▼ Com o objetivo de avaliar a composição gravimétrica e investigar o provável risco associado aos resíduos gerados em serviços de saúde odontológicos, foram coletados resíduos gerados durante 24 horas de trabalho, em três instituições da Odontologia. Para a caracterização dos resíduos e sua avaliação microbiológica, foram realizadas coletas, nos tempos de zero, 24 e 48 horas a partir da geração. Os resíduos foram pesados, separados, e a porção considerada potencialmente infectante analisada. A equipe envolvida na pesagem e separação dos resíduos recebeu treinamento prévio e estava devidamente vacinada. Os valores médios de resíduos gerados foram 82,8, 51,5 e 39,6 Kg/d, para a instituição de Ensino Privada, de Ensino Público e o Serviço Público, respectivamente. As taxas de geração dos resíduos infectantes e potencialmente infectantes foram, respectivamente, de 12,0, 11,5, e 15,1 Kg/d e, dos não infectantes, de 35,5, 20,5 e 25,6 Kg/d, para a Instituição de Ensino Privada, o Serviço Público e a de Ensino Público. A taxa de geração de resíduos infectantes e potencialmente infectantes foi mais elevada na Instituição Pública de ensino e, na Instituição Privada, as de resíduos não infectantes e semelhantes aos domésticos. Os valores de pH do líquido lixiviado a partir das amostras de resíduos não apresentaram diferenças estatisticamente significativas, nos tempos de 0, 24 e 48 horas, dentro de uma mesma instituição ou quando foram comparados os valores médios obtidos nas três instituições. A partir do líquido lixiviado, foram recuperados diferentes tipos microbianos, em proporções distintas. O grupo microbiano mais frequentemente isolado foi o de cocos Gram positivos, distribuídos em coagulase negativos (203); Staphylococcus aureus (26), Enterococcus faecium e E. faecalis (55); Aerococcus viridans (26), amostras sugestivas de pertencer ao gênero Micrococcus (23), Streptococcus spp. (31), Kocuria kristinae (03) e Rothia dentocariosa (01), seguido dos bastonetes Gram negativos anaeróbios facultativos (357). Neste grupo, a espécie predominante foi a Stenotrophomonas maltophilia (63). Os bastonetes Gram positivos anaeróbios facultativos corresponderam ao terceiro grupo, com 39 amostras, seguidos por leveduras (17), cocos Gram negativos (03) e os anaeróbios obrigatórios (02). Foi observada uma alta taxa de resistência à ampicilina entre os bastonetes Gram-negativos (59,4%) e os cocos Gram-positivos (44,4%). Para outros antimicrobianos também se observou resistência neste grupo bacteriano, destacando-se as drogas: aztreonam (47,7%), cefotaxima (47,4%),ceftriaxona (43,7%), cefazolina (43,7%) e ticarcilina- ácido clavulânico (38,2%). Entre os cocos Gram-positivos, a maior taxa de resistência foi para a penicilina (45,0%), seguida de ampicilina, eritromicina (27,2%) e tetraciclina (22,0%). As duas espécies de anaeróbios obrigatórios isoladas foram sensíveis a todos os sete antimicrobianos testados contra este grupo, exceto Propionibacterium acnes que se mostrou resistente ao metronidazol (MIC >128 mg/l), como esperado (resistência… Advisors/Committee Members: Luiz de Macêdo Farias, Luiz de Macêdo Farias, Maria Auxiliadora R de Carvalho, Simone Goncalves dos Santos, João Alberto Ferreira, Cristina Rossi Nakayama, Eduardo Osorio Cisalpino, Isabela Almeida Pordeus, Vera Lucia dos Santos.

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O gênero Paracoccidioides é agente da paracoccidioidomicose, micose sistêmica de distribuição restrita à América Latina. O polimorfismo genético entre os isolados de Paracoccidioides tem sido extensamente demonstrado por diferentes autores, através de diversas técnicas moleculares. Trabalhos recentes revelaram a existência de duas espécies, P. lutzii e P. brasiliensis, sendo a primeira originalmente caracterizada como uma espécie críptica denominada Pb01-like e a última constituída de três espécies crípticas, denominadas S1, PS2 e PS3. Vários tipos de marcadores moleculares vem sendo propostos para a caracterização de espécies crípticas no gênero Paracoccidioides. Entretanto, a maioria despende tempo e emprega técnicas bastante laboriosas e/ou caras. Elementos transponíveis tem sido usados no conhecimento da estrutura genética de fungos patogênicos, auxiliando na definição de grupos filogeneticamente relacionados e de importância epidemiológica. Um estudo recente no genoma de Paracoccidioides revelou a presença de oito famílias de transposons de DNA, denominadas TremA-H. Os elementos Trem estão distribuídos de forma desigual no genoma de isolados representativos de três espécies crípticas de Paracoccidioides (P. lutzii; PS2 e S1): TremC e H são encontrados em todas as espécies; TremA, B e F, nas espécies crípticas PS2 e S1; TremD foi detectado apenas em S1 e TremE somente em P. lutzii. Este trabalho relata o emprego de reações de amplificação em cadeia da polimerase (PCR) para avaliar a utilidade de três marcadores moleculares na discriminação de espécies crípticas de Paracoccidioides: 1) par de iniciadores destinados à região de indel do gene hsp70; 2) marcadores microssatélites de DNA; 3) Trem A-H. Foram estudados 48 isolados de Paracoccidioides, sendo trinta previamente classificados segundo a espécie críptica (10 de P. lutzii, 15 de S1, 3 de PS2 e 2 de PS3). 14 isolados puderam ser classificados como P. lutzii por meio do uso dos iniciadores dirigidos ao indel do gene hsp70, sendo os demais 34 isolados classificados como P. brasiliensis. Os marcadores microssatélites utilizados não conseguiram discriminar os isolados entre as três espécies crípticas de P. brasiliensis. Os resultados obtidos pelo uso da PCR para detecção de elementos TremA-H mostram que TremA, B, F e G são encontrados apenas em P. brasiliensis (S1, PS2 e PS3); TremE está presente apenas em P. lutzii; TremC e H estão presentes em P. lutzii e P. brasiliensis (S1, PS2 e PS3). É interessante ressaltar que em P. brasiliensis, a amplificação de TremC e TremH mostrou um padrão de duas bandas enquanto que em P. lutzii, observou-se apenas uma banda de aproximadamente 2 kb. Em isolados PS3, TremD mostra um padrão de três bandas. Estes resultados confirmam que os padrões de amplificação observados para os oito elementos TremA-H e seu padrão esperado de bandas, podem ser úteis como marcadores moleculares espécie-específicos no gênero Paracoccidioides.

The genus Paracoccidioides is the agent of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis with restricted…

Advisors/Committee Members: Patricia Silva Cisalpino, Marjorie Mendes Marini e Souza, Patricia Silva Cisalpino, Monica Bucciarelli Rodriguez, Viviane Alves Gouveia.

▼ Cerca de 5% das pessoas portadoras do HTLV-1 poderão desenvolver uma doença inflamatória degenerativa do sistema nervoso central conhecida como HAM/TSP (mielopatia associada ao TLV-1/paraparesia espástica tropical). A carga proviral do HTLV-1 é um importante marcador de risco para doenças associadas ao vírus, visto que portadores sintomáticos têm em média níveis de carga proviral significativamente mais elevados que portadores assintomáticos. No entanto, há portadores assintomáticos (AC) com altos níveis de carga proviral, do mesmo modo que pacientes com HAM/TSP (HAM) com baixos níveis de carga proviral. Portanto, outros fatores são importantes no desfecho das doenças associadas ao HTLV-1. Foram avaliados os níveis de expressão do mRNA dos genes virais tax e HBZ e de 23 genes celulares envolvidos na resposta imune inata e adaptativa (TLR4, IL-12B, CD40, CD40L, CD80, CD86, CD28, perforina, granzima, FasL, Fas, IFN-, TNF-, IL-8, IL-10, RANTES, CCR1, MIP-1, MCP-1, CCR2B, LFA-1, MMP-9 e Foxp3) em indivíduos AC e HAM classificados de acordo com o nível da carga proviral em baixa (L) ou alta (H), usando ensaios de RT-PCR em tempo real. Na avaliação da expressão dos mRNA de tax e de sHBZ foram analisadas amostras de 21 ACL, 16 ACH, 7 HAML e 19 HAMH, e na avaliação da expressão dos mRNA dos genes celulares foram analisadas amostras de14 ACL, 9 ACH, 7 HAML e 9 HAMH, além de 14 doadores de sangue soronegativos (SN). Não houve diferença significativa na expressão do mRNA de sHBZ entre os subgrupos AC e HAM quando normalizado pela carga proviral. Em contraste, o mRNA de tax normalizado pela carga proviral foi significativamente maior no grupo HAM do que no grupo AC e em ACH x ACL, mas não foi observada diferença significativa entre os subgrupos HAML e HAMH. Houve correlação positiva e significativa das expressões dos mRNA de ambos os genes virais com a carga proviral nos grupos AC e HAM, mas esta foi mais forte no grupo AC. O nível de expressão dos mRNA de tax e de sHBZ também foram correlacionados positivamente e significativamente nos grupos AC e HAM, porém esta foi mais forte no grupo HAM. Os dados mostraram que os indivíduos AC constituem um grupo mais heterogêneo do que o grupo HAM em relação à expressão dos mRNAs de tax e de sHBZ, e devem ser cuidadosamente avaliados quando comparados com pacientes com HAM/TSP. Em conclusão, é importante avaliar os níveis dos mRNA de tax e de sHBZ, e não apenas da carga proviral, para melhor estimar o risco de desenvolvimento de HAM/TSP. Em relação aos 23 genes celulares analisados, o grupo ACL foi o que mostrou maior número de genes com expressão diferenciada do mRNA de no mínimo duas vezes em relação ao grupo SN, com diminuição do nível de TLR4 (-2.51x) e aumento do nível de IFN- (2.06x), IL-8 (3.6x) e CCL3 (2.63x). Os subgrupos ACH e HAML apresentaram apenas um gene com expressão diminuída do mRNA em relação ao grupo SN (-2,29x de MIP-1 e 3,37x de MMP-9, respectivamente). O grupo HAMH não apresentou variação de pelo menos duas vezes em relação ao grupo SN para nenhum dos genes… Advisors/Committee Members: Marina Lobato Martins, Marina Lobato Martins, Flavio Guimaraes Fonseca, Gustavo Eustáquio Brito Alvim de Melo.

