Orientadora: Profª Drª Rose Adele Monteiro

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica) . Defesa : Curitiba, 22/08/2019

Inclui referências: p. 63-66

Resumo: O Sistema de Secreção do Tipo VI (T6SS) é um aparato nanomolecular usado por espécies do filo Proteobacteria para a injeção de proteínas efetoras em células procariotas ou eucariotas. Os efetores injetados no interior de células-alvo podem ter atividade antibacteriana ou função de modular o hospedeiro. A bactéria promotora do crescimento vegetal Herbaspirillum seropedicae contêm dois agrupamentos gênicos homólogos ao T6SS que até o momento não foram caracterizados. Neste trabalho foi avaliado a função dos genes tagF1 e tssH2 durante a interação desta bactéria com milho. Para isso foram construídas as estirpes mutantes de H. seropedicae nesses genes. O primeiro gene é caracterizado em outras espécies como regulador póstraducional do T6SS. O segundo gene codifica uma ATPase que tem papel central no funcionamento desse sistema de secreção. Uma vez que o T6SS pode estar relacionado a competição bacteriana, as estirpes mutantes construídas foram testadas em ensaios de competição contra a estirpe selvagem in planta e em sistema planctônico. Em H. seropedicae, a mutação em tagF1 torna a estirpe mutante neste gene menos competitiva no processo de colonização do milho em relação a estirpe selvagem. A mutação em tssH2 torna a estirpe mutante neste gene menos competitiva durante a etapa de adesão às raízes de milho em relação a estirpe selvagem. Em sistema planctônico também é verificada a redução de competitividade das estirpes mutantes em comparação a selvagem. Os resultados indicam que os T6SS em H. seropedicae podem estar associados a manutenção da colonização do milho por esta bactéria benéfica a planta. Palavras-chave: Herbaspirillum seropedicae. Sistema de secreção do tipo VI. Competição bacteriana em milho.

The Type VI Secretion System (T6SS) is a nanomolecular apparatus used by bacteria species of the Proteobacteria phylum for injecting effector proteins in prokaryote or eukaryote host cells. The injected effectors can modulate the cellular processes of the host or act as anti-microbe factors. The plant growth promoting bacteria Herbaspirillum seropedicae contains two gene clusters homologous to the T6SS and has not been characterized until the present time. In this work we evaluated the function of the tagF1 and tssH2 genes in the plant-bacteria interaction with maize. For such, mutant strains of the mentioned genes were obtained in H. seropedicae. The tagF1 gene is characterized in other species as post-translational regulator of the T6SS. The tssH2 gene codes for an ATPase which has a central role in the T6SS operation. The mutant strains were tested in competition assays against the wild-type strain in planktonic and in planta systems due of the possible involvement of T6SS in bacteria competition. The tagF1 mutation in H. seropedicae results in a less…

Orientadores: Sônia Maria Alves Bueno, Síndélia Freitas Azzoni

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química

Made available in DSpace on 2018-08-24T06:02:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Radke_VanessaSoraiaCortezdeOliveira_M.pdf: 2121610 bytes, checksum: edb8e8ef74060659b8f0672335ee64c1 (MD5) Previous issue date: 2013

