oem> de agentes patogénicos, toxicologia forense quantificaçã<em class="hilite">oem> de danos no DNA, genotipagem, determinaçã<em class="hilite">oem> pré-natal do sexo de células, dosagem génica, oncologia clínica, quantificaçã<em class="hilite">oem> de proteínas, microbiologia, análise e quantificaçã<em class="hilite">oem> de DNA mitocondrial e de DNA nuclear, qualidade do DNA, estudo da presença de níveis de OGM nos alimentos, certificaçã<em class="hilite">oem>, entre muitas outras aplicações possíveis. <em class="hilite">Oem> principal objectivo desta tese de Mestrado visou apresentar <em class="hilite">oem> estado da arte da técnica da PCR em tempo real, nomeadamente, descriçã<em class="hilite">oem> da técnica, comparaçã<em class="hilite">oem> com a PCR convencional, apresentaçã<em class="hilite">oem> das vantagens e desvantagens, caracterizaçã<em class="hilite">oem> e análise das plataformas implantadas no mercado e análise e discussã<em class="hilite">oem> detalhada de aplicações reais e potenciais. <em>Advisors/Committee Members: Souto, Luís (advisor).em>

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A angiostrongilíase abdominal (AA) é uma doença causada pelo nematódeo Angiostrongylus costaricensis, tendo como hospedeiros definitivos roedores silvestres e hospedeiros intermediários moluscos terrestres. No homem, hospedeiro acidental, pode causar infartos intestinais e pseudotumorações, que podem complicar com peritonite e sepse. <em class="hilite">Oem> diagnóstico definitivo é realizado pelo estudo histopatológico de peças cirúrgicas, ao serem identificadas estruturas parasitárias como vermes, ovos ou larvas. Este processo demanda tempo e experiência do patologista. Até <em class="hilite">oem> presente momento nã<em class="hilite">oem> existe tratamento disponível contra <em class="hilite">oem> parasito ou para evitar as complicações, apesar de várias tentativas realizadas com <em class="hilite">oem> uso de antiparasitários. <em class="hilite">Oem> presente estudo teve dois objetivos: 1. Testar a reaçã<em class="hilite">oem> em cadeia da polimerase (PCR) em bloco parafinado para <em class="hilite">oem> diagnóstico de angiostrongilíase abdominal em seres humanos; e 2. Avaliar <em class="hilite">oem> efeito da enoxaparina na prevençã<em class="hilite">oem> de complicações isquêmicas intestinais em camundongos com AA. Para a técnica da PCR utilizamos iniciadores de DNA do Angiostrongylus cantonensis. Blocos parafinados de 4 grupos foram divididos em: (1) casos confirmados (n=20), onde haviam estruturas parasitárias; (2) casos suspeitos (n=20), sendo alvos os granulomas e infiltrado eosinofílico; (3) controle negativo (n=3), proveniente de pacientes operados por adenocarcinomas; e (4) controle de especificidade (n=7), outras parasitoses, representados por estrongiloidíase, enterobíase, ascaridíase e esquistossomose. Para avaliar do tratamento foram utilizados 24 camundongos Swiss infectados com Angiostrongylus costaricensis (10L3/animal), sendo 12 tratados com enoxaparina subcutânea (40mg/kg/dia) e 12 com água destilada (placebo) por 50 dias. Os resultados mostraram que a sensibilidade da PCR foi de 55%, a especificidade de 100% e valor preditivo positivo de 100% para confirmaçãoo da AA. <em class="hilite">Oem> tratamento dos camundongos com enoxaparina nã<em class="hilite">oem> mostrou diferença com <em class="hilite">oem> grupo placebo, em relaçã<em class="hilite">oem> a prevençã<em class="hilite">oem> das lesões tissulares e óbito. Concluindo, a PCR pode tornar-se uma ferramenta promissora para auxiliar na definiçã<em class="hilite">oem> diagnóstica da AA, em especial quando <em class="hilite">oem> patologista nã<em class="hilite">oem> está familiarizado com esta doença. A enoxaparina na dose profilática nã<em class="hilite">oem> preveniu as lesões e os óbitos causados pelo parasito.

Abdominal angiostrongyliasis (AA) is a disease caused by the nematode Angiostrongylus costaricensis. The parasite has wild rodents as definitive hosts and molusks as intermediate hosts. Incidental contamination in men can provoke bowel infarction and pseudotumoral lesions, clinically manifested as acute abdomen. The diagnosis has been confirmed after histopathological examination of surgical specimens, with the identification of parasitic structures such as worms, eggs and larvae. Diagnostic workup demands high expertise from the pathologist. Hitherto there is no available treatment either for parasite eradication or avoidance of complications, despite several studies addressing the effect of anti-parasitic drugs. The current study aimed:…

<em>Advisors/Committee Members: Fornari, Fernando.em>

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A hanseníase é doença infecto-contagiosa causada pelo Mycobacterium leprae (M. leprae) que afeta principalmente a pele e nervos periféricos e pode causar incapacidades físicas as quais evoluem, potencialmente, para deformidades físicas permanentes. <em class="hilite">Oem> paciente hanseniano pode ser classificado como paucibacilar e multibacilar, sendo as formas paucibacilares de difícil diagnóstico. Novos métodos moleculares de alta sensibilidade e especificidade como PCR em Tempo Real qPCR, tem contribuído para diagnóstico da hanseníase, principalmente nos casos de difícil diagnóstico. Este estudo foi desenvolvido na Fundaçã<em class="hilite">oem> de Dermatologia Tropical e Venereologia Alfredo da Matta, Manaus – Amazonas, no período de març<em class="hilite">oem> de 2014 a agosto de 2015, e teve <em class="hilite">oem> intuito de validar a técnica de qPCR na detecçã<em class="hilite">oem> de M. leprae em biópsias cutâneas de pacientes com suspeita clínica de hanseníase e submetidos a exame histopatológico. As amplificações por qPCR a partir de uma sequência específica do gene 16S de M. leprae foram realizadas em 180 amostras, das quais, 82 eram biópsias frescas e 98 biópsias parafinadas. Das biópsias frescas, foram analisadas 65 amostras, entre as quais estã<em class="hilite">oem> 9 amostras de pacientes com outras dermatoses, 12 amostras clinicamente inconclusivas e 38 amostras de pacientes com hanseníase. Destes, 68,5% (26/38) foram positivos no teste molecular para a hanseníase e 33,3% (3/9) foram positivas para outras dermatoses. A sensibilidade foi de 68,5%, especificidade de 66,70%, com valor preditivo positivo de 89,7% e valor preditivo negativo de 33,3%. Entre as biópsias parafinadas, foram analisadas somente 61 amostras dos pacientes com hanseníase, as quais 73,8% foram positivas. Nestas amostras, <em class="hilite">oem> teste molecular apresentou sensibilidade de 73,8%. Além disso, <em class="hilite">oem> número de genomas foi estimado nos dois grupos de biópsias e variou de 8,53 (em uma biópsia parafinada) a 2.060.230 (em uma biópsia fresca). Os dados sugerem claramente que <em class="hilite">oem> qPCR confirmam a diferença entre pacientes MB e PB tanto em biópsias frescas quanto em biópsias parafinadas sendo que as quantidades de genomas percentualmente e quantitativamente foi maior em pacientes MB no grupo de amostras frescas quando comparado ao grupo de amostras parafinadas. Curiosamente, os dados quantitativos nas amostras de pacientes PB embora apresentem menor número de genomas, tem também um percentual maior de positividade. A despeito de ajustes necessários para melhorar a eficiência da reaçã<em class="hilite">oem>, os resultados nos mostram que <em class="hilite">oem> teste pode ser útil, em especial nos casos inconclusivos e de difícil diagnóstico, como nas formas paucibacilares quando <em class="hilite">oem> número de genomas for alto (maior que 50) que diminui <em class="hilite">oem> risco de falsos positivos.