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Dengue is the most prevalent aboviruse of the world mainly in tropical regions. The disease is endemic in more than 100 countries in Africa, the Americas, the eastern Mediterranean, Southeast Asia and the Western Pacific, threatening more than 2.5 billion people. The World Health Organization estimates that there may be 50 million to 100 million cases of Dengue virus (DENV) infections worldwide every year. As the clinical manifestations are frequently undifferentiated febrile illness, laboratory diagnosis is essential for confirmation of DENV infections. The method based on specific antibody identification is an easy and reliable tool for dengue fever diagnosis. Antibody response against virus envelop glycoprotein (E) is known to play a role in protective immunity and infection enhancement, especially after a primary infection. The objective of this study is to produce the four recombinant DENV serotypes envelop glycoprotein in Escherichia coli system and use them for the development of IgG-ELISA. To evaluate the IgG-ELISA, a panel of serum samples already tested by plaque reduction neutralization test (PRNT), gold standard serological assay for dengue infection, was investigated for the presence of antibodies anti-E against the four DENV serotypes. The results of PRNT and IgG-ELISA from 704 serum samples collected from citizens of Belo Horizonte (MG) were compared and 91% of sensibility and 98% of specificity were observed. These data show that the IgG-ELISA based on recombinant E protein has proved to be a very efficient assay for anti-DENV IgG detection and a useful tool in epidemiologic studies.

A dengue é a arbovirose mais prevalente no mundo, principalmente nas regiões tropicais. A doença é endêmica em mais de 100 países na África, nas Américas, no leste do Mediterrâneo, no Sudeste da Ásia e no oeste do Pacífico, ameaçando mais de 2,5 bilhões de pessoas. A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que pode haver 50 a 100 milhões de casos de infecções por Dengue virus (DENV) ao ano. Como as manifestações clínicas da dengue são, frequentemente, indiferenciadas, o diagnóstico laboratorial é importante na identificação de infecções por DENV. O método baseado na identificação de anticorpos específicos surgiu como um meio prático e confiável de diagnosticar a febre da dengue. A resposta de anticorpos contra a glicoproteína do envelope (E) viral é conhecida por desempenhar um papel na imunidade protetora e intensificação da doença, especialmente após a infecção primária. O objetivo deste trabalho foi produzir proteínas recombinantes do envelope dos quatro.sorotipos de DENV no sistema Escherichia coli e utilizá-las no desenvolvimento de um teste imunoenzimático, IgG-ELISA, para detecção de anticorpos anti-DENV. Para testar o ELISA desenvolvido, foi feita a detecção de anticorpos anti-E dos quatro sorotipos de DENV em amostras de soro cujo perfil na soroneutralização, padrão ouro no diagnóstico sorológico da dengue era conhecido. Os resultados do teste de soroneutralização de 704 amostras de soro coletadas de…

Advisors/Committee Members: Giliane de Souza Trindade, Erna Geessien Kroon, Edel Figueiredo Barbosa, Alzira Batista Cecilio, Erna Geessien Kroon.

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Tese de mestrado, Medicina dentária, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina Dentária, 2013

A Gengivite Ulcerativa Necrosante (GUN) é uma doença periodontal inflamatória que exibe sinais clínicos específicos e únicos, que a caracterizam como uma condição periodontal distinta. Apesar da etiologia parecer complexa e não ser completamente conhecida, a relação entre as bactérias e o padrão da lesão tem sido alvo de estudo nos últimos anos. Exames microscópicos de amostras de placa bacteriana de indivíduos com GUN, identificaram um complexo de microrganismos fusiformes e espiroquetas, associação há muito documentada por Vincent. Entretanto, estudos de microscopia eletrónica vieram revelar a presença de espiroquetas e outros microrganismos no tecido conjuntivo vital, subjacente à lesão necrótica; sendo que esta invasão, provavelmente envolve um conjunto de fatores de virulência das bactérias em causa, que de alguma forma lhes permite uma vantagem sobre as outras espécies presentes na placa bacteriana. Embora estes microrganismos representem um papel preponderante na patogénese da GUN, atualmente o seu papel como potenciais iniciadores da lesão, ainda permanece difícil de estabelecer. É geralmente aceite que a combinação de determinados fatores predisponentes pode aumentar a suscetibilidade do periodonto à doença na presença de certos microrganismos. Estudos microbiológicos identificaram as espécies de Treponema, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia e Selenomonas, como as bactérias dominantes da lesão e estudos de cultura revelaram que os bacilos Gram negativos eram os microrganismos cultiváveis mais predominantes nas amostras de placa bacteriana de pacientes com GUN. Mais recentemente, patogénios orais relacionados com a T. pallidum foram associados à GUN, contudo, nenhuma relação causa-efeito foi ainda estabelecida. Parece assim essencial que os métodos de deteção microbiológica mais recentes, se foquem numa identificação mais precisa dos agentes etiológicos da GUN, bem como na demonstração do papel real que os seus fatores de virulência desempenham na patogénese da doença e no mecanismo de ulceração gengival.

Necrotizing Ulcerative Gingivitis (NUG) is an inflammatory periodontal disease that exhibits specific and unique clinical signs, which characterize it as a distinctive periodontal condition. Although etiology appears to be complex and not completely understood, the relationship between bacteria and the characteristic lesion has been a topic of study in last years. A fusospirochetal complex been identified in a microscopic base of plaque samples from patients with NUG, association registered a long time ago by Vincent. Meanwhile, studies using electron microscopic examination, reveled that spirochetes and other microorganisms are capable of invading the underlying connective tissues, subjacent to necrotic lesion; probably this form of invasion involves a set of virulence factors of these bacteria, which give them some advantage over the other plaque species. Even though these organisms appear to…

Advisors/Committee Members: Mascarenhas, Paulo.

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Leveduras do gênero Candida podem colonizar canais radiculares portadores de periodontite apical primária. A capacidade de aderir às estruturas dentárias, tigmotropismo, secreção de proteinases, formação de biofilme e o pleomorfismo conferem a esses microrganismos habilidades para se estabelecerem no espaço pulpar, podendo penetrá-lo, sobretudo, através de túbulos dentinários. O presente trabalho teve como objetivo principal avaliar parâmetros relacionados à virulência de amostras leveduriformes obtidas do dorso lingual e canais radiculares necróticos portadores de periodontite apical primária. O método de detecção de proteinase em placa foi utilizado para indicar atividade enzimática. Independente do sítio primário de isolamento, todas as leveduras da espécie C. albicans avaliadas foram capazes de degradar a albumina contida no meio de cultura, indicando atividade proteásica positiva. No entanto, entre as amostras obtidas dos canais radiculares, foram revelados os maiores halos de precipitação ao redor das colônias. A expressão de genes codificadores das proteinases Sap-1, Sap-2 e Sap-4 foi identificada pelo método de RT-PCR. O gene codificador de Sap-2 foi preferencialmente expresso por leveduras do dorso lingual enquanto para aquelas dos canais radiculares, destacou-se a expressão do gene codificador de Sap-4. Os resultados obtidos sugerem que a expressão concomitante de Sap-2 e Sap-4 seja necessária à permanência das leveduras no ambiente endodôntico. A microscopia de fluorescência foi utilizada para avaliar a adesão microbiana ao acrílico e à dentina. As maiores médias de adesão foram verificadas no substrato dentina, todavia, a capacidade de adesão à dentina e ao acrílico não apresentou correlação com a hidrofobicidade dos microrganismos. A formação de biofilme foi mensurada em função da intensidade de reação com o XTT. Fatores como pH, disponibilidade de carboidratos, saliva e presença de outros grupos microbianos parecem influenciar a formação de biofilme na dentina uma vez que neste substrato foram verificadas as menores intensidades de reação. Foi observado que a direção de colonização dos túbulos dentinários por leveduras da espécie C. albicans não é influenciada pela topografia do substrato. Entretanto, o pleomorfismo revelou-se importante uma vez que leveduras da espécie C. glabrata não foram capazes de colonizar camadas internas da dentina.

Yeasts from the genus Candida can be commensal members of the oral microbiota, and can also colonize the endodontic environment. These microorganisms can penetrate the pulp space through dentinal tubules. The ability to adhere to dentinal structures, thigmotropic responses, secretion of proteases, formation of biofilm and pleomorphism is related to this penetration capacity. This study aimed to evaluate this virulence parameters of yeast samples from the tongue dorsum and necrotic root canals. The method for detecting protease in plate was used to indicate enzyme activity. Regardless of the primary isolation site, C. albicans samples were able to degrade the…

Advisors/Committee Members: Ary Correa Junior, Carlos Augusto Rosa, Ary Correa Junior, Daniel de Assis Santos, Maria Auxiliadora R de Carvalho, Milton de Uzeda, Celuta Sales Alviano.

▼ As doenças negligenciadas, o câncer e as doenças infecciosas constituem um importante problema de saúde para todo o mundo. Neste contexto, os fungos endofíticos da planta Piptadenia adiantoides foram selecionados para o isolamento de substâncias bioativas contra Leishmaniose, doença de Chagas, câncer, paracoccidioidomicose e doenças infecciosas causadas por fungos e bactérias. As linhagens de fungos endofíticos isolados desta planta foram ativas contra formas amastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis e de Trypanosoma cruzi, sendo capazes de inibir a proliferação de três linhagens de células tumorais humanas (UACC-62, MCF-7 e TK-10). Os quatro fungos selecionados, foram identificados até o nível de gênero por meio de suas características macro e micro morfológicas e também pelo sequenciamento da região inter gênica (ITS) do rDNA. Os isolados UFMGCB-540, 551, 554 e 555 foram identificados como Bipolaris sp., Fusarium sp., Bipolaris sp., e Cochliobolus sp. A partir do extrato do fungo Cochliobolus sp. foi obtido as substâncias cochlioquinona A e isocochlioquinona A que foram ativas contra formas amastigotas like de Leishmania (Leishmania) amazonensis. O extrato do fungo endofítico Fusarium sp. foi fracionado por cromatografia em co-corrente de alta velocidade e dois tricotecenos foram obtidos a partir da purificação das frações em cromatografia liquida de alta eficiência. Os tricotecenos 8-n-pentanoyl-neosolaniol e a T2 toxina foram ativos contra onze isolados de Paracoccidioides brasiliensis e uma linhagem de Candida albicans. No entanto, os dois compostos foram 100 vezes menos ativo contra esta levedura. Os dois fungos identificados como Bipolaris sp. apresentaram atividade biológica contra L. (L.) amazonensis, inibiram a enzima tripanotiona redutase e foram ativos contra quatro isolados de P. brasiliensis. Além disso, quando avaliados em cromatografia líquida de alta eficiência, as duas linhagens de Bipolaris sp. apresentaram diferentes perfis químicos. Este trabalho corrobora o potencial dos fungos endofíticos como fonte promissora de substâncias bioativas que, no caso dos fungos Cochliobolus sp. e Fusarium sp., forneceram substâncias potencialmente úteis para o desenvolvimento de novas drogas para doenças negligenciadas. Além disso, os fungos Bipolaris sp. apresentaram grande potencial para isolamento de novas substâncias bioativas contra as doenças negligenciadas e o câncer. Advisors/Committee Members: Carlos Leomar Zani, Carlos Augusto Rosa, Luiz Henrique Rosa, Carlos Leomar Zani, Jovita Eugenia Gazzinelli Cruz Madeira, Vera Lucia dos Santos, Jacqueline Aparecida Takahashi, Gisela L. da Costa.