Resumo: Emergindo como alvo de estudos para fins terapêuticos, acompanhado de novas tecnologias a fim de explorar todo seu potencial e especificidade, o DNA plasmidial (pDNA) tem demonstrando um importante papel na nova geração de vacinas e terapia gênica como um vetor não viral. No entanto, há grandes desafios para atender altas demandas de preparações de vetores plasmidiais (pDNA), seguindo rigorosos padrões das agências reguladoras internacionais. As dificuldades sobretudo, são encontradas no downstream processing, com alto custo e operações não apropriadas para uso em larga escala e nos longos e caros kits comerciais, este último utilizado para ensaios pré-clínicos. Almejando, explorar as características do DNA plasmidial e tornar cada vez mais factível sua produção e purificação, esta pesquisa teve como foco o desenvolvimento de um protocolo para obtenção de pDNA para aplicação em ensaios in vitro com possível escalonamento para larga escala. Para tanto, buscou-se adsorventes seletivos para a etapa de pré-purificação de pDNA diretamente do lisado celular. O trabalho foi baseado em géis de agarose (S) com ligantes de natureza hidrofóbica e tiofílica, visando testar o comportamento do pDNA em cromatografia negativa e cromatografia tiofílica aromática. Os ligantes eleitos para investigação foram os aminoácidos de natureza hidrofóbica, fenilalanina (Phe) e D-triptofano (T), ambos imobilizados covalentemente em Sepharose 6B®, e um tiofílico, a mercaptopiridina. O tampão de adsorção, e os sais adicionados, foram escolhidos com o objetivo de favorecer um ambiente hidrofóbico, de tal forma que a interação das biomoléculas presentes no lisado celular com os ligantes fosse favorecida. Os sais utilizados para tal foram citrato de sódio 1,5 mol/L, fosfato de potássio 2,0 mol/L e sulfato de amônio 1,5 mol/L. Os resultados obtidos com os sistemas fenilalanina-agarose e D-triptofano-agarose demonstraram seu potencial na retenção de moléculas de RNA e na remoção de grande parte de endotoxinas e proteínas. O sistema adsortivo mercaptopiridina-agarose, permitiu uma urificação bastante satisfatória, com remoção total de endotoxinas e relevante recuperação de pDNA.

Coming up as a target for therapeutic studies, together with new technologies in order to explore its potential use and specificity, plasmid DNA (pDNA) has demonstrated an important role in new generation of vaccines and gene therapy as a non-viral vector. However, there are huge challenges to meet high demands of plasmid vectors (pDNA) preparation, following strict standards of international regulatory agencies. Its difficulties are found in downstream processing, with high cost operations which…

Orientadores: Adriano Rodrigues Azzoni, Anete Pereira de Souza

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Made available in DSpace on 2018-08-24T06:15:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Toledo_MarceloAugustoSzymanskide_D.pdf: 15660446 bytes, checksum: 8e64c5b4455cf458c2eb0d9b8e030e70 (MD5) Previous issue date: 2013

Resumo: Apesar de seguros e simples de produzir, o uso de vetores não virais como o DNA plasmidial (DNAp) em estudos de terapia gênica e vacinação por DNA tem sido limitado pela baixa eficiência quando comparados aos vetores virais. Essa limitação provém principalmente da reduzida capacidade de superar as barreiras físicas, enzimáticas e difusionais encontradas durante o tráfego intracelular para o interior do núcleo das células alvo. Dentro deste contexto, o presente trabalho demonstra a utilização de cadeias leves modificadas de Dineína (Lc8 e Rp3) como vetores não-virais de entrega gênica. A escolha de cadeias leves de Dineína justifica-se pela possibilidade de utilizar o transporte retrógrado celular mediado por complexos motores de Dineína para facilitar o tráfego de material genético exógeno através do citoplasma em direção à periferia nuclear. Através da adição de pequenos domínios peptídicos, ricos em aminoácidos polares positivos (arginina e lisina), ao N-terminal de cadeias leves de Dineína foi possível conferir a estas proteínas a habilidade de interagir com material genético condensando-o em partículas. Ensaios de transfecção demonstraram que tais partículas apresentam elevada eficiência de entrega do material genético exógeno ao núcleo de células HeLa, eficiência esta superior àquela apresentada pelo peptídeo protamina, amplamente estudado como vetor não-viral de entrega gênica. A formação de complexos ternários utilizando-se DNA plasmidial, cadeias leves de Dineína modificadas e lipídios catiônicos apresentou eficiência de entrega superior àquelas apresentadas na ausência do lipídio. Adicionalmente, complexos de entrega formados apenas com DNA plasmidial e cadeias leves de Dineína modificadas apresentaram baixo efeito citotóxico em células HeLa, característica esta de grande relevância uma vez que a toxicidade dos vetores de entrega gênica atua como importante fator limitante em sua aplicação clínica. O mecanismo envolvido no processo de entrega gênica mediado por cadeias leves de Dineína modificadas também foi estudado, podendo ser observado que (1) a entrada dos complexos de entrega na célula é altamente dependente do processo de endocitose, (2) a eficiência de entrega observada depende da rede de microtúbulos e (3) parte significativa dos complexos de entrega é degradada na via de endossoma/lisossomo celular. Os vetores não-virais de entrega gênica descritos no presente estudo associam elevada eficiência de transfecção, baixa toxicidade celular e relativo baixo custo de produção, uma vez que as cadeias leves de Dineína recombinantes são produzidas em sistema heterólogo utilizando-se Escherichia coli. Ressalta-se ainda a possibilidade de adição de…

