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1. Ferreira, Soraia Nunes. Desenvolvimento de novos suportes cromatográficos para purificação do DNA plasmídeo.

Degree: 2014, RCAAP

Nos últimos anos, a aplicação de DNA plasmídeo (pDNA) em terapia génica ou vacinas de DNA tem-se revelado uma ferramenta com potencial aplicação no tratamento de inúmeras doenças. Uma vez que esta abordagem recorre a vetores não-virais, é mais segura em termos de ativação de oncogenes e apresenta uma diminuição de reações do sistema imunitário. Deste modo, a indústria farmacêutica procura obter pDNA em maiores quantidades e isento de contaminantes (RNA, DNA genómico, endotoxinas, proteínas). Uma técnica que permite purificar o pDNA é a cromatografia de afinidade (AC). Esta metodologia baseia-se em interações específicas entre ligandos e o pDNA, permitindo a eliminação de alguns passos de purificação. A utilização de aminoácidos como ligandos de afinidade revelou ser uma abordagem promissora para purificar ácidos nucleicos, pois baseia-se na bioespecificidade aminoácido-nucleótido. A L-histidina e a L-arginina permitiram isolar a isoforma superenrolada (sc) do pDNA, indicando a presença de interações específicas entre o pDNA e os aminoácidos. Neste trabalho são apresentados os resultados de três ligandos, a L-tirosina e os dipeptídeos L-tirosina-L-tirosina e L-tirosina-L-arginina. Os dipeptídeos foram sintetizados de acordo com o método clássico de síntese química, que envolve a proteção do grupo amina e do grupo carboxílico de cada aminoácido, e posterior formação da ligação peptídica e por fim desproteção usando TFA (ácido trifluoracético). De seguida, os ligandos foram imobilizados na Sepharose CL-6B através da ativação dos grupos epóxi com o reagente 1,4-butanediol diglicidil éter. O suporte foi caracterizado por HR-MAS (Ressonância Magnética de Alta Resolução de Ângulo Mágico) RMN. A técnica de STD-RMN (Diferença da Transferência de saturação por ressonância magnética nuclear) permitiu identificar os grupos preferenciais dos 5´-mononucleótidos que interagem com os suportes Sepharose-L-tirosina, Sepharose-Ltirosina- L-tirosina e Sepharose-L-tirosina-L-arginina. Utilizando a técnica de RPS (Ressonância Plasmónica de Superfície), foi analisada a afinidade de cada um dos ligandos em estudo em relação a cada uma das isoformas de pVAX1-LacZ a diferentes temperaturas (T=10°C e 25°C) e usando diferentes tampões (Tris-HCl 10 mM e Hepes ácido 10 mM). Desta forma, a utilização das técnicas STD-RMN e SPR permitiu fazer o screening das interações dos suportes-5’- mononucleótidos e determinar a afinidade do complexo ligando: pDNA, para futura aplicação em AC.

In the last years, the use of plasmid DNA (pDNA) in gene therapy or DNA vaccines has been proved to be a tool with potential application in the treatment of diseases. Since this approach uses non-viral vectors, it is safer in terms of oncogene activation and it presents a decrease of the immune system response. In this way, the pharmaceutical industry needs to obtain pDNA in larger quantities and free of contaminants (RNA, genomic DNA, endotoxins, proteins). A technique that allows purifying pDNA is affinity chromatography (AC). This method is based in specific…

Advisors/Committee Members: Cruz, Carla Patrícia Alves Freire Madeira, Sousa, Fani Pereira de.

Subjects/Keywords: Affinity Chromatography; L-Tyrosine; L-Tyrosine-L-Arginine; L-Tyrosine-L-Tyrosine; Plasmid Dna; Pvax1-Lacz; Spr; Std-Nmr; Domínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia:: Outras Engenharias e Tecnologias

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APA (6th Edition):

Ferreira, S. N. (2014). Desenvolvimento de novos suportes cromatográficos para purificação do DNA plasmídeo. (Thesis). RCAAP. Retrieved from https://www.rcaap.pt/detail.jsp?id=oai:ubibliorum.ubi.pt:10400.6/6098

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Chicago Manual of Style (16th Edition):

Ferreira, Soraia Nunes. “Desenvolvimento de novos suportes cromatográficos para purificação do DNA plasmídeo.” 2014. Thesis, RCAAP. Accessed January 18, 2021. https://www.rcaap.pt/detail.jsp?id=oai:ubibliorum.ubi.pt:10400.6/6098.

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MLA Handbook (7th Edition):

Ferreira, Soraia Nunes. “Desenvolvimento de novos suportes cromatográficos para purificação do DNA plasmídeo.” 2014. Web. 18 Jan 2021.

Vancouver:

Ferreira SN. Desenvolvimento de novos suportes cromatográficos para purificação do DNA plasmídeo. [Internet] [Thesis]. RCAAP; 2014. [cited 2021 Jan 18]. Available from: https://www.rcaap.pt/detail.jsp?id=oai:ubibliorum.ubi.pt:10400.6/6098.

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Council of Science Editors:

Ferreira SN. Desenvolvimento de novos suportes cromatográficos para purificação do DNA plasmídeo. [Thesis]. RCAAP; 2014. Available from: https://www.rcaap.pt/detail.jsp?id=oai:ubibliorum.ubi.pt:10400.6/6098

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