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Foram obtidos 48 isolados de Cryptococcus neoformans a partir de amostras clínicas e ambientais coletadas em Minas Gerais. Os isolados clínicos foram obtidos a partir de amostras de material clínico provenientes de pacientes do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais e do Hospital Universitário da Universidade Federal de Juiz de Fora e os ambientais de amostras diversas de excretas de aves, ocos de árvores e madeira em decomposição. As amostras ambientais foram isoladas em meio de Staib e aquelas provenientes de material clínico em Agar Sabouraud dextrose acrescido de cloranfenicol. A identificação dos microrganismos foi confirmada pela avaliação microscópica de presença da cápsula de polissacáride, utilização de uréia em meio de Christensen, assimilação de nitrato e prova da termotolerância a 35 C. A confirmação da espécie foi realizada utilizando o meio de Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol (CGB). Foram realizados testes de susceptibilidade in vitro frente às drogas antifúngicas anfotericina B, 5-flucitosina, fluconazol, itraconazol, voriconazol e terbinafina, segundo a técnica da microdiluição em meio líquido descrita pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), documento M27-A2 e o método do E-test. Em relação a esta ultima metodologia não foram determinadas as susceptibilidades frente às drogas antifúngicas voriconazol e terbinafina. A grande maioria dos isolados apresentaram-se sensíveis ou sensíveis-dose-dependentes e apenas um pequeno número apresentou-se resistente ou com resistência intermediária frente a todas as drogas antifúngicas estudadas. As leituras da concentração inibitória mínima (CIM) foram realizadas após 48 e 72 horas de incubação e não foram encontradas diferenças significativas entre estes intervalos, considerando as duas metodologias. Não houve diferenças significativas entre as duas metodologias utilizadas, podendo, ambas, serem empregadas na prática laboratorial com o objetivo de determinar a concentração inibitória mínima de Cryptococcus neoformans. Entretanto, deve-se considerar a relação custo-benefício, já que no método do E-test as tiras impregnadas com concentrações em gradientes de drogas antifúngicas possuem custo oneroso e no método da microdiluição em meio líquido, segundo o CLSI, existem os limites de aferição visual de cada indivíduo.

For the accomplishment of this work, forty eight isolated of Cryptococcus neoformans were obtained starting from clinical and environmental samples collected in Minas Gerais. The clinical isolateds were obtained starting from patients of the Hospital das Clínicas of Federal University of Minas Gerais samples and of the Hospital Universitário of the Federal University of Juiz de Fora by the cultivation in Sabouraud agar. The environmental samples, starting, were obtained from several samples of you excrete of birds, hollow of trees and wood in decomposition. For the isolation, through the environmental samples, cultivation was accomplished in Staib media and in Sabouraud agar, for the clinical samples. The…

Advisors/Committee Members: Maria Aparecida de Resende, Maria Aparecida de Resende, Marcia de Carvalho, Geraldo Magela Magalhães, Carlos Augusto Rosa.

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Very little is known about the early events in the interaction between Paracoccidioides brasiliensis cells and its host. In order to unveil the role of carbohydrates, peptides and self-produced molecules on the mechanisms of interaction between the fungus and epithelial cell in culture, we analyzed the effect of Sorbitol, D-mannoese, D-fucose, N-acetyl-glucosamine, D-glucosamine, Fructose and D-galactosamine, the peptides GRDSPK, GRGDTP e GRDGS and culture supemadant on the adhesion of P. brasiliensis yeast cells to CCL-6 cells on culture. The fungal cells were cocultivated with the epithelial cell line and different concentrations of the interaction. Six hours after the treatment the cells were fixed and observed on light microscopy. The number of P. brasiliensis cells adhered to the CCL-6 monolayer was estimated. D-fucose, N-acetyl-gçicpsa,ome. D-mannose, D-glucosamine and D-galactosamine treatments diminished the number of adhesion events if compared to the observed with untreated controls. Sorbitol and Fructose treated cells had the same adhesion behavior as the observed in the controls. In order to detect the presence of carbohydrates in the fungus surface, P. brasilienssis propagules were treated with fluorescent lectins. WGA-FITC and Con-A-FITC lectins labeled P.brasiliensis cells while SBA and PNA lectins did not bind to the yeast cell. The peptides GRDSPK, GRGDTP also diminished the number of adhesion events observed and antibodies against 111 and 2 integrins labeled P. brasiliensis cells. Old RPMI culture supernadant of P. brasiliensis also diminished the adhesion events of the fungus on CCL-6 cells. The molecule responsible for such effect is unknown, but is thermostable and non-proteic.

Apesar dos inúmeros estudos empreendidos nas últimas décadas na tentativa de elucidar os mecanismos de interação entre Paracoccidioides brasiliensis versus hospedeiros, durante o curso da paracoccidioidomicose (PCM), poucas são as informações disponíveis na literatura que mostram de maneira precisa como ocorre o processo infectivo. Para auxiliar na melhor compreensão dos possíveis mecanismos moleculares envolvidos na interação de P. brasiliensis com seus hospedeiros, estabeleceu-se um modelo de estudo in vitro, que pudesse evidenciar a participação de mediadores de adesão de superfície celular na interação do fungo (Pb18) com células epiteliais CCL-6 em cultura. Os carboidratos, D-manose, D-fucose, N-acetil-D-glicosamina, sorbitol, D-galactosamina e D-glicosamina, os peptídeos GRGDTP, GRDGS e GRGDSPK, e sobrenadante de cultura líquida de P. brasiliensis, foram utilizados como competidores de inibição de adesão do P. brasiliensis em células CCL-6. Também foram utilizadas, em ensaios citoquímicos, as lectinas ConA, WGA, PNA e SBA conjugadas com o fluorocromo FITC, bem como anticorpos específicos para a subunidade 2 e para as integrinas 111 e CD18. Observou-se que nos tratamentos realizados com os carboidratos D-manose, D-fu cose e N-acetil-glicosamina, o peptídeo GRGDSPK e o sobrenadante de cultura líquida do P.…

Advisors/Committee Members: Ary Correa Junior, Ary Correa Junior, Mauro Martins Teixeira, Maria Jose dos Santos Soares, Celia maria de Almeida Soares, Patricia Silva Cisalpino, Fatima Soares Motta Noronha.

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Malnutrition, highly prevalent in developing countries, is an old suffering that afflicts the humanity. The protein-energy malnutrition is presented as a state of food deficiency, with deficit in proteins and calories, provoking lower supplying of nutrients to the cells. Some studies have shown evidences of interaction between malnutrition and bacterial translocation. Bacterial translocation is a process in which microorganisms from gut normal microbiota cross the intestinal mucosa in order to reach other organs. This can occur due to three situations: dysfunction of the intestinal mucosal barrier, alterationof intestinal microbiota and host immune deficiency. In our study, the distal ileum was ligated for induction of the intestinal obstruction in rats. Protein-energy food restriction imposed throughout the experiment had the aim of evaluating the influence of malnutrition on intestinal translocation in the animals. Control group animals fed diet ad libitum and the malnourished rats fed 65% of the amount consumed by the control group. In order to control for surgical stress, wellnourished and malnourished rats were Sham operated. Wellnourished and malnourished animals were submitted to ileum ligation. All animals were inoculated in the ileum with 99mTc-E.coli (108 CFU). The animals were sacrificed 24 hours after 99mTc-E.coli inoculation, blood sample was collected and some organs removed (mesenteric lymphonodes, liver, spleen, and lungs) for verification of the bacterial translocation. The bacterial translocation was evaluated by the determination of the radioactivity in the organs and blood. The results showed that in the animals submitted to the intestinal ligation, bacterial translocation was significantly higher (p 0,05) than in Sham operated animals. Animals submitted to the intestinal obstruction and Sham operated wellnourished animals, compared to the malnourished ones, did not show significant differences in bacterial translocation to the organs and blood (p>0,05). Therefore, the obtained data suggest that protein-energy-malnutrition imposed to the rats did not interfere with the process of bacterial translocation in the experimental model of ileum ligation in order to obtain intestinal obstruction

Desnutrição, altamente prevalente em países em desenvolvimento, é um mal antigo que aflige a humanidade. A desnutrição energético protéica apresenta-se como um estado de deficiência alimentar, com déficit global de proteínas e calorias, provocando menor aporte de nutrientes às células. Alguns estudos têm mostrado evidências de interação entre desnutrição e translocação bacteriana. Translocação bacteriana é um fenômeno em que ocorre a passagem de microorganismos da microbiota intestinal normal, através da mucosa intestinal, para outros orgãos. Isto pode ocorrer devido a três situações: disfunção da barreira intestinal, alteração da microbiota intestinal e deficiência imunológica do hospedeiro. Em nosso estudo, realizamos uma ligadura do íleo terminal para induzir obstrução intestinal em ratos. Associamos…

Advisors/Committee Members: Jacques Robert Nicoli, Valbert Nascimento Cardoso, Tasso Moraes e Santos, Valbert Nascimento Cardoso, Enio Cardillo Vieira, Luiz Gonzaga Vaz Coelho.