Orientadores: Marco Antonio Garcia de Carvalho, Marco Aurelio Takita

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Tecnologia

Made available in DSpace on 2018-08-26T15:21:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Palma_EloaCarolinaNavaCardoso_M.pdf: 2004126 bytes, checksum: 618ad5da7f91e98f63bfdc0a41812387 (MD5) Previous issue date: 2014

Resumo: O surgimento dos sequenciadores automáticos de DNA por volta dos anos 1990 fez com que a quantidade de sequências e informações a serem analisadas aumentasse exponencialmente. Sendo assim, os recursos computacionais são cada vez mais exigidos em diversas tarefas de armazenamento desses dados. Para atender essas e outras necessidades, surgiu a Bioinformática, que engloba diversas áreas como Ciência da Computação, Matemática, Estatística, e a Biologia Molecular. Neste trabalho, desenvolvemos um software denominado Biodonut, que consiste em manipular plasmídeos utilizando visualização 2D e 3D. Biodonut é um produto de software de plataforma web, open source para que os pesquisadores possam manipular plasmídeos in silico, visualizando em formato 2D e 3D e possibilitando uma análise diferenciada das áreas julgadas importantes. A base de dados utilizada no software é o GenBank, por ser mundialmente conhecida e respeitada. Uma comparação com dois importantes softwares da área foi efetuada e é apresentada neste trabalho. Os resultados apontam que usar Biodonut é vantajoso em relação os outros dois softwares

The advent of automated DNA sequencers around 1990s led to the amount of information sequences to be analyzed and increased exponentially. Thus, computing resources are increasingly demanded in various tasks such data storage. To meet these and other needs arose Bioinformatics, encompassing diverse areas as Computer Science, Mathematics, Statistics, and Molecular Biology. In this work, we developed a software called Biodonut, which involves manipulating plasmids using 2D and 3D visualization. Biodonut is a product of web software platform, open source so that researchers can manipulate plasmids in silico, visualizing 2D and 3D format, enabling a differentiated analysis of the areas deemed important. The database software is used in GenBank, to be globally known and respected. A comparison with two important software of the area was conducted and is presented in this paper. The results show that using Biodonut is advantageous over the other two softwares

Mestrado

Tecnologia e Inovação

Mestra em Tecnologia

Orientador: Maria Luiza Moretti

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas

Made available in DSpace on 2018-08-13T02:52:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kuboyama_RogerioHakio_D.pdf: 1899697 bytes, checksum: 863826cd141f1e5f89eb90d272c0c330 (MD5) Previous issue date: 2009