Leprosy is an infectious disease caused by Mycobacterium leprae (M. leprae) that affects the skin and peripheral nerves and can cause physical disabilities which evolve to permanent physical deformities. The leprosy patient can be classified as paucibacillary and multibacillary and paucibacillary forms difficult to diagnose.…

<em>Advisors/Committee Members: Cortez, Carolina Chrusciak Talhari, http://lattes.cnpq.br/4041028384017266, Frota, Maria Zeli Moreira, http://lattes.cnpq.br/0827847750398440, Ramasawmy, Rajendranath, http://lattes.cnpq.br/3420417277915974.em>

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A Doença de Newcastle (DN) é uma enfermidade de etiologia viral e de rápido poder de disseminaçã<em class="hilite">oem>. Um grande número de espécies aviárias é susceptível ao Vírus da Doença de Newcastle (VDN). Entre estas aves, <em class="hilite">oem> pombo doméstico (Columba livia), tem sido incriminado como hospedeiro e disseminador da DN. Este estudo foi realizado para avaliar <em class="hilite">oem> comportamento de pombos frente ao VDN. Foram avaliadas a patogenia da doença e a cinética da RIH de pombos submetidos à vacinaçã<em class="hilite">oem> com estirpes vivas (LaSota) e a infecçã<em class="hilite">oem> experimental com estirpe patogênica (Sã<em class="hilite">oem> Joã<em class="hilite">oem> do Meriti) para galinhas (Gallus gallus), para avaliar os papéis desempenhados por estas como possíveis reservatórios do VDN. A resposta sorológica foi mensurada com a técnica de HI e a eliminaçã<em class="hilite">oem> do genoma viral avaliada com a técnica de RT-PCR. Foi observado que as estirpes vacinas produziram títulos elevados de anticorpos, tanto nas aves vacinadas como nas sentinelas. Na infecçã<em class="hilite">oem> experimental, demonstramos que a estirpe patogênica nã<em class="hilite">oem> produziu a doença clínica em pombos, porém promoveu a formaçã<em class="hilite">oem> de anticorpos, bem como a eliminaçã<em class="hilite">oem> do genoma viral. Também foi comprovada a alta infectividade do agente, tendo em vista que aves sentinelas apresentaram níveis de anticorpos elevados, nos mesmos patamares das aves infectadas.

Newcastle Disease (ND), is a highly contagious disease of viral etiology and several bird species are susceptible this disease. The domestic pigeon (Columba livia), has been regarded as a host and disseminating agent of ND. Therefore, a study was carried out in order to evaluate the responses of pigeons naturally or experimentally infected with this pathogen and the possible role of these birds as potential reservoirs of NDV. The disease pathogenesis and the kinetics of the host humoral immune response were studied in pigeons subjected to vaccination with live NDV strains (LaSota) and to experimental infection with a NDV strain (Sã<em class="hilite">oem> Joã<em class="hilite">oem> do Meriti) that affects domestic chickens (Gallus gallus). The serological response was measured by HI and the elimination of the viral genome was evaluated by RT-PCR. Vaccine strains induced high antibody levels, both in vaccinated and in sentinel birds. Clinical signs of the disease were not induced by the pathogenic strain in experimentally infected pigeons, although there was antibody production, as well as elimination of the viral genome. The high infectivity of the agent was also confirmed, since the sentinels birds presented high antibody levels, which were similar to the levels produced by infected birds.

<em>Advisors/Committee Members: Pinto, Aramis Augusto.em>

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Nos últimos anos a incidência da clorose letal, causada pelo Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) vem aumentando em plantios de cucurbitáceas e preocupando produtores pelos danos causados na produçã<em class="hilite">oem>. Devido às poucas informações sobre esta virose em cucurbitáceas, somente algumas medidas profiláticas de controle têm sido recomendadas para minimizar a incidência da doença. A resistência genética, seja da forma tradicional ou por meio da transgenia, é considerada a melhor e mais eficiente forma de controle de viroses em geral. Sendo assim essa proposta de pesquisa visou caracterizar a resistência da moranga Exposiçã<em class="hilite">oem> ao ZLCV, para gerar informações que auxiliem programas de melhoramento vegetal e também estudar a possível interferência do Papaya ringspot virus type W (PRSV-W) e do Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) na resistência das plantas ao ZLCV. A infecçã<em class="hilite">oem> pelo ZLCV e sua movimentaçã<em class="hilite">oem> na planta foram avaliadas por PTA-ELISA, RT-PCR, impressã<em class="hilite">oem> de tecido (Tissue printing) e teste de recuperaçã<em class="hilite">oem> biológica. Os resultados mostraram que <em class="hilite">oem> vírus pôde ser detectado no local da infecçã<em class="hilite">oem>, mas nã<em class="hilite">oem> foi detectado além do ponto de inoculaçã<em class="hilite">oem>. Estes resultados sugerem que a moranga Exposiçã<em class="hilite">oem> apresenta uma resistência à invasã<em class="hilite">oem> sistêmica de longa distância ao ZLCV. Para verificar a possível interferência dos potyvirus na resistência da moranga Exposiçã<em class="hilite">oem> ao ZLCV foram conduzidos experimentos em casa de vegetaçã<em class="hilite">oem>, onde os vírus foram inoculados em mistura nas plantas teste e experimentos em campo onde os potyvirus foram pré-inoculados e a infecçã<em class="hilite">oem> pelo ZLCV ocorreu naturalmente pelo vetor. Em nenhum dos casos foi verificada interferência dos potyvirus na resistência das plantas de moranga ao ZLCV.

The occurrence of lethal chlorosis in the past years, caused by Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV), has become common in cucurbit crops, which concerns producers in terms of yield losses. Due to the lack of information about this virus disease, only few prophylactic precautions have been recommended in order to minimize the occurrence of the disease. The genetic resistance, either via conventional means or via transgenesis, is considered the most efficient way so far to control virus diseases. With that in mind, the present work aimed to characterize the genetic resistance of winter squash Exposiçã<em class="hilite">oem> against ZLCV in order to generate important information for cucurbit breeding programs, as well as to investigate the potential effect of Papaya ringspot virus type W (PRSV-W) and Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) in winter squash Exposiçã<em class="hilite">oem> resistance against ZLCV. The ZLCV infection and its systemic mobility inside the plant were evaluated by PTA-ELISA, RT-PCR, tissue printing and biological recovery test. The results have shown that ZLCV can be detected at the infection spot, but was not detected beyond the inoculation point. These results suggest that winter squah Exposiçã<em class="hilite">oem> is resistant to long-distance systemic invasion of ZLCV. In order to verify the potential interference of the potyviruses on the winter squash Exposiçã<em class="hilite">oem>…

<em>Advisors/Committee Members: Rezende, Jorge Alberto Marques.em>

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<em class="hilite">Oem> objetivo do presente estudo foi investigar, por métodos estatísticos, a ocorrência de reações cruzadas entre Leishmania spp. e Ehrlichia spp. com <em class="hilite">oem> uso de técnicas sorológicas e moleculares. Um total de 100 amostras sanguíneas de cães foram colhidas e processadas por meio do ELISA (Ensaio Imunoenzimático Indireto) e PCR (Reaçã<em class="hilite">oem> em Cadeia da Polimerase). A análise estatística consistiu nos testes de McNemar e Coeficiente de concordância Kappa. As estatísticas foram consideradas significativas quando p<0,05. A sensibilidade e especificidade dos testes foram determinadas pela curva ROC (Receiver Operator Characteristic), considerando <em class="hilite">oem> PCR como teste padrã<em class="hilite">oem> ouro. A partir das análises pode-se verificar que 48,0% dos animais foram reativos na ELISA e 58,0% foram positivos na PCR, no caso da Leishmania spp. Para Ehrlichia spp., a ocorrência de anticorpos pelo ELISA foi de 54,0% e, pela PCR, 48,0% dos cães foram positivos. Nota-se, também, que 37,0% dos animais foram positivos para os dois patógenos por meio do teste molecular, e quatro cães foram reativos no teste ELISA para ambas as doenças e tiveram resultado negativo apenas no teste molecular de Ehrlichia spp. Estes resultados, na sorologia, podem sugerir possíveis casos de reatividade cruzada entre a Leishmania spp. e Ehrlichia spp.. Entretanto, é mais provável que estes resultados estejam relacionados com a coinfecçã<em class="hilite">oem> desses agentes. Por meio dos resultados obtidos, há mais evidências de coinfecçã<em class="hilite">oem> por estes dois agentes patogênicos no cã<em class="hilite">oem>, do que reatividade cruzada entre eles.

The aim of this study is to investigate, by statistical methods, the occurrence of cross-reactivity between Leishmania spp. and Ehrlichia spp. using serological and molecular techniques. A total of 100 blood samples from dogs were collected and processed by ELISA (indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) and PCR (polymerase chain reaction). Statistical analysis consists of McNemar tests and agreement coefficient Kappa. The statistics were considered significant when p <0.05. The sensitivity and specificity of the tests were determined by ROC curve (Receiver Operator Characteristic), considering the PCR as gold standard. From the analysis it can be seen that 48,0% of the animals were reactive in ELISA and 58,0% were positive in PCR in the case of Leishmania spp. For Ehrlichia spp., the occurrence of antibodies by ELISA was 54,0% and, by PCR, 48,0% of the dogs were positive. It can be noted also that 37,0% of the animals were positive for both parasites through molecular test and four dogs were reactive in the ELISA test for both diseases and were negative only in molecular test for Ehrlichia spp. These results in serology can suggest possible cases of cross-reactivity between Leishmania spp. and Ehrlichia spp.. However, it is more likely that these results are related to coinfection of these agents. Through the results obtained, there are more evidences of coinfection by these two pathogens in dogs than cross-reactivity between them.