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Os Orthobunyavirus do grupo C estudados, Caraparu (CARV) e Apeu (APEUV), foram isolados na Amazônia brasileira na década de 50. A doença em humanos é caracterizada por febre alta, mialgia e fotofobia, com 4-5 dias de duração. Apesar de serem patogênicos para os seres humanos, terem sido isolados a mais de meio século e apresentarem potencial para infecção emergente, estudos relacionados aos vírus do grupo C são ainda escassos e suas características biológicas e moleculares são ainda pouco conhecidas. Os interferons representam uma família de citocinas, componentes do sistema imune inato, sendo a primeira linha de defesa contra uma infecção viral. Os estudos da relação entre os interferons e os arbovírus do grupo C podem trazer informações sobre a resposta imune inata estimulada por esses vírus. Células infectadas sintetizam e secretam interferons dos tipos I e III, que sinalizam as células vizinhas para expressarem proteínas antivirais (ISGs) na tentativa de conter a multiplicação e evitar a dispersão do agente viral. No presente trabalho, foi dada continuidade à caracterização biológica do CARV e à caracterização molecular do APEUV, sendo algumas importantes características desses vírus elucidadas. O CARV apresentou sensibilidade in vitro aos IFNs dos tipos I e III nas células Vero. A inibição promovida pelo IFN do tipo I utilizado (IFN_) se mostrou mais pronunciada que a inibição promovida pelo IFN do tipo IIII (FN_2). Os resultados do tratamento simultâneo com os dois tipos de IFNs demonstraram não haver uma potencialização do efeito de um dos tipos de IFN pela presença do outro tipo. Os resultados obtidos demonstraram a capacidade do CARV de induzir a expressão de dois ISGs, MxA e IRF7, e dos IFN_, IFN_1 e IFN_2/3 em células humanas A549 infectadas. Dessa forma, pôde-se concluir que, além do CARV ser sensível aos IFNs dos tipo I e III in vitro, o vírus tem capacidade de induzir a expressão de IFNs e ISGs após a infecção das células A549. Assim, foi possível inferir que o sistema de IFN tem papel importante na resposta imune inata contra esse vírus. Como parte da caracterização molecular do APEUV, o sequenciamento parcial do segmento S da amostra original do vírus Apeu (BeAn 848) não clonada e dos clones 2, 3, 6 e 11 e sua comparação com a sequência obtida por Magalhães em 2007, demonstraram a homogeneidade da amostra viral Apeu (BeAn 848) testada.

Group C Orthobunyaviruses - Caraparu virus (CARV) and Apeu virus (APEUV) were isolated in Brazilian Amazonia during the 1950s. These viruses could affect human being causing a disease characterized by high fever, muscular pain and photophobia during 4-5 days. Although group C viruses show a potential to emerge as human pathogens, studies with this viral family, especially involving this serogroup, are very rare and its biological and molecular characteristics are even less known. The interferons (IFNs) are a cytokine family important in the innate immune system regulation. IFNs play an essential role as first line defense against viral infections. The study of their…

Advisors/Committee Members: Paulo Cesar Peregrino Ferreira, Erna Geessien Kroon, Paulo Cesar Peregrino Ferreira.

Tese de doutoramento em Biologia (Microbiologia), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2008

Disponível no documento

Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), (SFRH/BD/8272/2002)

Advisors/Committee Members: Tenreiro, Rogério Paulo de Andrade, 1955-, Abrantes, Luísa, 1946-.

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Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2010.

This thesis concerns studies of a two-component system (TCS) from Deinococcus radiodurans bacterium. TCSs work based on the activity of two proteins: the histidine kinase and the response regulator. Histidine kinases are responsible for several reactions of this mechanism: autophosphorylation, phosphotransfer and phosphatase activity. The mechanism is initiated by an autophosphorylation, induced by a signal from the environment. These proteins are composed of two domains: the dimerisation and histidine phosphorylation domain (DHpD), and the catalytic ATPase domain (CAD). The response regulator is activated by the histidine kinase, through a phosphotransfer reaction. The response regulators are composed by a receiver domain (RD) that will receive the phosphoryl group from the histidine kinase on the aspartate residue, and an effector domain which commonly consists of a DNA-binding domain (DBD). Upon phosphorylation of the RD of the response regulator the protein suffers a conformation change that increases its binding affinity to specific DNA region. The work focuses on the PhoR-PhoB system, a signalling mechanism that gets activated upon environmental phosphate starvation. The activation of PhoB response regulator, through phosphotransfer from PhoR histidine kinase, leads to activation of the last protein with consequent binding to a specific DNA sequence (Pho box), regulating the Pho regulon. The Pho system has been studied in different bacteria using different kinds of approaches. However, the knowledge of this system in D. radiodurans concerns the annotation of the genes that encode the two proteins of the mechanism: PhoR (DR2244) and PhoB (DR2245). This thesis presents the structural characterisation of both full-length proteins and their domains, through small angle X-ray solution scattering (SAXS) analysis. Biochemical data and the X-ray structure of the PhoRCAD domain (resolution 2.25 Å) complement those studies. The biochemical data demonstrates the PhoR autophosphorylation activity as well as phosphoryl transfer activity to PhoBRD.

Esta dissertação refere-se ao estudo estrutural e bioquímico de um dos sistemas de dois componentes (TCS) de Deinococcus radiodurans. O TCSs baseia-se na actividade de duas proteinas: a quinase de histidina e o regulador de resposta. As quinases de histidinas efectuam diversas reacções destes sistemas como autofosforilação, transferência de fosfato e actividade de fosfatase. O mecanismo é iniciado pela autofosforilação da proteína, sendo esta reacção induzida por um sinal ambiental específico. Estas proteínas são compostas dois domínios: o domínio de dimerização e fosforilação de histidina (DHpD) e o domínio catalítico de ATPase (CAD). O regulador de resposta é activado através de uma reacção de fosfotransferência da quinase de histidina; sendo a proteína composta por domínio receptor (RD), que é fosforilado pela quinase de histidina, no aspartato; e pelo domínio effector que…

Advisors/Committee Members: Enguita, Francisco, Duarte, Aida, 1948-.

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Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2010

The majority of phages described to date (≈96%) is endowed with a tail and presents a double-stranded DNA (dsDNA) genome. Each infection cycle terminates with the strictly programmed and regulated lysis of the host brought about by two phage-encoded proteins, a murein-degrading enzyme, the endolysin, which is essential in achieving rapid hydrolysis of cell wall peptidoglycan, and a second membrane-embedded protein, the holin, which serves to release or activate the endolysin at a precisely defined time, thus bringing about an effective burst of the infected host. Targeting of endolysins to peptidoglycan can be achieved in two ways: through pore formation by canonical holins at a defined time or by continuous export of endolysins endowed with export signals during synthesis, assisted by the host Sec translocon. Mycobacteriophage Ms6 is a temperate bacteriophage that infects Mycobacterium smegmatis and possesses an unusual lytic cassette: in addition to the endolysin-holin lysis system encoded by genes lysA (gp2) and hol (gp4) respectively, the Ms6 lytic cassette comprises three accessory lysis proteins encoded by genes gp1, gp3 (lysB) and gp5 that are restricted to mycobacteriophages. Mycobacteria are Gram-positive bacteria that have evolved a complex cell wall, comprising a peptidoglycan-arabinogalactan polymer with covalently bound mycolic acids of considerable size, a variety of extractable lipids, and pore-forming proteins which provide an extraordinary efficient permeability barrier to noxious compounds and contribute to the high intrinsic resistance of mycobacteria to many drugs. To overcome the disadvantage that a complex cell wall may represents for a successful infective cycle, mycobacteriophages have evolved new lysis strategies by acquiring, through their evolution, genes that likely confer a substantial selective advantage over those without them by providing faster and more complete lysis. The present work underscores a new model for endolysin export in mycobacteriophage Ms6. Several lines of evidence indicate that gp1 encodes a secretion chaperone-like protein that binds the endolysin, assists the export to the extracytoplasmic environment independently of holin function and is required to accomplish an efficient lysis of M. smegmatis. Construction of different Ms6 derivatives deleted in different regions of the lysis operon demonstrated that the gene products of hol and gp5, although nonessential for phage viability, appear to play a role in controlling the timing of lysis. Remarkably, during M. smegmatis infection two endolysin forms (Lysin384 and Lysin241) are synthesized and both enzymes were shown to be essential for the normal timing, progression and completion of host cell lysis. In conclusion, this work highlights the role of the accessory lysis protein Gp1 and revealed alternative pathways for mycobacteria lysis, demonstrating that the presence of the mycobacterium-specific lysis factor Gp1,…

Advisors/Committee Members: Pimentel, Madalena Maria Vilela, 1961-, Pereira, J. Moniz, 1949-.

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Tese de doutoramento em Farmácia (Microbiologia), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Farmácia, 2008

The spread of HIV-1 has been dramatic since the early eighties, when the virus was discovered as the causative agent of AIDS. In the absence of an effective vaccine against HIV, a worldwide search has been made in the past two decades to develop small-molecule inhibitors to target essential steps in the viral cycle. Over the recent years, gene therapy has been highly regarded as a new form of molecular medicine in treatment of HIV/AIDS, either asan alternative or as a complement to anti-retroviral chemotherapy. An intrabody consists of an antibody designed to be expressed intracellularly and directed to different subcellular compartments where they can exert their function more effectively. The binding of an intrabody to its molecular target has the potential to block, suppress, alter or even enhance the process mediated by that molecule. Within this context, intracellular antibodies (intrabodies) represent a new class of neutralizing molecules with potential use in gene therapy approaches. The HIV 1 integrase (IN) protein is currently the focus of an intense research effort to develop new anti-HIV-1 drugs. This enzyme catalyses the integration of HIV genome into the chromosome of the host cell, arguably the most insidious step in the infection process. In the first project of this thesis (Chapter 2), we explored the intracellular immunization approach by developing rabbit intrabodies against the HIV-1 IN protein. We immunized rabbits with HIV-1 IN and developed a combinatorial scFv library againstIN. We were able to identify 5 different scFv's antibodies with high binding activity and specificity to IN. These scFv's bound simultaneously to the catalytic and C-terminus domains of IN. In addition, these antibodies have the ability to inhibit the strand transfer processing. Intrabody-expressing cells, either in their cytoplasm or nuclear compartments, were highly resistant to HIV-1 infection. Importantly, when HIV-1 particles where produced in the presence of anti-IN scFv, the expression of intrabodies did not affect virion production significantly. However, it markedly reduced the infectivity of progeny virions due to the incorporation of anti-IN scFv into the viral particles. These findings provide proof-in-principle that rabbit anti- IN intrabodies can be designed to block early and late stages of HIV-1 replication. As a result, our intrabodies might be useful agents for "intracellular immunization"- and used as new tools to study the structure and function of HIV-1 IN due to their epitope binding characteristics. Another potential target for HIV-1 treatment is Vif. This viral protein overcomes the innate antiviral activity of a cytidine deaminase APOBEC3G that induces G to A hypermutation in the viral genome, resulting in enhancement of viral replication infectivity. We previously demonstrated that anti-Vif scFv and camelized VH intrabodies are an effective approach to inhibit this…

Advisors/Committee Members: Gonçalves, João, 1967-, Barbas III, Carlos F..