Resumo: Os objetivos do presente estudo, conduzido retrospectivamente, utilizando cepas isoladas de espécimens clínicos obtidos de pacientes internados em dois hospitais brasileiros entre fevereiro de 2001 e junho de 2004 foram descrever: a presença de cepas de Klebsiella pneumoniae produtoras de beta-lactamases de espectro estendido (ESBLs), o melhor método e o substrato preferido para os testes de triagem e de confirmação da produção de ESBLs, a relação epidemiológica das cepas obtidas e analisar os fatores de risco para infecção por cepa produtora de ESBLs. A fim de investigar a relação genética das cepas, foram utilizadas as análises do DNA plasmidial e do DNA cromossômico por eletroforese em campo pulsátil (PFGE). Um total de 89 cepas de K. pneumoniae foram coletadas de diversos sítios anatômicos. Os espécimens clínicos mais comuns dos quais foram isoladas cepas produtoras foram urina (12,4%) e sangue (10,1%). Utilizando os critérios estabelecidos pelo CLSI (testes de triagem), 35 (39,3%) cepas de K. pneumoniae foram consideradas possivelmente produtoras de ESBLs, enquanto que o teste de aproximação de discos (DDAT) revelou distorções características nas zonas de inibição produzidas pela molécula do clavulanato em 96, 62,5, 50, 18,8 e 12,5% das cepas ao redor dos discos contendo aztreonam, cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona e cefpodoxima, respectivamente. Das 89 cepas, 32 (36%) foram consideradas produtoras de ESBLs baseadas no teste confirmatório pelo método Oxoid de discos-combinados. O disco contendo cefotaxima foi capaz de confirmar 100 % dos produtores de ESBLs enquanto que o disco contendo ceftazidima deixou de confirmar 2 cepas produtoras. Dez e 32 diferentes perfis plasmidiais foram observados dentre as cepas de K. pneumoniae produtoras e não produtoras, respectivamente. A PFGE demonstrou melhor poder discriminatório fornecendo 15 e 55 perfis de DNA cromossômico dentre as cepas ESBLs-positivas e ESBLs-negativas, respectivamente. Da análise univariada, as variáveis significativamente associadas com infecção por cepas de K. pneumoniae produtoras de ESBLs foram: uso de cefalosporinas de quarta geração, de lincosamida, de carbapenêmicos, de glicopeptídeos, cirurgia recente, traqueostomia, idade, dias em uso de lincosamida, dias em uso de glicopeptídeos, número total de antibióticos e duração da terapia antimicrobiana. Ao realizar a análise multivariada, utilizando um modelo de regressão logística que incluía as variáveis estatisticamente significantes da análise univariada (P < 0,05), número total de antibióticos permaneceu como única variável independente para infecção por cepa de K. pneumoniae produtora de ESBLs (OR, 1,60; IC95%, 1,194-2,145.; P = 0,0017). Os dados obtidos revelam: uma…

Orientadores: Everson Alves Miranda, Adriano Rodrigues Azzoni

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química

Made available in DSpace on 2018-08-18T15:34:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bonturi_Nemailla_M.pdf: 2076232 bytes, checksum: e3f4e56f400891ab77fe029e0c1f0899 (MD5) Previous issue date: 2011

Resumo: O número de estudos em terapia gênica com vetores plasmídiais (pDNA) têm aumentado nestes últimos anos. Como resultado, a demanda para preparações de pDNA em conformidade com as recomendações das agências reguladoras (EMEA, FDA) também aumentou. O DNA plasmidial é frequentemente obtido através da fermentação de Escherichia coli transformada e purificada por uma série de operações unitárias, incluindo a cromatografia. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um processo cromatográfico para a recuperação e purificação do pDNA superenovelado (sc pDNA) a partir do lisado neutralizado. Os ligantes fenil (hidrofóbico) e mercaptopirimidina (tiofílico) foram imobilizados em matrizes de agarose e celulose. A seletividade destes ligantes para com o sc pDNA foi determinada através de estudos de adsorção utilizando citrato de sódio 1,5 mol/L e fosfato de potássio 2,0 mol/L como tampões de adsorção. A cromatografia com o adsorvente fenil-agarose e o citrato de sódio 1,5 mol/L permitiu recuperar 58% do pDNA sem contaminação por gDNA, proteínas e endotoxinas, sendo uma alternativa potencial para a recuperação primária do sc pDNA. O resultado mais promissor foi obtido com a cromatografia com o adsorvente mercaptopirimidina-agarose e fosfato de potássio 2,0 mol/L como tampão de adsorção. Este sistema tampão de adsorção/adsorvente permitiu a obtenção de pDNA com 100% de pureza e dentro das recomendações das agências reguladoras no tocante à contaminação por RNA e endotoxinas. Assim, este trabalho lançou as bases para o desenvolvimento de dois métodos cromatográficos para a recuperação primária ou purificação de pDNA diretamente do lisado neutralizado, ambos potencialmente aplicáveis em larga escala

The number of studies in gene therapy with plasmid vectors (pDNA) has witnessed an increase in the recent years. As result the demand for preparations of pDNA in compliance with recommendations of the regulatory agencies (EMEA, FDA) has also increased. Plasmid DNA is oftenly obtained through fermentation of transformed Escherichia coli and purified by a series of unit operations, including chromatography. This work aimed the development of a chromatographic process for the recovery and purification of supercolied pDNA (sc pDNA) directly from neutralized cell lysate. Phenyl (hydrophobic) and mercaptopyrimidine (thiophilic) molecules immobilized in agarose and cellulose matrices were the ligands used to capture the pDNA. Their selectivity towards sc pDNA was evaluated through adsorption studies using sodium citrate 1.5 mol/L and potassium phosphate 2.0 mol/L as the adsorption buffers. The chromatography with the adsorbent phenyl-agarose and sodium citrate 1.5 mol/L was…