<em>Advisors/Committee Members: Perri, Sílvia Helena Venturoli [UNESP], Bresciani, Katia Denise Saraiva [UNESP], Universidade Estadual Paulista (UNESP).em>

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<em class="hilite">Oem> risco da introduçã<em class="hilite">oem> de doenças exóticas ou cepas mais virulentas de doenças endêmicas através da transferência de embriões é uma preocupaçã<em class="hilite">oem> constante, afetando as relações comerciais internacionais. <em class="hilite">Oem> objetivo desse trabalho foi pesquisar a presença do vírus BHV-1, causador da IBR, no líquido folicular e complexos cumulus-oócito (COCs) bovinos em animais naturalmente infectados. Foram utilizados 38 animais sorologicamente positivos e 8 negativos para IBR. Os COCs e líquidos foliculares foram obtidos através da técnica de punçã<em class="hilite">oem> folicular orientada por ultrassonografia (OPU). A pesquisa do vírus feita através da PCR. Nã<em class="hilite">oem> foi encontrado <em class="hilite">oem> DNA viral em nenhuma das amostras obtidas. Pode-se concluir que a utilizaçã<em class="hilite">oem> de animais sorologicamente positivos para BHV-1, na PIV segura enquanto <em class="hilite">oem> animal nã<em class="hilite">oem> estiver na fase aguda da doença e que a existência de um COC negativo em um sistema PIV nã<em class="hilite">oem> prediz <em class="hilite">oem> status epidemiológico do rebanho, portanto um protocolo para comercializaçã<em class="hilite">oem> de embriões e gametas deve levar em conta <em class="hilite">oem> perfil sorológico das doadoras.

The risk of the introduction of exotic illnesses or more virulent kinds of endemic diseases through the transference of embryos is a constant concern, affecting the international commercial relationships. The objective of this study was to investigate the presence of the BHV-1 virus, causer of the IBR, in the bovine folicular fluid and cumulus-oocytes complexes in naturaly infected animals of form. Positive animals (n= 38) and negatives (n=8)animals were selected for IBR. The cumulus-oocytes complexes and folicular fluid were obtained by ovum pick-up (OPU) and the research of the virus made through PCR. The viral DNA was not found in the samples. In conclusion the use of positive animals for BHV-1 in the IVP, is acceptable for animals not in the acute phase of the illness, and the existence of a negative cumulus-oocytes complexes in a PIV system does not mean that the donator is negative for the illness, therefore a protocol for commercialization of embryos and germ cells must take in account the serological profile of the donators.

<em>Advisors/Committee Members: Romulo Cerqueira Leite, Marc Roger Jean Marie Henry, Romulo Cerqueira Leite, Joao Henrique Moreira Viana.em>

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The aim of this work was to detect Listeria monocytogenes added in milk, after selective enrichment period, by PCR technique. A PCR technique using the primers LM1/LM2 and a multiplex PCR with IAP1/IAP2 e LMA/LMB was standardized. The conventional method of L. monocytogenes detection was compared from milk samples with different bacterial count added with various L. monocytogenes concentrations. The DNA extraction methods using phenolchloroform and thermal split were compared. The DNA extraction and the conventional methods showed the same result in detecting the bacterium in samples of sterilized milk. In milk samples with any initial contamination, the conventional methodology was sensitive and PCR from enrichment broth can not detect L. monocytogenes added, independently of the extraction method used. The identification time of L. monocytogenes decreased using the DNA extraction by the strain split method using suspect colonies that grew in Oxford and PALCAM, in substitution of identification phenotypes tests

<em class="hilite">Oem> objetivo deste trabalho foi detectar Listeria monocytogenes inoculada em leite, após um período de enriquecimento seletivo, por meio da técnica de PCR. Foi feita a padronizaçã<em class="hilite">oem> de uma PCR utilizando os oligonucleotídeos LM1/LM2 e de uma PCR multiplex com os oligonucleotídeos IAP1/IAP2 e LMA/LMB. Listeria monocytogenes foi inoculada em várias concentrações em leite esterilizado desnatado e em leite cru integral com dois níveis diferentes de contaminaçã<em class="hilite">oem>. A PCR padronizada foi aplicada para identificar a bactéria inoculada experimentalmente e foi comparada com <em class="hilite">oem> método convencional de detecçã<em class="hilite">oem> de L. monocytogenes. Foram comparados, também, os métodos de extraçã<em class="hilite">oem> de DNA utilizando fenolclorofórmio e por lise térmica, a partir de um caldo de cultura e diretamente da colônia suspeita. Somente foi possível identificar L. monocytogenes por PCR no leite esterilizado desnatado, após 48 horas de enriquecimento em meio seletivo (LEB). Neste caso, a sensibilidade do teste foi de 1 UFC/ml de leite, a mesma sensibilidade da metodologia convencional. Quando inoculada em leite cru integral com contaminaçã<em class="hilite">oem> bacteriana, L. monocytogenes só foi detectada pela metodologia convencional, com uma sensibilidade de até 2 UFC/ml (leite com baixa contaminaçã<em class="hilite">oem>). Foi possível reduzir <em class="hilite">oem> tempo de identificaçã<em class="hilite">oem> de L. monocytogenes, substituindo os testes fenotípicos de identificaçã<em class="hilite">oem> pela PCR padronizada, utilizando DNA bacteriano extraído pelo método de lise térmica, diretamente da colônia suspeita

<em>Advisors/Committee Members: Monica Maria <em class="hilite">Oem> Pinho Cerqueira, Monica Maria <em class="hilite">Oem> Pinho Cerqueira, Marcelo Resende de Souza, Carla Christine Lange.em>

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A família Cracidae, na qual estã<em class="hilite">oem> incluídas as espécies Crax blumenbachii (Mutum do sudeste), Crax fasciolata (Mutum de penacho) e Aburria jacutinga (Jacutinga), corresponde ao taxon de aves mais ameaçado de extinçã<em class="hilite">oem> das Américas. Nosso trabalho constitui <em class="hilite">oem> primeiro estudo a determinar a prevalência de Plasmodium spp. e avaliar a influência da malária aviária na hematologia, bioquímica sanguínea e perfil eletroforético de proteínas plasmáticas de C. blumenbachii, C. fasciolata e A. jacutinga. Foram coletadas amostras sanguíneas de 42 espécimes de Aburria jacutinga, 41 de C. blumenbachii e 21 de C. fasciolata e nas duas últimas foram realizadas quatro coletas seqüenciais durante um ano. Utilizamos, em paralelo, a análise microscópica de esfregaços sanguíneos bem como a amplificaçã<em class="hilite">oem> dos genes estrutural 18S rRNA e mitocondrial SSU de Plasmodium spp. para <em class="hilite">oem> diagnóstico da infecçã<em class="hilite">oem> por Plasmodium spp. A prevalência média encontrada em C. blumenbachii foi de 18,3% para machos e 12,5% para fêmeas; em C. fasciolata a média foi de 18,2% em machos e 20% em fêmeas. Em aves da espécie A. jacutinga as prevalências em machos e fêmeas foram de 52,65% e 34,8%, respectivamente. Notamos entre os cracídeos estudados a ocorrência de respostas fisiológicas distintas frente ao parasitismo por Plasmodium spp. Machos de C. blumenbachii demonstraram interferências negativas associadas ao parasitismo mais evidentes que as fêmeas com relaçã<em class="hilite">oem> aos valores de hematócrito, contagem de eritrócitos, concentraçã<em class="hilite">oem> de hemoglobina e contagem de leucócitos. Observamos para C. fasciolata, variações semelhantes às ocorridas em C. blumenbachii com relaçã<em class="hilite">oem> ao eritrograma. Médias superiores na relaçã<em class="hilite">oem> heterófilo/linfócito de C. blumenbachii parasitados também foram observadas. Diferenças significativas no perfil hematológico nã<em class="hilite">oem> foram observadas em A. jacutinga; contudo, perceptível tendência a médias inferiores de hematócrito e hemoglobina foi verificada nas fêmeas parasitadas. Constatou-se para esta espécie, média superior de leucócitos entre as fêmeas parasitadas, com elevaçã<em class="hilite">oem> na contagem de monócitos. <em class="hilite">Oem> parasitismo por Plasmodium spp. associou-se às elevações nas enzimas ALT e AST em ambas as espécies de Crax, porém, <em class="hilite">oem> mesmo nã<em class="hilite">oem> foi observado em A. jacutinga. Os machos de C. blumenbachii positivos apresentaram valores de 2-globulina, 1-globulina e 2-globulina mais elevados que os nã<em class="hilite">oem> parasitados. <em class="hilite">Oem> grupo de machos e fêmeas parasitados de C. fasciolata apresentou teores de albumina inferiores ao do grupo de animais nã<em class="hilite">oem> parasitados. Acreditamos que os dados gerados neste trabalho possam contribuir de forma significativa para <em class="hilite">oem> aperfeiçoamento das ações de conservaçã<em class="hilite">oem> destas espécies ameaçadas de extinçã<em class="hilite">oem>.