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Tese de doutoramento em Farmácia (Microbiologia), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Farmácia, 2008

One of the critical determinants of HIV-1 infectivity is the capacity of the virus to infect new cells. The viral Vif protein is one of the critical factors involved in the increase infectivity of the virus. Vif protein is required for HIV to replicate in some human cell types (termed non-permissive' cells), but not others ( permissive' cells). The reason for this is the expression, in non-permissive cells, of a potent antiretroviral enzyme: APOBEC3G (A3G) and its paralog APOBEC3F (A3F). Each of these enzymes contains two RNA-binding motifs and incorporates into assembling HIV-1 capsids where they cause lethal dC-to-dU hypermutations in the single-stranded viral DNA that transiently forms during reverse transcription. One of the mechanisms that Vif uses to overcome this viral block is by reducing A3G/A3F intracellular expression levels recruiting it for polyubiquitination and proteasomal degradation in the 26S proteasome. In order to understand how A3G half-life can influence its antiviral activity, both at the level of viral encapsidation and catalytic activity in the cell, we decided to model the intracellular half-life of A3G by targeting it to the N-end rule pathway. This system allowed us to show that A3G variants with different stabilities are capable to be targeted for proteasomal degradation in a Vif-independent manner. Our results confirmed the importance of A3G steady-state expression for the maintenance of its antiretroviral activity indicating that in order to counteract A3G activity, Vif has to act at the very early stages of A3G life-time, probably within the first 13 minutes after its synthesis, in order to impede its incorporation into virions. In addition, we show that active deamination in the cytoplasm does not seem to be important for antiviral activity of A3G and deamination activity does not increase with the half-life of A3G. Identification of protein biding partners between Vif and A3G proteins is one of the major challenges for the development of new antiviral drugs, as disruption of A3G-Vif interaction is predicted to stimulate natural antiviral infectivity. In this work, we used two different approaches to study the interaction of Vif with A3G. One strategy was based on an oligomerization-assisted interaction whereby fragments of Vif and A3G were fused to independently folding and interacting domains of homodimerizing GCN4 leucine zipper-forming sequences. This allowed us to show that the C-terminal region of Vif alone is not sufficient to induce A3G degradation and that binding of Vif to A3G must involve an additional co-factor that is probably linked to the N-terminus of Vif and may be essential for the interaction and consequent degradation of A3G. The other strategy involved a Protein Complementation Assay (PCA). We produced several mutants of both Vif and A3G bearing mutations on key residues that are thought to be crucial for the interaction between these…

Advisors/Committee Members: Gonçalves, João, 1967-.

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As condições higiênico-sanitárias do comércio ambulante de alimentos prontos para o consumo em Ouro Preto-MG foram avaliadas por meio de uma lista de verificação e análises microbiológicas. Todos os estabelecimentos analisados apresentaram condições precárias para manipulação e/ou processamento de alimentos, visto que atenderam a menos de 50% dos itens constantes da lista aplicada. A análise por blocos possibilitou verificar que a higiene pessoal foi o quesito que apresentou menor índice de adequação (16,7%), seguido do bloco boas práticas na produção e venda dos alimentos (33,8%), higiene dos utensílios, equipamentos, carrinhos/ trailers (36,2%) e edificação e instalação (36,7%). Entre os 15 ambulantes participantes, a maioria era homem, com faixa etária entre 31 e 40 anos, nível de escolaridade médio completo, atua por 10 a 15 anos e caracteriza-se por ambulante fixo. O desemprego foi o motivo principal para a escolha dessa profissão e o fluxo de pessoas para a determinação do local. Apenas um ambulante relata ter treinamento em boas práticas e nenhum possui certificado de saúde. O conhecimento em relação às noções de higiene é limitado, entretanto, as formas de transmissão de toxinfecções eram conhecidas pela maioria. A análise microbiológica constatou o risco de contaminação dos alimentos produzidos pelos ambulantes. Entre as 26 amostras analisadas, foi detectada contaminação por estafilococos potenciais produtores de enterotoxinas em 4 (15,4%) e coliformes a 45ºC em desacordo em 2 (7,7%). Os resultados permitiram confirmar as precárias condições de higiene do comércio ambulante de alimentos avaliado e direcionar a intervenção sistematizada pela Vigilância Sanitária Municipal de Ouro Preto.

The sanitary-hygienic conditions of the ready-to-eat street vending commerce in Ouro Preto-MG have been evaluated through a checklist and microbiological analysis. All sales points analyzed have presented precarious conditions in food manipulation and/or processing, since they have fulfilled less than 50% of the items in the checklist. The analysis in blocks allowed the verification that the personal hygiene was the item which presented the lowest adequacy level (16,7%), followed by the good practices in production and sale of the food (33,8%), hygiene of utensils, equipment, carts/ trailers (36,2%) and buildings and installations (36,7%). Among the 15 vendors in the survey, most were men, aged between 31 and 40 years-old, educated up to the secondary school level, working for 10 to 15 years and characterized as fixed vendors. Unemployment is the main reason for the choice of this profession and the flow of people is the main reason to determine the location for work. Only one of the vendors reportes receiving training in good practices and none of them have health certificate. The knowledge concerning hygiene notions is limited, however, the forms of toxic infection transmission are familiar to the majority. Microbiological analysis has shown the risk of contamination of the food produced by vendors. Among the 26 samples…

Advisors/Committee Members: Roberto Goncalves Junqueira, Roberto Goncalves Junqueira, Gecernir Colen, Evelyn de Souza Oliveira.

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E. coli é um dos habitantes mais comuns do trato intestinal e, embora não seja necessariamente patogênica, é a bactéria anaeróbia facultativa mais frequentemente isolada de infecções intra-abdominais. A combinação piperacilina-tazobactam (PTZ) está entre as drogas antimicrobianas que podem ser usadas para o tratamento de infecções polimicrobianas, na qual E. coli está frequentemente envolvida. Durante a terapia antimicrobiana, concentrações inibitórias das drogas utilizadas são, sempre, seguidas por concentrações sub-inibitórias. Já foi demonstrado que drogas em sub- CIM (concentrações abaixo da concentração inibitória mínima) influenciam nas características fenotípicas de bactérias, com destaque para a indução de células filamentosas, cujo grau de agressividade não é consensual. Neste trabalho, avaliouse o efeito de metade da concentração inibitória mínima de PTZ (0,5 x CIM de PTZ) na morfologia e na fisiologia de E. coli. Para tal, a bactéria utilizada nos testes foi crescida em tempo determinado em meio de cultura com 0,5 x CIM de PTZ (células filamentosas) e, também, em meio sem antimicrobiano. As células tratadas com PTZ apresentaram uma CIM maior que as não tratadas; porém, a concentração bactericida mínima (CBM) encontrada foi menor. O crescimento de E. coli em meio contendo antibiótico, evidenciou alterações na morfologia bacteriana. As células alteradas não apresentaram diferenças em características bioquímicas em relação às não alteradas, mesmo quando estas foram testadas em meio teste contendo 0,5 x CIM de PTZ. O crescimento da bactéria em presença de 0,5 x CIM de PTZ alterou o padrão de crescimento de E. coli, diminuindo sua densidade populacional final, ou atrasando o início e/ou final da fase exponencial de crescimento. Em comparação com as células cultivadas na ausência de drogas, a bactéria na forma filamentosa expressou menor capacidade de formação de biofilme, motilidade e hidrofobicidade celular, e maior sensibilidade ao estresse oxidativo. Finalmente, o perfil de expressão de proteínas totais mostrou menor expressão protéica nas células tratadas. Quando as bactérias de morfologia normal e filamentosa foram testadas na presença de 0,5 x CIM de PTZ em alguns desses testes, as alterações foram ainda mais significativas. O desafio de animais experimentais com as células tratadas com x 0,5 x CIM de PTZ mostrou que estas são, aparentemente, menos agressivas que as não tratadas, o que é coerente com os demais dados deste trabalho.

E. coli is one of the most common inhabitants of the intestinal tract and, although it is not necessarily pathogenic, it is a facultative anaerobic bacterium that is most frequently isolated from intra-abdominal infections. The combination of piperacillintazobactam (PTZ) is among the antimicrobial drugs that can be used for the treatment of polymicrobial infections in which E. coli is often involved. During antimicrobial therapy, inhibitory concentrations of drugs used are always followed by sub-inhibitory concentrations. It has been shown that drugs in sub-MIC…

Advisors/Committee Members: Maria Auxiliadora R de Carvalho, Luiz de Macêdo Farias, Oscar Bruna Romero, Kênia Valéria dos Santos, Maria Auxiliadora R de Carvalho, Patricia Silva Cisalpino, Claudio Galuppo Diniz.

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Esse trabalho teve como objetivo caracterizar a comunidade de leveduras que coloniza as flores de Heliconia psittacorum (Heliconiaceae). As flores foram coletadas próximas a Cachoeira da Formiga, que se localiza no Parque Estadual do Jalapão (estado do Tocantins), uma das maiores reservas do bioma Cerrado no Brasil. Vinte e cinco flores de H. psittacorum foram coletadas, sendo obtidos 229 isolados de leveduras. Os isolados foram agrupados de acordo com o perfil fisiológico e molecular. Um isolado de cada grupo foi submetido ao sequenciamento da região gênica D1/D2 do gene do rRNA. As leveduras foram identificadas como pertencentes a 20 espécies, sendo nove espécies de ascomicetos e onze de basidiomicetos. O gênero mais freqüente foi Candida, com 50,64% do total de isolados, sendo Candida flosculorum a espécie com o maior número de isolados. Essa espécie parece estar intimamente relacionada com flores de Heliconia, uma vez que já foi isolada em estudos com outras duas espécies desse gênero de planta. Quatro espécies novas de leveduras foram encontradas. Candida sp. 1 pertence ao clado Wickerhamiella, sendo filogeneticamente próxima de C. drosophilae e de C. jalaponensis. Candida sp. 2 é uma espécie basal no clado Metchnikowia, sendo filogeneticamente próxima de C. saopaulonensis. Candida sp. 3 é filogeneticamente próxima de C. asparagi com a qual forma um clado juntamente com C. fructus. Candida sp. 4 pertence ao clado das Wickerhamomyces, sendo filogeneticamente próxima de Wickerhamomyces pijperi. Duas outras espécies, Cryptococcus sp. (sequencia das regiões D1/D2 e ITS do rRNA idênticas a linhagem CBS 8369, número de acesso no Genbank AF444705) e Candida nymphaea (sequencia das regiões D1/D2 e ITS do rRNA idênticas a llinhagem 05-7-186T, número de acesso no GenBank FJ537069), já foram isoladas de outras plantas, porém ainda não foram descritas. A comunidade de leveduras isolada de flores de H. psittacorum a presenta um amplo perfil fisiológico, com a assimilação de uma grande variedade de fontes de carbono e com a predominância de espécies osmotolerantes, o que pode estar relacionado com a alta concentração de açúcares nos nectários. Muitas espécies dessa comunidade de leveduras utilizam nitrato e nitrito como única fonte de nitrogênio e poucas são capazes de fermentar glicose e crescer à 37ºC. A comunidade de leveduras associada com H. psittacorum apresentou alto índice de diversidade, com um valor muito parecido com aquele encontrado para a comunidade de leveduras de flores de H. velloziana provenientes de fragmentos de Mata Atlântica. O presente trabalho mostra que flores do bioma Cerrado podem constituir uma rica fonte de novas espécies de leveduras. Mais estudos são necessários para a melhor caracterização das comunidades que colonizam esses habitats efêmeros.