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-04-19Bitstream added on 2014-06-13T19:43:15Z : No. of bitstreams: 1 tansini_a_dr_arafcf.pdf: 666076 bytes, checksum: 4a336ba4a2f0d99a602646cc539929be (MD5)

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Universidade Estadual Paulista (UNESP)

A infecção por Y. pseudotuberculosis é uma causa de doenças intestinais e extraintestinais. A resolução da infecção está relacionada à ativação de células Th1, entretanto, pouco se conhece sobre a influência de outras subpopulações de linfócitos T, como Th17 e Treg, na regulação dessa infecção. Células dendríticas são capazes de orientar a resposta imune adaptativa através da produção de citocinas e apresentação de antígenos às células T, tornando essas células essenciais na ativação e diferenciação de linfócitos T. Desse modo, o presente trabalho avaliou o papel de distintas subpopulações de linfócitos T e a influência de células dendríticas no desenvolvimento da resposta imune contra a infecção por Y. pseudotuberculosis. Para tanto, foram avaliadas as subpopulações de linfócitos T CD4+, CD8+ e Foxp3+, presentes durante a infecção por Y. pseudotuberculosis e amostras bacterianas mutantes para fatores de virulência Yops, bem como a expressão de citocinas intracelulares (IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α e TGF-β) por estas células. O papel de linfócitos Treg e Th17 no controle da bactéria foi analisado por meio de ensaio de depleção de células CD25+ e neutralização de IL-17. Além disso, a influência de células dendríticas na modulação da resposta imune contra Y. pseudotuberculosis foi estudada através da determinação da produção de citocinas (IL-6, IL-12, IL-10, IL-23, TNF-α e TGF-β) e co-cultivo com linfócitos T obtidos de animais imunizados com antígenos de Y. pseudotuberculosis. Os resultados mostraram redução na produção de citocinas pró-inflamatórias por células dendríticas infectadas com a amostra bacteriana portadora do plasmídeo de virulência, em ambas as linhagens de camundongos estudadas...

Y. pseudotuberculosis infection is a cause of intestinal and extraintestinal diseases. Infection resolution is related to the activation of Th1 cells, however, little is known about the influence of other T cells subsets, like Th17 and Treg, in the control of this infection. Dendritic cells are capable of directing the adaptive immune response by producing cytokines and presenting antigens to T cells, making them essential to T lymphocytes activation and differentiation. Thus, this study evaluated the role of different T lymphocytes subsets and the influence of dendritic cells on the development of the immune response against Y. pseudotuberculosis infection. Here, we evaluated the T cells subsets CD4+, CD8+ and Foxp3+, present during Y. pseudotuberculosis infection and mutant samples bacterial virulence factors, and also the intracellular expression of cytokines (IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α and TGF-β) by these cells. The role of…