A família Cracidae, na qual estã<em class="hilite">oem> incluídas as espécies Crax blumenbachii (Mutum do sudeste), Crax fasciolata (Mutum de penacho) e Aburria jacutinga (Jacutinga), corresponde ao taxon de aves mais ameaçado de extinçã<em class="hilite">oem> das Américas. Nosso trabalho constitui <em class="hilite">oem> primeiro estudo a determinar a prevalência de Plasmodium spp. e avaliar a influência da malária…

<em>Advisors/Committee Members: Erika Martins Braga, Erika Martins Braga, Marta Tavares D Agosto, Nádia Regina Pereira Almosny, Romario Cerqueira Leite, Alan Lane de Melo.em>

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<em class="hilite">Oem> vírus da Anemia Infecciosa Eqüina (EIAV) é um Retrovírus causador da Anemia Infecciosa Eqüina, uma enfermidade que acomete somente animais da família Eqüidae. No presente estudo foram avaliadas técnicas de PCR (reaçã<em class="hilite">oem> em cadeia da polimerase) como diagnóstico confirmatório para os testes sorológicos ELISA e IDGA. Foram analisadas amostras de lavado broncoalveolar (LBA), células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) e soro, provenientes de eqüídeos com resultados positivos na IDGA encaminhados ao abate em frigoríficos de MG. Amostras de DNA provenientes do LBA e PBMCs foram submetidas à amplificaçã<em class="hilite">oem> pela PCR -Actina, nPCR gag e PCR gp90. A PCR -Actina mostrou ser um controle eficiente da qualidade do DNA genômico submetido às demais técnicas. A PCR gp90 nã<em class="hilite">oem> foi capaz de amplificar amostras brasileiras do DNA proveniente de PBMCs e LBA de animais positivos para AIE. A nPCR gag mostrou ser eficiente em amplificar seqüências virais em amostras de PBMCs, podendo ser utilizada como diagnóstico confirmatório ou complementar para técnicas sorológicas.

Equine Infectious Anemia Virus (EIAV) is a retrovirus that causes Equine Infectious Anemia, a disease that strikes animals from family Eqüidae. In the present study, PCR (polymerase chain reaction) techniques were evaluated as a confirmation test for ELISA serologic tests and IDGA. Samples of bronchoalveolar lavage fluid (BALF), peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and serum from IDGA-positive equids that were slaughtered in cold storage plants were analyzed. DNA samples from BALF and PBMCs were submitted to amplification by -Actin PCR, gag nPCR and gp90 PCR. -Actin PCR was found to be an efficient quality control resource for genomic DNA submitted to the other techniques. gp90 PCR was not able to amplify the Brazilian samples of DNA from BALF and PBMCs from AIE-positive animals. gag nPCR was efficient in the amplification of viral sequences in PBMCs samples and can be utilized as a confirmation diagnostic test for serologic techniques.

<em>Advisors/Committee Members: Marcos Bryan Heinemann, Jenner Karlisson Pimenta dos Reis, Jenner Karlisson Pimenta dos Reis, Marcelo Fernandes Camargos.em>

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The identification of Staphylococcus aureus in milk and the evaluation of its potential enterotoxic were evaluable during period from march to june of 2009, on the milk samples from cattle farms located in the microregion of Sete Lagoas-MG. A protocol for DNA extraction from S. aureus directly from milk samples, followed by amplifications by PCR of the genes fem A, sea, seb and sec were used. The Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) were detected by amplification of the mec A gene. The sensitivity and specificity of the technique was tested in milk artificially contaminated milk using a decimal dilution of S. aureus standard strains (ATCC 25923, ATCC 13565, ATCC 14458, ATCC 19095 and ATCC 33591). The detection limit of microorganisms was 10 CFU / mL for all genes evaluated with specific primers. The specificity was determined by the presence of expected PCR products from the DNA of the reference strains (positive control) and not amplified DNA from S. epidermidis (negative control). 200 milk samples from the expansion tank from the microregion of Sete Lagoas-MG were available for the presence of the gene fem A. The results were analyzed statistically if there was a relationship between the presence of S. aureus identified in milk samples with higher Total bacteria cont (CBT) and the largest somatic cell cont (CCS) were also related to increased presence of S. aureus. Of the 200 samples, 145 (72.5%) amplified the gene fem A, and were analyzed for the presence of genes sea, seb, sec and mec A. The genes of enterotoxins most prevalent were: sea (60%), followed by seb (37.93%) and then sec (6.89%). There were found 18 milk samples (11.03%) with S. aureus carriers of the gene mec A, identifying the presence of MRSA. There was no correlation between the rates of identification of S. aureus and high CCS or CBT. The detection of S. aureus directly from milk, without the need for bacterial isolation, and characterization of its enterotoxic potential suggests the use of this PCR technique for epidemiological studies of staphylococcal infections. In addition, the S. aureus is one of the major causative pathogen of intramammary infections in the microregion of Sete Lagoas-MG and have a high potential enterotoxic. It is represents a potential risk to public health. It should be noted that the presence of MRSA highlights the selection of antibiotics resistant microorganisms, suggesting that the indiscriminate use of antibiotics in addition to compromising the quality of milk and milk products is a risk to human health

Neste trabalho foi realizada a identificaçã<em class="hilite">oem> de Staphylococcus aureus e a avaliaçã<em class="hilite">oem> do seu potencial enterotoxigênico a partir de amostras de leite de bovinos de propriedades rurais localizadas na microrregiã<em class="hilite">oem> de Sete Lagoas-MG, no período de març<em class="hilite">oem> a junho de 2009. Utilizou-se a extraçã<em class="hilite">oem> de DNA de S. aureus diretamente de amostras de leite, seguida da amplificaçã<em class="hilite">oem> pela técnica da PCR dos genes fem A, sea, seb e sec. Os S. aureus resistentes à Meticilina (MRSA) foram detectados pela amplificaçã<em class="hilite">oem> do…

<em>Advisors/Committee Members: Nivaldo da Silva, Nivaldo da Silva, Marcelo Fernandes Camargos, Leorges Moraes da Fonseca.em>

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<em class="hilite">Oem> sistema composto por uma reator UASB seguido de lagoas de polimento em série (UASBLP) tem sido aplicado com sucesso para <em class="hilite">oem> tratamento de esgoto doméstico, com eficiente remoçã<em class="hilite">oem> de matéria orgânica e inorgânica, bem como de microrganismos patogênicos. A avaliaçã<em class="hilite">oem> da remoçã<em class="hilite">oem> de bactérias patogênicas em sistemas de tratamento ocorre geralmente pelo decaimento de bactérias coliformes fecais e da bactéria Escherichia coli. Atualmente têm-se utilizado a técnica molecular da reaçã<em class="hilite">oem> em cadeia da polimerase (polimerase chain reaction - PCR) para detecçã<em class="hilite">oem> de bactérias patogênicas em amostras de água, alimentos e em análises clínicas. <em class="hilite">Oem> presente trabalho teve por objetivo estabelecer metodologia de preparaçã<em class="hilite">oem> e concentraçã<em class="hilite">oem> das diferentes amostras que compõem <em class="hilite">oem> sistema UASB-LP para aplicaçã<em class="hilite">oem> da técnica PCR para detecçã<em class="hilite">oem> de bactérias patogênicas em amostras de esgoto bruto e efluentes tratados. Com este trabalho foram estabelecidas as condições para <em class="hilite">oem> monitoramento das espécies Escherichia coli, Salmonella spp., Salmonella thyphimurium, Shigella spp., Shigella dysenteriae, Helicobacter pylori, Enterococcus spp. e Staphylococcus aureus utilizando primers específicos. Os resultados obtidos com <em class="hilite">oem> monitoramento das bactérias permitiram concluir que as bactérias Escherichia coli, Enterococcus spp. e Shigella dysenteriae detectadas no esgoto bruto foram removidas ao longo das unidades de tratamento, nã<em class="hilite">oem> sendo detectadas no efluente final. Já a bactéria Salmonella typhimurium foi detectada nos efluentes das lagoas e no efluente final. Helicobacter pylori e Staphylococcus aureus nã<em class="hilite">oem> foram detectadas no esgoto bruto e nos efluentes das unidades de tratamento. Estes resultados mostram a aplicabilidade da técnica PCR para investigaçã<em class="hilite">oem> qualitativa de bactérias patogênicas em sistemas de tratamento de esgotos