This study aimed to characterize the yeast community colonizing Heliconia psittacorum (Heliconiaceae) flowers. These flowers were collected near Formiga waterfall, located at the Parque Estadual do Jalapão (state of Tocantins), one of the largest…

Advisors/Committee Members: Carlos Augusto Rosa, Carlos Augusto Rosa, Allen Norton Hagler, Fernanda Badotti, Luiz Henrique Rosa.

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O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da desidratação e reidratação sobre o rúmen e retículo bovinos cozidos. Seis amostras de bucho foram submetidas a quatro tratamentos de cozimento: panela de pressão por 30 minutos (PP30), e autoclave por 15 (A15), 30 (A30) e 45 (A45) minutos. A análise dos resultados mostrou não haver diferença significativa entre PP30, A30 e A45 (p>0,05 teste Duncan), sendo escolhidos para continuação do estudo os tratamentos PP30 e A30. Foram construídas isotermas de sorção para essas amostras visando a obtenção de um ponto adequado de secagem. Para avaliação do processo de desidratação, cada amostra foi dividida em duas parcelas (tratamentos PP30 e A30) e duas subparcelas (reidratação com água a temperatura ambiente - H2O TA, e água a 50°C - H2O 50°C). Foram coletados dados de peso e maciez objetiva em todas as etapas e através da análise dos resultados observou-se que as amostras comportam-se de maneira semelhante durante a desidratação, indepentente do tipo de cozimento, sendo que a melhor reidratação foi em H2O TA (p>0,05 teste SNK). Neste trabalho também foram avaliadas a composição química e microbiológica do produto, sendo encontrados valores de umidade, proteína, lipídios e cinzas similares ao da carne bovina, mostrando a importância do aproveitamento do bucho como um alimento rico em nutrientes. Em relação à avaliação microbiológica, ficou demonstrado que o bucho in natura apresenta elevadas contagens de microrganismos, assim como o produto desidratado neste trabalho, mostrando a necessidade de um melhor acompanhamento nos processos tecnológicos aplicados à sua obtenção

The aim of this work was to evaluate the effect of dehydration and rehydration in bovine rumen and reticulum cooked. Six samples of "bucho" were submitted to four treatments of cooking: pressure pan for 30 minutes, and autoclave for 15 (A15), 30 (A30) and 45 (A45) minutes. The analysis of results showed no significant difference between PP30, A30 and A45 (p>0,05 Duncan test), being chosen to continue the study the treatments PP30 and A30. Sorption isoterms were built for these samples to get an adequate point of drying. For evaluation of dehydrated process each sample were divided in two groups (PP30 and A30 treatments) and two subgroups (rehydration with water at room temperature - H2O TA, and water at 50°C - H2O 50°C). In all the steps values of weight and objective tenderness were measured. After the analysis of results it was observed that the samples behave in a similar way during the dehydration process, independently of the type of cooking and the best rehydration was obtained with H2O TA (p>0,05 SNK test). In this work the chemical and microbiological composition of product and the values of moisture, protein, lipid and ash found were similar to bovine meat, showing the importance of using "bucho" as a nutritive food. In relation to microbiological evaluation of product, these research demonstrated that bovine rumen and reticulum in natura present high counting of microorganisms, as well as the…

Advisors/Committee Members: Afonso de Liguori Oliveira, Afonso de Liguori Oliveira, Silvana de Vasconcelos Cancado, Andrea Lucia Teixeira Charbel.

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The hygiene conditions in meal preparation of community day care centers in Belo Horizonte MG were evaluated. A checklist, based on the current legislation, was elaborated and applied in thirty seven different regional day care centers of the municipality. It was concluded that the day care centers reached a medium level of compliance with the Good Manufacturing Practice (GMP), which shows a deficiency in the hygienic sanitary conditions in the production of meals in these institutions. The major deficiencies in the compliance to the GMP were observed in the groups equipment, furniture and utensils, installations and buildings, handling of residues and human resources, with compliance of the evaluated items below 50%. The manual GMP was found in none of these institutions. The microbiological evaluation of knives, dishcloth, handlers hands and water of the reservoirs of a subsample of nine day care centers presented inadequacies of 77% of the total of the samples. Satisfactory hygienic-sanitary conditions for the dishcloth were not observed in any of the sampled institutions. The day care centers that obtained least compliance to the GMP presented the highest microbiological count in the analyzed samples. The results of this work show that the hygienic sanitary conditions of the day care centers are unsatisfactory as well as the hygiene practices of the handlers. The checklist of the Good Manufacturing Practice was an efficient, quick and low cost tool in the assessment of the hygienic conditions in the day care centers. Keywords: day care centers; checklist of the good manufacturing practice; hygienic

Foram avaliadas as condições de higiene no preparo de refeições em creches comunitárias de Belo Horizonte MG. Uma lista de verificação, baseada na legislação vigente, foi elaborada e aplicada em trinta e sete creches de diferentes regionais do Município. Concluiu-se que as creches alcançaram um nível mediano de atendimento às Boas Práticas de Fabricação (BPF), o que demonstra uma precariedade nas condições higiênico-sanitárias na produção de refeições nestas instituições. As maiores deficiências no atendimento às BPF foram observadas nos grupos equipamentos, móveis e utensílios, instalações e edificações, manejo de resíduos e recursos humanos, com atendimento abaixo de 50% dos itens avaliados. Em nenhuma instituição foi encontrado o manual de BPF. As avaliações microbiológicas de amostras de facas, panos de prato, mãos de manipuladores e água dos reservatórios de uma subamostra de nove creches demonstraram inadequações em 77% do total das amostras analisadas. Não foram observadas condições higiênico-sanitárias satisfatórias para os panos de prato em nenhuma instituição amostrada. As creches que obtiveram menor atendimento às BPF apresentaram as maiores contagens microbiológicas nas amostras analisadas. Os resultados deste trabalho demonstraram que as condições higiênico-sanitárias das creches são insatisfatórias, assim como as práticas de higiene dos manipuladores. A lista de verificação das Boas Práticas foi um…

Advisors/Committee Members: Roberto Goncalves Junqueira, Accacia Julia Guimaraes Pereira, Luiz Carlos Ferreira, Gecernir Colen.

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Atualmente tem-se verificado um aumento na comercialização de refrescos em estabelecimentos comerciais, como lanchonetes, padarias e restaurantes. Esse aumento deve-se à praticidade dessas bebidas, que podem ser preparadas de forma rápida e ainda ficarem armazenadas em equipamentos dotados de refrigeração, denominados ´´refresqueiras´´. No entanto, existem poucos estudos sobre as populações microbianas presentes bem como das propriedades físico-químicas destas bebidas. Esse trabalho teve como objetivos determinar os microrganismos indicadores de qualidade higiênico-sanitária e os microrganismos contaminantes, bem como avaliar os parâmetros físico-químicos de acidez total titulável, pH, sólidos solúveis totais e densidade. Um total de sessenta amostras de refrescos, vinte no sabor laranja, vinte no sabor caju e vinte no sabor uva, foram coletadas em lanchonetes, padarias e restaurantes de Belo Horizonte, Minas Gerais. Os refrescos correspondiam às bebidas preparadas a partir da reconstituição de preparados em pó (sabores laranja, caju e uva) para refrescos e de sucos concentrados (sabor caju). As densidades de coliformes totais e de coliformes termotolerantes obtidas em 33 e 27 amostras, respectivamente, e as contagens elevadas de aeróbios mesófilos sugerem qualidade higiênico-sanitária insatisfatória. Staphylococcus coagulase negativa foram encontrados em 24 amostras e enterotoxina estafilocócica A (SEA) em dois dos oito pools testados. Esse resultado indica falhas de higiene por parte dos manipuladores e risco à saúde dos consumidores. Altas contagens de leveduras foram também observadas nas amostras coletadas. Trezentos e noventa e seis isolados de leveduras foram obtidos a partir das 60 amostras. Dos 356 isolados identificados, obteve-se 47 espécies de leveduras. Muitas das leveduras identificadas são deterioradoras de alimentos e bebidas e também patógenos oportunistas. Vinte e três espécies, de leveduras que apresentaram crescimento a 37°C, foram testadas quanto à sensibilidade aos antifúngicos fluconazol, itraconazol e anfotericina B. Três espécies foram resistentes ao fluconazol, uma ao itraconazol e sete à anfotericina B. Os parâmetros físico-químicos encontrados estavam, em geral, dentro dos intervalos obtidos por outros autores. No entanto, foi verificado elevado teor de sólidos solúveis totais, devido, provavelmente, à adição de açúcar em excesso. A ausência de valores mínimos e máximos de identidade e qualidade para refrescos prontos para o consumo limita a avaliação destes parâmetros físico-químicos

Currently, it has been verified an increase in the marketing of refreshments in commercially run establishments, including bars, bakeries and restaurants. This increase is due the practicality of these beverages, which can be prepared quickly and can leave in dispensers under refrigeration, denominated ´´refresqueiras´´. However, there are a few studies about the microbial populations present as well of evaluation of physical-chemical properties of these beverages. The aims of this work were to determinate…

Advisors/Committee Members: Regina Maria Nardi Drummond, Carlos Augusto Rosa, Fátima de Cássia Oliveira Gomes, Regina Maria Nardi Drummond, Ricardo Souza Dias, Inayara Cristina Alves Lacerda.