Made available in DSpace on 2015-06-17T19:33:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-11. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:48:23Z : No. of bitstreams: 1 000832029.pdf: 1345027 bytes, checksum: 6207079d0ab94cde1a6d3a7db40846f6 (MD5)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Paracoccidiodomicose (PCM) é uma micose sistêmica endêmica na América Latina, de alta prevalência no Brasil, que tem como agente etiológico os fungos dimórficos do gênero Paracoccidioides, P. brasiliensis e P. lutzii. No processo de infecção as adesinas, substâncias sintetizadas por estes fungos que se ligam a matriz extracelular, são importantes fatores de virulência para o estabelecimento da infecção. A proteína de 30kDa, pertencente a família de proteínas 14-3-3, se destaca no processo adesivo deste fungo. As proteínas 14-3-3 são uma família de proteínas presentes em todas as células eucariotas e possuem múltiplas funções. Em P. brasiliensis, a proteína 14-3-3Pb, liga-se a laminina, principal componente da matriz extracelular das células hospedeiras, e durante a infecção sua expressão é aumentada. Com o intuito de compreender melhor a função desta proteína o objetivo deste estudo foi realizar a análise funcional da 14-3-3Pb através da obtenção de um homólogo funcional em S. cerevisiae e análise do anticorpo monoclonal anti-14-3-3Pb. S. cerevisiae foi escolhida como modelo de estudo por ser uma levedura amplamente utilizada na pesquisa genética, ao contrário de P. brasiliensis, e por possuir duas isoformas de 14-3-3, Bmh1p e Bmh2p, com alta identidade com 14-3-3Pb Para obtenção do homólogo funcional, foi realizada a transformação do vetor pYES-14-3-3Pb em S. cerevisiae. A partir da obtenção dos transformantes a avaliação da complementação foi realizada e foi observado uma complementação parcial das proteínas Bmh1p e Bmh2p por 14-3-3Pb. Ainda foram realizados teste de sensibilidade aos antifúngicos e a derivados semissintéticos do ácido gálico, onde foi possível observar um aumento da sensibilidade das linhagens com nocaute para os genes BMH1 e BMH2, S. cerevisiae Δbmh1 e Δbmh2, quando comparado à linhagem selvagem. A análise do anticorpo monoclonal foi realizada através de ensaio...

Paracoccidioidomycosis (PCM) a systemic mycosis endemic in Latin America, with high prevalence in Brazil, has as etiological agent dimorphic fungi Paracoccidioides spp., P. brasiliensis e P. lutzii. During the infection process the adhesins, substances synthetized by fungi that interacts with host's extracellular matrix (ECM), are important virulence factors for the establishment of infection. A 30kDa protein that belongs to 14-3-3 proteins family stands out in the adhesion process of this fungus. The 14-3-3 proteins are present in all eukaryotic cells and play multiple functions. In P. brasiliensis, the 14-3-3Pb protein binds to lamin, the major component of ECM from host cells, and during the infection the expression is increased. In order…

Exportado OPUS

Made available in DSpace on 2019-08-13T18:32:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_final_060814_pdf.pdf: 2523945 bytes, checksum: 412a64ce78884b17d17eca22843d6084 (MD5) Previous issue date: 14

O uso de bactérias como veículos para a entrega de plasmídeos vacinais por via das mucosas constitui uma estratégia de vacinação promissora. Neste contexto, bactérias patogênicas atenuadas como Shigella, Yersinia, Listeria e Salmonella vêm sendo utilizadas para a entrega de plasmídeos vacinais às células mamíferas, embora apresentem risco de reversão ao seu fenótipo patogênico. Visando contornar este problema, a utilização de bactérias não patogênicas, tais como as Bactérias Lácticas (BL), vem sendo proposta. Dentro do grupo das BL, Lactococcus lactis vem sendo extensivamente utilizado para a produção e entrega de antígenos e citocinas em nível de mucosas. Estudos envolvendo esta bactéria têm também focado em sua utiilização como veículo para entrega de vacinas gênicas, sendo desenvolvidas linhagens invasivas de L. lactis para aumentar a eficiência de entrega das referidas vacinas às células do hospedeiro. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um plasmídeo replicativo em L. lactis, contendo um cassete de expressão eucariótica, o pValac (Vaccination usig lactic acid bacteria). Assim, o uso de linhagens invasivas de L. lactis para a entrega do vetor pValac expressando o antígeno Ag85A de M. tuberculosis, poderia representar uma nova estratégia para o controle da tuberculose. Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi a construção do plasmídeo vacinal pValac:Ag85A e a verificação de sua funcionalidade in vitro, utilizando células eucarióticas da linhagem CHO (Chinese Hamster Ovary), bem como sua clonagem na linhagem invasiva L. lactis FnBPA+, gerando assim, a linhagem L. lactis FnBPA+ (pValac:Ag85A). Esta linhagem, por sua vez, foi utilizada em experimentos de imunização de camundongos C57BL/6 e as respostas imunes humoral e celular, geradas pela mesma, foram avaliadas. Como um todo, observou-se uma polarização da resposta imune para o padrão Th1, nos animais imunizados com a referida linhagem em relação aos animais dos grupos controles. Além disso, observou-se a produção das imunoglobulinas IgG e sIgA nas mucosas, especificamente na mucosa respiratória. Em suma, este projeto constitui um primeiro passo rumo à validação da eficácia e efetividade de novas vacinas gênicas baseadas em bactérias lácticas geneticamente modificadas, por via de administração em mucosas.