Wastewater treatment based on a UASB reactor followed by polishing ponds is well established for removing organic and inorganic matter, as well as pathogenic microorganisms. Usually the evaluation of pathogenic bacteria removal in wastewater treatment systems is carried out by analyzing fecal coliforms and Escherichia coli decay. Recently molecular techniques based on polimerase chain reaction method (PCR) have been applied for detecting pathogenic bacteria in water, food and clinical samples. The present work aimed to establish a methodology for sample preparation, DNA extraction and PCR analysis in samples along the UASB- polishing ponds system for several pathogenic bacteria. Monitoring of Escherichia coli, Salmonella spp., Salmonella thyphimurium, Shigella spp., Shigella dysenteriae, Helicobacter pylori, Enterococcus spp., e Staphylococcus aureus were performed by PCR using specific primers. It can be concluded from results obtained in this research that Escherichia coli, Enterococcus spp and Shigella dysenteriae were detected in the raw sewage and were removed along the UASB- polishing ponds system since they were not detected in the final effluent. On the other hand, DNA from Salmonella typhimurium was detected only in the…

<em>Advisors/Committee Members: Silvana de Queiroz Silva, Marcos Von Sperling, Silvana de Queiroz Silva, Marcos Von Sperling, Juliana Calabria de Araujo, Maria Celia da Silva Lanna.em>

▼ A incidência de infecções na corrente sanguínea (ICS) causada por Candida spp tem aumentado nos últimos anos. Estudos realizados em diferentes países têm mostrado diferença na epidemiologia das infecções invasivas por essas leveduras. Na regiã<em class="hilite">oem> Centro-Oeste do Brasil, dados sobre candidemia sã<em class="hilite">oem> escassos. Essa doença está associada à alta taxa de mortalidade (30% a 60%) e a prolongada permanência hospitalar. Nós realizamos uma análise retrospectiva de casos de ICS por Candida em um hospital terciário de ensino do Mato Grosso do Sul, Brasil, para estudar os aspectos clínicos e epidemiológicos da doença, assim como para determinar a similaridade genética das leveduras isoladas por meio da técnica de PCR-RAPD. Noventa e seis casos de ICS por Candida spp, registrados entre janeiro de 1998 e dezembro de 2006, foram incluídos no estudo. A idade dos pacientes variou de 3 dias a 85 anos, sendo 53 (55,2%) adultos e 43 (44,8%) pediátricos. Eles estiveram internados por um período que variou de 01 a 124 dias com média de 30 dias. Os episódios de candidemia foram registrados em maior número no CTI adulto (n= 29; 30,1%) e UTI neonatal (n= 25; 26,0%). Entre os pacientes pediátricos, 23 eram pré-termos. Dezessete neonatos (68%) tinham peso inferior à 1500g ao nascimento. Cinqüenta e oito pacientes (60,4 %) foram a óbito durante a hospitalizaçã<em class="hilite">oem>. As principais condições associadas foram: permanência hospitalar por mais de 15 dias (n=66; 68,8%), cateter em posiçã<em class="hilite">oem> central (61; 63,5 %) e uso de cefalosporina de 3ª geraçã<em class="hilite">oem> (n=55; 57,3%). Entre os pacientes pediátricos, cinco (11,6%) apresentavam má formaçã<em class="hilite">oem> congênita e doze (27,9%), infecçã<em class="hilite">oem> perinatal. As doenças de base mais relatadas foram: Diabetes Mellitus (10,4%), tumor sólido (9,4%) e doenças hematológicas (12,5 %). Os agentes mais freqüentes foram: Candida albicans (45,8%), Candida parapsilosis (34,4%), Candida tropicalis (14,6%) e Candida glabrata (5,2%). A amplificaçã<em class="hilite">oem> do DNA genômico das leveduras isoladas gerou uma grande variedade de perfis genéticos entre as diferentes espécies de Candida e entre as cepas de uma mesma espécie, comprovando <em class="hilite">oem> alto poder discriminatório da técnica. Esta é a primeira descriçã<em class="hilite">oem> de infecçã<em class="hilite">oem> na corrente sanguínea por espécies de Candida no Mato Grosso do Sul, Brasil, e confirma a importância da suspeita clínica de infecções invasivas por Candida spp na evoluçã<em class="hilite">oem> do paciente, principalmente quando idosos e neonatos estã<em class="hilite">oem> envolvidos. <em>Advisors/Committee Members: Chang, Marilene Rodrigues (advisor).em>

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Many studies have demonstrated that infection by Bartonella vinsonni subspecies berkhoffii may cause cardiac arrhythmia, myocarditis and infectious endocarditis in humans. There is strong evidence that Bartonella vinsonni is an important cardiac pathogen in both humans and dogs The Bartonella sp has been associated with several human diseases, being responsible for a number of zoonoses. The aim of this work was to identify and correlate the Bartonella vinsonni subsp. berkhoffii with the cardiac disease by using specific oligonucleotides as Bh16SF and Bh16SR, which amplify a 185-bp fragment of 16S rRNA. The PCR technique was used for detection of this bacterium in human leukocytes. The amplification products were analyzed in 1.5% agarose gel in order to confirm the 185-bp fragment, which in turn indicates the presence of the bacterium. Thirty eight (39%) out of the 96 humans with cardiopathies as well as 16 (15%) out of the 104 humans from the control group showed positive PCR amplification for Bartonella vinsonni subsp. berkhoffii, thus suggesting a positive correlation of this subspecies with the cardiopathies. Sequencing of the amplified product confirmed the presence of Bartonella vinsonni subspecies berkhoffii.

Estudos comprovam a existência de casos de arritmia cardíaca, miocardite e endocardite infecciosa causados por infecçã<em class="hilite">oem> pela bactéria Bartonella vinsonni subespécie berkhoffii em humanos. Há uma grande evidência que a espécie da Bartonella vinsonni é um patógeno cardíaco importante em humanos e cães. A Bartonella sp está associada a uma variedade de doenças humanas, sendo considerado uma zoonose. <em class="hilite">Oem> objetivo deste trabalho foi identificar e correlacionar a bactéria Bartonella vinsonni subespécie berkhoffii com a patologia cardíaca utilizando oligonucleotídeos específicos Bh16SF e Bh16SR, que amplificam um segmento de 185 pb para <em class="hilite">oem> gene 16SrRNA e averiguar, por PCR, a presença de bactérias em leucócitos humanos. Os produtos de amplificaçã<em class="hilite">oem> foram analisados em gel de agarose 1,5% para confirmaçã<em class="hilite">oem> da amplificaçã<em class="hilite">oem> do fragmento de DNA de 185 pb que indica a presença da bactéria. Trinta e oito (39%) dos 96 humanos cardiopatas e dezesseis (15%) dos 104 humanos do grupo controle apresentaram amplificaçã<em class="hilite">oem> positiva por PCR para a bactéria Bartonella vinsonni subespécie berkhoffii, sugerindo uma correlaçã<em class="hilite">oem> entre a bactéria e a cardiopatia. Análise por sequenciamento do material amplificado confirmou a presença da Bartonella vinsonni subespécie berkhoffii. Estes achados confirmam a existência de uma correlaçã<em class="hilite">oem> entre a presença da bactéria Bartonella vinsonni subespécie berkhoffii e problemas cardíacos em humanos.