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The microbiological and physical-chemical quality of 151 pasteurized type C milk samples distributed by a governmental program in Minas Gerais state was analyzed. Milk quality was also traced to the dairies, in accordance to the type of inspection, as well as to the produce regions and season. For the microbiological analyses, means were: 6.09 x 101 MPN/mL and 2.47 x 101 MPN/mL for coliforms at 30°C and 45°C, respectively; 1.38 x 105 CFU/mL for counting of aerobic mesophilic bacteria; and 1.31 x 105 CFU/mL and 2.54 x 104 CFU/mL for counting of Staphylococcus spp. and Staphylococcus aureus, respectively. Salmonella spp. was identified in 121 (2.48%) samples. For the physical-chemical analyses, means were: 1.031 for density at 15°C, 12.40% for total solids content, 3.60% for fat, 8.80% for non-fat solids, 15.32°D for titratable acidity, and 0.525°H for freezing point. Mean of water added to milk was 2.4%. Positive result for alkaline phosphatase activity was observed in 23.18% samples and 22.52% presented negative activity of lactoperoxidase. Difference (p>0.05) was not observed among the dairy industries under different levels of inspection, and among different regions the State for the microbiological aspects; however, difference was observed (p<0.05) for the majority of the physicalchemical aspects. Difference was not observed among the seasons of the year concerning microbiological and physical-chemical aspects. It was concluded that the pasteurized milk distributed by the governmental program had unsatisfactory quality; deficient composition and can represent a potential risk to the health of the consumers

Este trabalho teve como objetivo analisar a qualidade físico-química e microbiológica de 151 amostras de leite pasteurizado tipo C distribuído em programa social governamental no Estado de Minas Gerais, assim como associar a qualidade deste leite aos laticínios conveniados ao programa de acordo com seu tipo de inspeção, meso regiões produtoras e época do ano. Para as análises microbiológicas, foram obtidas médias de 6,09 x 101NMP/mL e 2,47 x 101 NMP/mL para coliformes a 30°C e a 45°C, respectivamente; 1,38 x 105 UFC/mL para contagem de microrganismos mesófilos aeróbios, e 1,31 x 105 UFC/mL e 2,54 x 104 UFC/mL para contagem de Staphylococcus spp. e Staphylococcus aureus, respectivamente. Salmonella spp. foram identificadas em 2,48% de 121 amostras pesquisadas. Para as análises físico-químicas, foram obtidas médias de 1,031 g/mL para densidade relativa a 15°C, 12,40% de extrato seco total, 3,60% para gordura, 8,80% para extrato seco desengordurado, 15,32°D para acidez titulável e -0,525°H para crioscopia. A média de adição de água ao leite foi de 2,4%. Resultado positivo para a pesquisa de fosfatase alcalina foi observado em 23,18% e 22,52% apresentaram resultado negativo para a pesquisa de lactoperoxidase nas 151 amostras analisadas. Não foi observada diferença (p>0,05) entre os estabelecimentos sob diferentes níveis de inspeção e entre diferentes meso regiões para os parâmetros microbiológicos. No entanto,…

Advisors/Committee Members: Luiz Simeao do Carmo, Leorges Moraes da Fonseca, Monica Maria O Pinho Cerqueira, Monica Maria O Pinho Cerqueira.

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Uma nova tecnologia de sequenciamento de cDNA tem permitido uma análise detalhada e aprofundada dos transcritos em procariotos. Corynebacterium pseudotuberculosis, uma bactéria causadora de doenças, como a linfadenite caseosa, que trazem grandes prejuízos econômicos para o agronegócio mundial, foi o alvo de nossos estudos. Neste contexto, caracterizamos o perfil transcricional diferencial deste microrganismo em algumas condições que simulam o ambiente encontrado pela bactéria no hospedeiro no processo de infecção como, estresse osmótico (2M), térmico (50°C) e acidez (pH=5). No presente estudo escolhemos a plataforma SOLiDTM para tentar compreender o desenvolvimento da doença e a modulação da resposta a partir dos genes envolvidos no processo da infecção. Conseguimos detectar todas as regiões transcricionalmente ativas preditas no genoma (2057 genes), sendo que na condição controle (condição fisiológica normal), foi possível observar que 97,58% dos genes são transcritos, apresentando 2,42% de região não transcrita com valor de RPKM (Reads Per Kilobase of coding sequence per Million mapped) igual a zero. Nas condições de estresse osmótico, estresse térmico e acidez, 98,05%, 97,34%, 97,81% dos genes são transcritos, respectivamente. Dos 2064 transcritos do estresse osmótico, 48,01% foram considerados diferencialmente expressos em relação ao controle, 45,68% genes considerados diferencialmente expressos no térmico e no estresse ácido, 48,08%. Grande parte dos genes em todas as condições, induzidos ou reprimidos foi composta por proteínas de funções desconhecidas (hipotéticas) confirmando quão pouco este microrganismo é caracterizado. As análises revelaram uma forte correlação entre resposta ao estresse ácido e expressão de genes relacionados à virulência. O processo de regulação da transcrição e adesão celular estão entre os principais resultados do Blast2GO. No estresse osmótico processo de reparo e transporte transmembrana foram destaques, além do processo de adesão. No estresse térmico, menor número de genes diferencialmente expressos fizeram parte da análise e entre os principais processos estão o de oxidoredução e catabólico de ATP, gerando energia para célula sobreviver no ambiente hostil. Dentro do core estimulon (genes compartilhados entre os estresses), genes de virulência se destacaram, demonstrando que já no inicio da fase exponencial a bactéria regula a transcrição para uma resposta específica e adaptativa. Entre os reprimidos, os genes envolvidos no processo metabólico e biossintéticos foram os mais representados, demonstrando redução no crescimento, que é uma importante estratégia de ajuste da fisiologia celular para uma nova condição. O presente estudo permitiu criar um catálogo gênico que é utilizado como recurso para sobrevivência dentro de ambientes prejudiciais e conseguir escapar da resposta imune do hospedeiro. Estes resultados nos permitem sugerir possíveis candidatos à obtenção de vacinas eficientes com potencial redução das perdas no agronegócio, em estudos futuros.

A new cDNA sequencing…

Advisors/Committee Members: Vasco Ariston de Carvalho Azevedo, Vasco Ariston de Carvalho Azevedo, Anderson Miyoshi.

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A infecção crônica pelo H. pylori é um fator essencial na patogênese do carcinoma gástrico e úlcera duodenal. O gene cagA, que codifica o fator de virulência CagA, é considerado um fator de risco para as duas doenças. Recentemente foram descritos sítios de fosforilação na proteína CagA denominados EPIYA. Número aumentado do sítio EPIYA C tem sido associado com fenômenos celulares que predispõem à oncogênese. Portanto, no presente estudo foram avaliados o padrão e número de sítios de fosforilação EPIYA da proteína CagA de amostras de H. pylori isoladas de pacientes com carcinoma gástrico, úlcera duodenal e gastrite. Foram estudados 436 pacientes infectados por amostras de H. pylori cagA-positivas: 188 com carcinoma gástrico, 112 com úlcera duodenal e 136 com gastrite. Os sítios EPIYA foram determinados por PCR e os resultados confirmados por sequenciamento. Para análise estatística os pacientes foram divididos em dois grupos: no primeiro foram incluídos os que eram colonizados por amostras de H. pylori com até um sítio EPIYA C e, no segundo, os pacientes que eram colonizados por amostras com dois ou mais sítios EPIYA C. Os dados foram analisados em modelos logísticos ajustando para idade e sexo. Foi visto que os pacientes com carcinoma gástrico (41,5%) eram colonizados mais frequentemente por amostras de H. pylori contendo dois ou mais sítios EPIYA C na proteína CagA que os pacientes com gastrite (18,4%) ou úlcera duodnal (13,4%). Na análise logística, número aumentado de sítios EPIYA C permaneceu independentemente associado ao carcinoma gástrico tanto quando a comparação foi feita com gastrite (OR = 2,81; IC 95% = 1,64 4,82; p <10-3) quanto com úlcera duodenal (OR = 1,79; IC 95% = 1,27 2,52; p = 0,001). Entretanto, quando os pacientes com úlcera duodenal foram comparados com os pacientes com gastrite, quanto ao número de sítios EPIYA C, não se observaram associações (p = 0,29). Em conclusão, os resultados desse estudo demonstraram que a infecção por amostras de H. pylori contendo dois ou mais sítios de fosforilação EPIYA C na proteína CagA está associada com risco aumentado de carcinoma gástrico, mas não de úlcera duodenal

Helicobacter pylori infection is considered to play an important role in the pathogenesis of gastric carcinoma and duodenal ulcer. Among the virulence factors, CagA protein has been associated with both diseases. Recently, it was described that phosphorylation of CagA occurs within tyrosine phosphorylation motifs containing EPIYA sequence. H. pylori CagA protein with higher number of EPIYA C segments has been associated with precancerous lesions and gastric carcinoma. Therefore, in this study we evaluated the number of CagA-EPIYA C segments in H. pylori strains isolated from patients with gastric carcinoma, duodenal ulcer and gastritis. We included 436 H. pylori cagA-positive patients: 188 with gastric carcinoma, 112 with duodenal ulcer and 136 with gastritis. cagA 3 variable region was PCR amplified and the results were confirmed by sequencing. Differences in the number of CagA EPIYA C segments…

Advisors/Committee Members: Dulciene Maria M Queiroz, Dulciene Maria M Queiroz, Andreia Maria Camargos Rocha, Patricia Silva Cisalpino, Luciana Inacia Gomes, Silvia Beleza de Moura.

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Fusobacterium necrophorum é considerado membro da microbiota indígena da cavidade oral, intestino e trato geniturinário de animais e está associado a etiopatogenia de diversas doenças que acometem seres humanos e outros animais, expressando uma gama de fatores de virulência para tanto. A habilidade de produção de substâncias antagonistas, capazes de inibir a multiplicação ou matar bactérias competidoras, é considerada importante fator de virulência bacteriana. Dentre elas, destacam-se as bacteriocinas, um grupo heterogêneo de compostos antibacterianos de natureza peptídica. Nosso grupo demonstrou, pela primeira vez, a produção de substância(s) antagonista(s) por F. necrophorum ativas contra bactérias de outras espécies, bem como a natureza proteica de tais substâncias. A presente investigação teve como objetivo contribuir para a compreensão bioquímico-molecular dessas moléculas. O extrato intracelular, precipitado com sulfato de amônio à saturação de 50% de (C50) obtido a partir de cultura de F. necrophorum ATCC 25286, foi capaz de matar a amostra reveladora Peptostreptococcus anaerobius. A atividade foi completamente perdida quando C50 foi submetido à temperatura igual ou superior a 45°C e quando exposto a proteases. O extrato manteve-se estável em uma ampla faixa de valores de pH (6,0 a 11,0) e quando incubado junto a solventes orgânicos e sua atividade antibacteriana foi quase completamente perdida após tratamento com EDTA e recuperada com o acréscimo de zinco. A concentração inibitória mínima de C50 para P. anaerobius foi 6,25UA/mL, coincidindo com a concentração bactericida mínima. Em 30 minutos, todas as células bacterianas de P. anaerobius estavam mortas. A tentativa de purificação da substância antagonista foi realizada com fracionamento por precipitação com sulfato de amônio à saturação de 50%, cromatografia de troca iônica, seguida por exclusão e, finalmente, por fase reversa. Entretanto, a purificação não foi alcançada.