Using bacteria as a vehicle for orally delivering vaccines plasmids is considered a promissing vaccination strategy. Thus, attenuated pathogenic bacteria, such as Shigella, Yersinia, Listeria and Salmonella are being used for delivering plasmids of vaccine type to mammal cells. However, there is a risk of reversing to its wild phenotype. In order to counteract this problem, we propose the use of non pathogenic bacteria, as lactic bacteria (BL). Within the group of lactic bacteria, the Lactococcus lactis is deemed as a model microorganism, which is…

Exportado OPUS

Made available in DSpace on 2019-08-11T08:24:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta_ao_final_vanessa_pdf.pdf: 4847471 bytes, checksum: 9b97260bb9b268fd147df853dfa228ba (MD5) Previous issue date: 16

O uso de bactérias como veículos para a entrega de plasmídeos vacinais pela rota oral constitui uma estratégia de vacinação promissora contra diversas doenças infecciosas. Para isto, bactérias patogênicas atenuadas como Shigella, Listeria e Salmonella vêm sendo utilizadas, ainda que as mesmas apresentem risco de reversão ao seu fenótipo selvagem. Sendo assim, a utilização de bactérias não patogênicas poderia constituir uma alternativa mais segura para este propósito. Lactococcus lactis é uma bactéria láctica modelo considerada GRAS (Generally Recognized As Safe) que vem sendo extensivamente utilizada para a produção e entrega de antígenos e citocinas ao nível de mucosas. Assim, L. lactis pode representar uma alternativa para a entrega de plasmídeos vacinais em relação aos patógenos atenuados, ainda que o mesmo não tenha capacidade invasiva. Neste contexto, foram construídas linhagens de L. lactis invasivas (L. lactis FnBPA, Innocentin et al., 2009) e também um plasmídeo replicativo em L. lactis, contendo um cassete de expressão eucariótica (pValac, Guimarães et al., 2009). Assim, a utilização de uma linhagem invasiva de L. lactis contendo o vetor pValac para a expressão eucariótica do antígeno ESAT-6 (6-kDa Early Secreted Antigenic Target) de Mycobacterium tuberculosis, pode vir a ser uma nova estratégia para o controle da tuberculose; uma doença infecto-contagiosa que atinge 1/3 da população mundial na forma latente. Desta forma, este trabalho teve como objetivo a construção do plasmídeo vacinal pValac:ESAT-6 e verificação de sua funcionalidade, in vitro, assim como a clonagem na linhagem invasiva de L. lactis para sua utilização como uma via de entrega oral de vacinas gênicas. A seqüência codificadora de ESAT-6 foi isolada por PCR a partir do DNA genômico de M. tuberculosis linhagem H37Rv para clonagem no vetor Zero Blunt® TOPO® e posteriormente no vetor pValac. A construção final, pValac:ESAT-6, foi primeiramente obtida em Escherichia coli TG1. Para a avaliação da funcionalidade do plasmídeo, células da linhagem CHO (Chinese Hamster Ovary) foram transfectadas com o plasmídeo pValac:ESAT-6 e a expressão de ESAT-6 foi avaliada por RT-PCR, Western blotting e Imunocitoquímica, sendo, a funcionalidade do plasmídeo pValac:ESAT-6, assim confirmada. Por fim, o plasmídeo pValac:ESAT-6 foi transformado na linhagem invasiva de L. lactis, gerando a linhagem L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6). Enfim, este trabalho constitui um primeiro passo rumo à validação da eficácia e efetividade de novas vacinas gênicas baseadas em bactérias lácticas geneticamente modificadas, por via de administração oral em mucosas; o que também poderá fornecer informações valiosas para a pesquisa e o desenvolvimento de vacinas contra outros patógenos.

The use of bacteria as vehicles for the delivery of vaccine plasmids by oral route…