<em>Advisors/Committee Members: Heloísa Sobreiro Selistre de Araujo.em>

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As ferramentas de biotecnologia têm proporcionado nos dias atuais <em class="hilite">oem> desenvolvimento de organismos geneticamente modificados (OGMs), sejam microorganismos, plantas ou animais. Plantas geneticamente modificadas (PGM) possibilitam a soluçã<em class="hilite">oem> de problemas na produçã<em class="hilite">oem>, agregando valor aos produtos agrícolas e em várias situações, oferecendo alternativas importantes para a melhoria na qualidade de vida humana e do ambiente. Após a obtençã<em class="hilite">oem> de plantas GM, a caracterizaçã<em class="hilite">oem> molecular dos eventos constitui uma etapa essencial para a identificaçã<em class="hilite">oem> das linhagens mais promissoras, que venham constituir <em class="hilite">oem> evento GM elite, a ser utilizado como linhagem parental no programa de melhoramento. A caracterizaçã<em class="hilite">oem> molecular quanto ao número de cópias do transgene, bem como do sítio de inserçã<em class="hilite">oem>, permite inferir sobre a estabilidade do genoma receptor após a transformaçã<em class="hilite">oem> gênica. Este trabalho teve como principal objetivo avaliar a eficácia da quantificaçã<em class="hilite">oem> do número de cópias transgenes no genoma da soja utilizando a metodologia de PCR quantitativo (qPCR) comparando-a à técnica pioneira de Southern blotting. Foram testados 2 sistemas de quantificaçã<em class="hilite">oem> por qPCR por quantificaçã<em class="hilite">oem> relativa, baseados em DNA genômico, um que empregou a fórmula 2-∆∆Ct , utilizando uma amostra com número de cópias do transgene conhecida como calibradora; e outro, que utilizou a própria referência endógena como calibrador, através da fórmula 2-∆Ct/2. Além destes, plasmídeos recombinantes, contendo as regiões de interesse (transgene) e parte do gene da lectina clonados, foram utilizados para a construçã<em class="hilite">oem> de curvas de calibraçã<em class="hilite">oem> para determinaçã<em class="hilite">oem> do número absoluto de cópias do transgene no genoma da soja. Para determinaçã<em class="hilite">oem> da exatidã<em class="hilite">oem> dos diferentes sistemas os resultados foram comparados com os obtidos através da técnica de Southern blot. Nove eventos GM contendo <em class="hilite">oem> gene DREB1A tiveram <em class="hilite">oem> número de cópias dos cassetes transgenes quantificados via qPCR por quantificaçã<em class="hilite">oem> relativa. De acordo com os resultados, 9 eventos tiveram <em class="hilite">oem> número de cópias dos cassetes determinados pelas duas metodologias de qPCR por quantificaçã<em class="hilite">oem> e confirmados por Southern blot. Os resultados demonstraram que ambos os métodos de quantificaçã<em class="hilite">oem> relativa possibilitaram a quantificaçã<em class="hilite">oem> exata do número de cópias do transgene no genoma das amostras testadas. <em class="hilite">Oem> emprego da própria referência endógena como calibradora foi mais precisa, uma vez que elimina variações na amplificaçã<em class="hilite">oem> que possam ocorrer entre amostra/calibrador. Tais resultados indicam a potencialidade, além da praticidade e rapidez, do emprego da técnica de qPCR para realizar <em class="hilite">oem> screening inicial de plantas GM na seleçã<em class="hilite">oem> de eventos com baixo número de cópias, e, conseqüentemente, na aceleraçã<em class="hilite">oem> do desenvolvimento de eventos GM elites.

Biotechnology has allowed the development of genetically modified organisms (GMOs) permitting the solution of many production problems aggregating values to agriculture products and offering, in many situations, important alternatives in human life and environment quality. After obtain a GM…

<em>Advisors/Committee Members: Alexandre Lima Nepomuceno ., Luiz Gonzaga Esteves Vieira, Francismar Corrêa Marcelino.em>

▼ Ocratoxina A (OA) é uma micotoxina encontrada tanto em grãos de café como na bebida preparada a partir de grãos contaminados. <em class="hilite">Oem> perfil toxicológico desta micotoxina inclui carcinogenicidade, nefrotoxicidade e imunotoxicidade. <em class="hilite">Oem> café é uma bebida extensivamente consumida no mundo e <em class="hilite">oem> Brasil se configura como <em class="hilite">oem> maior produtor de grãos de café do mundo. Apesar do café nã<em class="hilite">oem> ser a principal fonte de OA no consumo humano, ações para evitar a presença deste metabólito em grãos de café sã<em class="hilite">oem> necessárias para diminuir a exposiçã<em class="hilite">oem> humana a esta micotoxina. OA foi descoberta em 1965, como um metabólito secundário de A. ochraceus, mas após isso, várias outras espécies de Aspergillus e Penicillium foram descritas como produtoras de OA. Atualmente, Aspergillus westerdijkiae é reconhecido como a mais importante espécie produtora de OA em grãos de café. Aspergillus westerdijkiae é uma nova espécie de fungo que foi recentemente desmembrada a partir do taxon Aspergillus ochraceus. Essa espécie é muito similar a A. ochraceus e vários isolados previamente identificados como A. ochraceus, agora sã<em class="hilite">oem> identificados como A. westerdijkiae. De acordo com a literatura, isolados de A. westerdijkiae sã<em class="hilite">oem> muito freqüentes e a maioria deles é capaz de produzir grandes quantidades de OA. Neste trabalho, vários isolados obtidos de amostras de grãos de café brasileiro, previamente identificados como A. ochraceus foram comparados com aquelas de A. westerdijkiae através das seqüências de nucleotídeos que codifica para a ß-tubulina. De fato, a maioria (84%) foi reconhecida como pertencente à espécie A. westerdijkiae. Devido ao fato que isolados de A. westerdijkiae freqüentemente produzem grandes quantidade de OA, desenvolveu-se um par de primers específico para detectar e quantificar esta espécie em grãos de café utilizando-se da técnica de PCR em tempo real. <em class="hilite">Oem> par de primers desenhado (Bt2Aw-F 5 TGATACCTTGGCGCTTGTGACG / Bt2Aw-R 5 CGGAAGCCTAAAAAATGAAGAG) permitiu a obtençã<em class="hilite">oem> de um amplicon de 347 pb em todos os isolados de A. westerdijkiae e nenhuma reaçã<em class="hilite">oem> cruzada foi observada usando DNA de A. ochraceus. A especificidade deste par de primers para amplificar A. westerdijkiae motivou a investigaçã<em class="hilite">oem> da possibilidade de seu uso para quantificar A. westerdijkiae em grãos de café. Após inoculaçã<em class="hilite">oem> e incubaçã<em class="hilite">oem> de grãos de café, extrações de DNA e ensaios de cfu foram realizadas em intervalos de 48 h. Embora uma x correspondência entre <em class="hilite">oem> número de genomas haplóides e cfu tenha sido observada, a estimativa dos números de cópia de genoma foi sempre maior do que os números de cfu. Utilizando diluições seriadas (10-1 a 10-9) do DNA extraído de grãos de café infectados, e incubados por 48 h, detectou-se um sinal positivo até a diluiçã<em class="hilite">oem> de 10-5, <em class="hilite">oem> que significa mais de 1 e menos de 10 cópias de genoma haplóide de A. westerdijkiae. Este valor também significa menos de 10 genomas haplóides por 0,1 grama de grãos de café. <em class="hilite">Oem> nível de sensibilidade do PCR em tempo real foi 100 vezes maior do que a técnica de cfu. Palavras-chaves: Aspergillus westerdijkiae, Aspergillus… <em>Advisors/Committee Members: Maria Helena Pelegrinelli Fungaro ., Claudia Barros Monteiro Vitorello., Luís Eduardo Aranha Camargo..em>

▼ The demand for methods to detect pathogens through DNA analysis has been growing in several areas. Currently the application of techniques such as polymerase chain reaction is not restricted to applications in human health, agribusiness presents several demands for this technology. However, the high cost of the commercially available molecular detection systems makes it difficult to insert these techniques into agribusiness. Thus, there is a need to develop alternatives that make DNA analysis technology feasible, mainly through cost reduction. The cost reduction of any process carried out at scale depends on efficient management tools. Analysis of the current scenario indicated that management tools are still scarce for the molecular biology field. In this context, the objective of this project was to develop a software for the management of the molecular analysis laboratory, in order to integrate the input, process and analysis management. For the development of the software we used programming languages and consolidated frameworks, such as Ruby, Python and Ruby on Rails. For the business modeling, the concepts of minimum viable product (MVP) and Business Model Canvas were approached. In this way the MOLBIT R system was developed, a WEB system capable of managing the inputs, sample and routines registration, reactions used and analysis results. All data is operated with the security, availability and redundancy offered by WEB systems. Added to this is the creation of a desktop software tool to aid the process of analyzing the samples and sending the results to the server whenever there is an internet connection. The validation of this prototype occurred in a company focused on agribusiness. By means of this validation it was possible to conclude that the MOLBIT R system offers the market a new management service, applied to the molecular analysis routine, which allows the manager to more accurately visualize the whole process and the decision making process more quickly. Through the application of the system it was possible to reduce costs both in relation to the purchase of material as well as reduction of losses, besides ensuring the traceability of the whole process. <em>Advisors/Committee Members: Lanza, Daniel Carlos Ferreira (advisor), 05372896663 (advisor).em>

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A estomatite aftosa recorrente (EAR) é a condiçã<em class="hilite">oem> inflamatória ulcerativa mais comum da mucosa bucal nã<em class="hilite">oem>-ceratinizada, possuindo etiologia ainda incerta e controvertida. Os vírus herpes simples 1 e 2 ( HSV-1 e 2) infectam liticamente <em class="hilite">oem> epitélio desta mucosa gerando manifestaçã<em class="hilite">oem> clínica semelhante a esta estomatite, porém em mucosa ceratinizada. Diante disso, <em class="hilite">oem> objetivo deste estudo foi verificar a presença de vírus herpes simples 1 e/ou 2 em úlceras de mucosa bucal nã<em class="hilite">oem>-ceratinizada de indivíduos imunocompetentes. Dezesseis pacientes foram avaliados na Policlínica de Odontologia da Universidade do Estado do Amazonas e serviç<em class="hilite">oem> particular, apresentando úlceras em mucosa nã<em class="hilite">oem> - ceratinizada bucal e faríngea ( um caso) , descartada a possibilidade de etiologia química, física ou doença imunossupressora de base. Foram coletados esfregaços do centro e da periferia da lesã<em class="hilite">oem> aftosa dos oito primeiros pacientes e dos últimos, além do raspado, 1 ml de amostra de saliva nã<em class="hilite">oem> estimulada presente na boca. Foi realizada Reaçã<em class="hilite">oem> em Cadeia de Polimerase ( PCR ) com iniciadores multi e específicos para cada vírus, após identificaçã<em class="hilite">oem> pela mesma técnica da presença de DNA genômico nas amostras, e em nenhuma destas, de úlcera foi encontrada partícula viral, ocorrendo , no entanto , amplificaçã<em class="hilite">oem> do fragmento de HSV-2 da amostra salivar de um dos pacientes que fora estudado isoladamente, em segundo momento . <em class="hilite">Oem> indivíduo positivo para a amostra ao sentir novamente os sintomas, identificou a á<em class="hilite">reaem> acometida em soalho bucal , em fase ainda vesicular e fora feita a coleta imediata do esfregaç<em class="hilite">oem> da lesã<em class="hilite">oem>, ulcerada a pouco tempo, e também salivar , ocorrendo pela metodologia apresentada, a amplificaçã<em class="hilite">oem> de material genético do vírus HSV- 2 na ferida coletada, nã<em class="hilite">oem> ocorrendo na de saliva . Concluiu-se com a pesquisa, que <em class="hilite">oem> HSV nã<em class="hilite">oem> foi identificado na maior parte dos pacientes estudados, excetuando <em class="hilite">oem> caso específico, cuja a coleta do material biológico da úlcera fora realizada em fase inicial da condiçã<em class="hilite">oem>, concluindo que <em class="hilite">oem> HSV-2, infectante comum de mucosas genitais pode, em alguns casos, estar presente e ser potencial fator etiológico das úlceras aftosas recorrentes da cavidade bucal.

The recurrent aphthous stomatitis (RAS) is the most common inflammatory ulcerative disorder of no keratinized oral mucous , whose etiology is still uncertain and controversial. The herpes simplex virus 1 and 2 (HSV-1 and 2) infect litically the mucous epithelium generating clinical manifestation similar to RAS but in keratinized mucous. That said, the goal of this study was to verify the presence of herpes simplex virus 1 and/or 2 in ulcers no keratinized oral mucous of immunocompetent individuals. Sixteen patients were evaluated in the Polyclinic of Dentistry of the University of the State of Amazonas and particular service, showing ulcers in the no keratinized oral mucous and pharyngeal (one case), excluding the possibility of chemical , physics or immunosuppressive disease etiology. Swabs were collected from the centre and the …

<em>Advisors/Committee Members: Garrido, Angela Delfina Bittencourt, 43705200291, http://lattes.cnpq.br/7821317409789400, Santos, Cristina Maria Borborema dos, http://lattes.cnpq.br/7512612117477966.em>

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A leishmaniose tegumentar é uma zoonose que ocorre endemicamente em 88 países, caracterizando-se como um grave problema de saúde pública nos países tropicais e subtropicais. Estima-se que <em class="hilite">oem> número de pessoas infectadas por Leishmania seja de cerca de 12 milhões e que ocorram entre 700 mil a 1,2 milhões de novos casos anualmente. <em class="hilite">Oem> Brasil apresenta a maior prevalência de leishmaniose tegumentar na América, sendo que já foram identificadas seis espécies como causadoras de leishmanise tegumentar: Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) lainsoni, Leishmania (Viannia) naiffi, Leishmania (Viannia) shawi. Apesar de termos diferentes espécies causadoras de leishmaniose tegumentar no Brasil e com diferentes formas clínicas, a discriminaçã<em class="hilite">oem> das espécies de Leishmania responsáveis por determinada lesã<em class="hilite">oem> ainda é um desafio. Utilizando as técnicas qPCR, HRM e PCR multiplex, com pares de oligonucleotídeos contruídos e direcionados para <em class="hilite">oem> gene alvo hsp70, propomos uma alternativa para os ensaios utilizados atualmente para a identificaçã<em class="hilite">oem> de Leishmania e diferenciaçã<em class="hilite">oem> dos subgêneros Leishmania e Viannia em cultura de promastigota. A identificaçã<em class="hilite">oem> do subgênero Leishmania obtida nos nossos resultados em amostras de cepas referência e em amostras de isolados de pacientes com suspeita de leishmaniose tegumentar atendidos no Instituto de Infectologia Emílio Ribas, correspondem ao obtido por PCR-RFLP direcionada para <em class="hilite">oem> alvo kDNA com a enzima de restriçã<em class="hilite">oem> HaeIII realizada num estudo anterior. No entanto, este estudo permitiu a identificaçã<em class="hilite">oem> do subgênero em apenas um passo, <em class="hilite">oem> que contribui para a reduçã<em class="hilite">oem> do tempo, custo e manuseio de amostras. Diante desses resultados, sugere-se a validaçã<em class="hilite">oem> da técnica em DNA de amostras de amastigotas de lesões tegumentares de pacientes diagnosticados com esta doença

The cutaneous leishmaniasis is a zoonotic disease that is endemic in 88 countries, characterized as a serious public health problem in tropical and subtropical countries. It is estimated that the number of people infected by Leishmania to be about 12 million, occurring between 700 thousand to 1.2 million new cases annually. Brazil has the highest prevalence of cutaneous leishmaniasis in America and six species have been identified as causes of cutaneous leishmaniasis: Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (V.) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (V.) naiffi, Leishmania (V.) shawi. Although we have different species that cause cutaneous leishmaniasis in Brazil and with different clinical forms, discrimination against Leishmania species responsible for certain injury is still a challenge. Using the techniques qPCR, HRM and multiplex PCR with oligonucleotide engineer to the target gene hsp70, propose an alternative to the currently used assays for Leishmania identification and Leishmania and Viannia subgenus differentiation in parasite promastigote culture. The identification of Leishmania subgenus obtained…

<em>Advisors/Committee Members: Lindoso, José Angelo Lauletta.em>

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Amebas de vida livre (AVL) do gênero Acanthamoeba estã<em class="hilite">oem> distribuídas mundialmente e habitam uma ampla variedade de nichos ambientais. Acanthamoeba pode ser considerada um importante veículo de patógenos humanos por abrigar inúmeras bactérias endossimbiontes. <em class="hilite">Oem> presente trabalho teve como objetivo caracterizar <em class="hilite">oem> potencial patogênico de 12 isolados de Acanthamoeba previamente isoladas de estojos de lentes de contato e ductos de ar condicionado usando testes de osmotolerância e termotolerância, bem como caracterizar e identificar a comunidade de endossimbiontes presentes, utilizando duas técnicas de biologia molecular, a PCR (Reaçã<em class="hilite">oem> em Cadeia da Polimerase) e DGGE (Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante). Dentre os isolados estudados ¼ destes, foram considerados potencialmente patogênicos a partir dos testes de osmotolerância e termotolerância. Todos os isolados quando submetidos à PCR demonstraram a presença de endossimbiontes, sendo que todos continham bactéria do gênero Pseudomonas spp. Nã<em class="hilite">oem> foi possível confirmar a presença de microorganismos da família Legionellaceae bem como da ordem Chlamydiales. A DGGE possibilitou caracterizar a diversidade bacteriana nos isolados de Acanthamoeba, entretanto a identificaçã<em class="hilite">oem> de bactérias através desta metodologia apresentou-se comprometida, sendo que apenas 2 espécies bacterianas, Paenibacillus glucanolyticus e Candidatus Protochlamydia amoebophila, foram identificadas, nos isolados A2 e A12 respectivamente. As demais bandas sequenciadas apresentaram similaridade para bactérias incultiváveis, sem que espécie ou gênero pudessem ser identificados. Os resultados deste primeiro estudo de identificaçã<em class="hilite">oem> e caracterizaçã<em class="hilite">oem> de endossimbiontes em isolados de Acanthamoeba oriundas da cidade de Porto Alegre/RS confirmam a presença de isolados de Acanthamoeba carreadoras de endossimbiontes e demonstram que diferentes populações bacterianas estã<em class="hilite">oem> internalizadas nessas amebas.

Free-living amoebae (AVL) of the genus Acanthamoeba are distributed worldwide and inhabit a wide variety of environmental niches. Acanthamoeba can be considered an important vehicle for human pathogens harbor numerous bacteria endosymbionts. This study aimed to characterize the pathogenic potential of Acanthamoeba isolates from 12 previously isolated from contact lens cases and air conditioning ducts using assessed by osmotolerance and temperature tolerance as well as identify and characterize the community of endosymbionts present, using two techniques molecular biology, PCR (Polymerase Chain Reaction) and DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). Among the isolates studied ¼ these were considered potentially pathogenic from tests osmotolerance and temperature tolerance. All strains when subjected to PCR demonstrated the presence of endosymbionts, all of which contained bacteria of the genus Pseudomonas spp. It was not possible to confirm the presence of microorganisms of family Legionellaceae and order Chlamydiales. The DGGE enabled characterization of bacterial diversity in the strains of Acanthamoeba,…

<em>Advisors/Committee Members: Rott, Marilise Brittes.em>

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<em class="hilite">Oem> presente estudo objetiva desenvolver um método diagnóstico espécie-específico para a infecçã<em class="hilite">oem> por Brucella ovis baseado em PCR e avaliar três testes sorológicos disponíveis, a IDGA utilizando 2 antígenos e a FC, para <em class="hilite">oem> diagnóstico desta enfermidade. Foram utilizadas 12 janelas de leitura (ORF) como sequências-alvo de amplificaçã<em class="hilite">oem>. Amostras de soro, sangue, sêmen, urina, lavado prepucial e órgãos de 9 carneiros experimentalmente infectados foram obtidas ao longo de 180 dias de infecçã<em class="hilite">oem>. Adicionalmente, amostras biológicas de 8 animais provenientes de rebanho livre da doença, além de 40 amostras de sêmen provenientes de rebanhos naturalmente infectados foram obtidas. <em class="hilite">Oem> método de PCR apresentou limite de detecçã<em class="hilite">oem> de 102, 10¹,100 UFC/mL em amostras de sêmen, urina e lavado prepucial, respectivamente. Valores semelhantes de sensibilidade e especificidade foram encontrados para <em class="hilite">oem> método de PCR quando comparado ao isolamento bacteriano para as amostras testadas. As IDGAs apresentaram valores de sensibilidade e especificidade semelhantes entre si e estatisticamente superiores à FC. Os resultados indicam que primeiro método de PCR espécieespecífico demonstrou ser eficiente para <em class="hilite">oem> diagnóstico da infecçã<em class="hilite">oem> por B. ovis em amostras biológicas de caniros infectados. Além disso, a IDGA deve ser preferida à FC para <em class="hilite">oem> diagnóstico desta enfermidade com os antígenos avaliados.

The goal of this study was to develop a PCR test targeting specific B. ovis genomic sequences to be applied in biological samples from rams and to evaluate three serological tests, AGID using two antigens and CF, available in for the diagnosis of ovine brucellosis. Specific primer pairs were designed targeting 12 open reading frames (ORF). Blood, serum, semen, urine, preputial wash, and organs samples were collected from experimentally infected rams through 180 days post infection. Moreover, biological samples from eight rams belonging to B. ovis-free flock as well as 40 semen samples from rams belonging to naturally infected flocks were obtained. The limit of detection of this PCR protocol was 102, 10¹,100 CFU/mL for semen, urine and prepucial wash samples, respectively. Similar sensibility and specificity values were obtained by this PCR method when compared to bacteriology using the biological samples. Both ID test presented similar sensitivity and specificity values and, both methods were statistically more efficient than CF test for the serological diagnosis of B. ovis infection. The results clearly indicate that this first specific PCR method is highly efficient for the diagnosis of B. ovis infection in biological samples from infected rams. Additionally, ID should be used, rather than CF, for the serological diagnosis of this disease with the antigens evaluated

<em>Advisors/Committee Members: Renato de Lima Santos, Renato de Lima Santos, Jane Megid, Andrey Pereira Lage.em>

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<em class="hilite">Oem> vírus da imunodeficiência felina (FVI) é um lentivírus causador de imunodeficiência em felinos domésticos. A infecçã<em class="hilite">oem> é caracterizada por progressivo declíneo de células T CD4+ circulantes, propiciando desta maneira <em class="hilite">oem> surgimento de infecções oportunistas. <em class="hilite">Oem> presente trabalho, estudando uma populaçã<em class="hilite">oem> de gatos capturados na rua de Belo Horizonte e mantidos em cativeiros, compreendeu um levantamento da ocorrência de gatos positivos para infecções pelos vírus da leucemia felina (FeLV) e da imunodeficiência felina (FIV), a relaçã<em class="hilite">oem> entre as alterações hematológicas e clínicas com os gatos soropositivos e a comparaçã<em class="hilite">oem> de duas técnicas de diagnósticos (ELISA e PCR) paro <em class="hilite">oem> FIV. Amostras de sangue periférico de 145 gatos foram testados pela reaçã<em class="hilite">oem> em cadeia da polimerase (PCR), empregando-se os iniciadores P-24-1 e P-24-2 que promovem a amplificaçã<em class="hilite">oem> e a detecçã<em class="hilite">oem> de parte do gene gag proviral em amostras de células mononucleares do sangue periférico. Quarenta amostras das 145 tambem foram testadas por um kit comercial de ensaio de imunoadsorçã<em class="hilite">oem> enzimática (ELISA SNAP® Combo FeLV/FIV). Os resultados mostraram que a ocorrência do FIV nesta populaçã<em class="hilite">oem> é de 4,14% pela PCR e que a do FeLV é de 32,5% pelo ELISA além de relatarem que apenas a emaciaçã<em class="hilite">oem>, nas alterações clínicas, apresenta associaçã<em class="hilite">oem> positiva com <em class="hilite">oem> FIV. Mostraram, ainda, que ambas as técnicas estudadas apresentam alinhamento elevados demonstrando serem úteis para uma triagem do FIV.

The feline immunodeficiency vírus (FIV) is a lentivirus that causes immunodeficiency in domestic cats. The disease is characterized by a prograssive decline of the number of circulating CD4+ T cells, leaving the animals susceptible to opportunistic infections. In this work, we determined the ocorrency of the FeLV and FIV infection in a colony of free-roaming cats cached on the streets of Belo Horizonte - Minas Gerais - Brazil - and kept in confinement and its relationship with hematological abnormalities and clinical alterations. Additionally we compared two methods of detection of the disease (ELISA and PCR). One hundred forty five samples of peripheral blood mononuclear cells were amplified by PCR with synthetic promers, P24-1 and P-24-2 corresponding to the fragment of gag proviral gene. Forty out the 145 samples collected were also tested in a commercial kit (ELISA - SNAP® Combo FeLV/FIV). The results have showed that the ocorrency of FIV in the studied colony was 4,14%, by PCR and the FeLV was 32,5%, by ELISA. Additionally our research pointed that only the weight loss in the clinical abnormalities parameters observations presented statistic positive relationship with FIV infectivity. We also found out that both methods present similar sensitivity and specificity.

<em>Advisors/Committee Members: Jenner Karlisson Pimenta dos Reis, Jenner Karlisson Pimenta dos Reis, Isabella Bias Fortes Ferraz, Mitika Kuribayashi Hagiwara, Romulo Cerqueira Leite.em>