Fusobacterium necrophorum is considered as a member of the indigenous microbiota of the oral cavity, intestines and genitourinary tract of animals and is associated with the etiopathogenesis of several human and animal diseases, expressing a range of virulence factors for both. The ability to produce antagonistic substances that inhibit the growth or kill competing bacteria is considered an important virulence trait. Among them bacteriocins, a heterogeneous group of peptide antibacterial compounds, should be highlighted. Our group has demonstrated for the first time the production of proteinaceous antagonistic substances by F. necrophorum active against bacteria of other species. This study aimed to contribute to the biochemical and molecular understanding of these molecules. The intracellular extract obtained from a F. necrophorum culture precipitated at 50% ammonium sulfate saturation (C50) was able to kill the indicator strain (Peptostreptococcus anaerobius). C50 completely lost its activity when subjected to temperatures of 45°C or higher and when exposed to proteases. The extract…

Advisors/Committee Members: Luiz de Macêdo Farias, Maria Auxiliadora R de Carvalho, Paula Prazeres Magalhaes, Luiz de Macêdo Farias, Regina Maria Nardi Drummond, Andrea Maria Amaral Nascimento.

▼ A flora microbiana da boca é uma das mais ricas e diversas do corpo humano. É no entanto, altamente variável de indivíduo para indivíduo, sendo por isso, impossível estabelecer com rigor o número e tipo de espécies que fazem parte desse bioma. Microrganismos patogénicos presentes na boca têm vindo a ser progressivamente associados a patologias de sistemas orgânicos que ultrapassam o âmbito estrito da cavidade oral. São diversos os casos descritos de endocardites, cancro, infeções respiratórias e até diabetes, provocados por microrganismos presentes na flora oral. Dada a relevância clínica que as infeções orais têm vindo a assumir nos últimos anos, o conhecimento detalhado sobre a composição da microflora oral e a sua suscetibilidade a compostos antimicrobianos passíveis de aplicação em desinfeção oral reveste-se de particular relevância. Foram efetuadas recolhas de amostras microbiológicas da boca de pacientes da clínica de medicina dentária universitária do Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz, com o objetivo de isolar o maior número possível de estirpes encontradas para, posteriormente, se testar a eficácia antimicrobiana de dois oligómeros previamente sintetizados no decurso do projeto. Foram isoladas 103 estirpes, representando 37 espécies diferentes. Cada um dos 103 isolados obtidos foi caracterizado quanto à sua suscetibilidade aos compostos PMETOX-DDA e LPEI através da determinação da concentração mínima inibitória (MIC). Os valores médios de MIC obtidos foram de 0,530 mg.mL-1 para LPEI e 0,723 mg.mL-1 para PMETOX-DDA, sendo os valores de dispersão mais elevados para LPEI. Ambos os polímeros foram eficazes e, possivelmente, complementares enquanto agentes antimicrobianos. Os resultados deste estudo são consistentes com os previamente obtidos em ensaios microbiológicos preliminares, confirmando as poli-oxazolinas como uma promissora nova alternativa terapêutica em alternativa a agentes antimicrobianos convencionais. Paralelamente, informação sobre a composição da microflora dos diferentes compartimentos da boca foi analisada em conjunto com informação sobre a história clínica e hábitos de higiene oral de cada paciente, recolhidos por médicos dentistas através de observação e inquérito. Foram obtidos resultados significativos do teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis (p <0,05) na análise a alguns hábitos de higiene e do historial clínico. Os valores da análise de similaridade e dissimilaridade entre grupos (SIMPER) foram estatisticamente relevantes, assim como a análise ANOSIM (global R = 0,765, com um nível de significância estatística de amostra de 0,1%) confirmando perfis de distribuição diferentes de acordo com as diferentes zonas da boca. A escovagem da língua e uso do fio dental são os hábitos de higiene oral mais relevantes na colonização oral por microrganismos. Advisors/Committee Members: Moutinho, Maria Guilhermina Martins (advisor), Cunha, Angela (advisor).

▼ Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva, parasita intracelular facultativa, causadora da linfadenite caseosa (LC), uma doença infecto-contagiosa crônica que acomete pequenos ruminantes e acarreta sérias perdas econômicas para as atividades de ovinocaprinocultura. A ampla ocorrência e importância econômica da enfermidade estimulam estudos sobre as bases moleculares da virulência deste patógeno, cujas informações ainda são escassas. Dentre os fatores moleculares associados à virulência de bactérias patogênicas, têm-se destacado os internalizadores de peptídos (Opp), que são complexos protéicos multi-subunitários, pertencentes à família dos ABC transportadores. Esses internalizadores ficam localizados na membrana plasmática e tem como principal função a captação de peptídeos do meio extracelular para que sirvam como fonte de carbono e nitrogênio. Além do papel nutricional os peptídeos podem ser utilizados, por bactérias Gram-positivas, como moléculas sinalizadoras em um processo de comunicação intercelular, o qual permite às bactérias coordenarem a expressão de determinados genes em uma escala populacional. O controle de diversos processos celulares já foi relacionado ao mecanismo de comunicação via peptídeos sinalizadores dentre os quais incluem: esporulação, conjugação e virulência. Com o objetivo de se estudar o papel do transportador de peptídeos (Opp) na bactéria C. pseudotuberculosis foi construída uma linhagem mutante para o transportador Opp utilizando um plasmídeo suicida. Essa linhagem foi crescida na presença do peptídeo tóxico glutationa (GSH) nas concentrações de 5mM e 10 mM, como forma de se obter uma confirmação fenotípica da perda da capacidade da linhagem mutante em internalizar peptídeos. Porém, a linhagem mutante se mostrou sensível aos efeitos tóxicos do GSH, demonstrando que esse peptídeo pode estar sendo internalizado pela bactéria por uma via diferente do Opp ou que não exista a necessidade dele ser internalizado para ser tóxico à bactéria. Posteriormente, através de uma análise proteômica comparativa entre as proteínas extracelulares das linhagens selvagem e oppD mutante, utilizando 2-DE, foi gerado mapas protéicos que demonstraram a presença de 11 spots exclusivos na linhagem selvagem e 17 spots exclusivos na linhagem mutante. Esse resultado indica que o transportador Opp pode estar relacionado a algum processo de controle da expressão gênica em C. pseudotuberculosis. Por fim, para verificar se o transportador de peptídeos de C. pseudotuberculosis possui alguma relação com a virulência e patogenicidade dessa bactéria foram realizados ensaios in-vitro, de adesão e colonização de macrófagos, e in vivo, de infecção de camundongos BALB/c. Os resultados desses ensaios demonstraram que apesar da linhagem mutante possuir uma capacidade reduzida de aderir e infectar macrófagos em cultura durante a primeira hora de experimentação, ambas as linhagens apresentaram o mesmo potencial de causar morte, lesão, e de colonizar o baço de camundongos infectados. Através desse estudo podemos… Advisors/Committee Members: Vasco Ariston de Carvalho Azevedo, Anderson Miyoshi, Vasco Ariston de Carvalho Azevedo, Anderson Miyoshi, Andrea Maria Amaral Nascimento, Frederico Marianetti Soriani.

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The glucosamine-6-phosphate synthase is the enzyme that catalyses the conversion of D-frutose-6-phosphate to D-glucosamine-6-phosphate. This is the first step in the biochemical pathway leading to the formation of an activated form of N-acetyl-Dglucosamine, namely uridine 5-diphospho-N-acetyl-D-glucosamine. This nucleoside provides N-acetyl-D-glucosamine for biosynthesis of lipopolysacharides, peptideoglycans in bacteria and chitin in fungi, insects and crustaceans. As an enzyme participating in biosynthesis of important cell wall components, the glucosamine-6-phosphate synthase is essential for the fungi cells, and its importance for these ones was demonstrated by the deletion of its gene, that proved to be lethal. In this work, it is described the synthesis of D-arabinose derivatives, modified in C-1 and phosphorylated in C-5, as potential antifungals agents. These were designed, based on the structure of the transition state of the reaction catalyzed by this enzyme. The compounds designed, 5-O-diestilphosphoryl-E,Z-D-arabinose oxime, as well as 2-(D-arabino-1,2,3,4-tetrahydroxybutyl)-5-metil-1,3,4-oxadiazole could not be achieved. The compound modified in C-1 with a tetrazole ring and phosphorylated in C-5 was achieved in five steps. The compound 5-(D-arabino-4-diethylphosphoryloxy- 1,2,3-trihydroxybutyl)-tetrazole, as well as the others compounds sinthesized were evaluated against fungi and bacteria, however neither of them were active against the microorganism tested.

A glicosamina-6-fosfato sintase é a única enzima que catalisa a reação de conversão da D-frutose-6-fosfato a D-glicosamina-6-fosfato. Essa é a primeira reação na via bioquímica que leva à formação da forma ativada da N-acetil-D-glicosamina, a uridina-5-difosfo-N-acetil-D-glicosamina. Esse nucleosídeo fornece a N-acetil-Dglicosamina para a biossíntese de lipopolissacarídeos, peptídeoglicanos em bactérias e quitina em fungos, insetos e crustáceos. Como uma enzima participante na biossíntese de componentes importantes da parede celular, a glicosamina-6- fosfato sintase é essencial para as células fúngicas e a sua importância para as essas foi demonstrada pela deleção de seu respectivo gene, que se mostrou letal. Nesse trabalho está descrita a síntese de derivados da D-arabinose, modificados em C-1 e fosforilados em C-5, como potenciais agentes antifúngicos. Esses foram planejados com base na estrutura do carboidrato no estado de transição da reação catalisada por essa enzima. Os compostos planejados 5-O-diestilfosforil-E,Z-Darabinose oxima, bem como o 2-(D-arabino-1,2,3,4-tetra-hidroxibutil)-5-metil-1,3,4- oxadiazol não foram obtidos. O derivado contendo o anel tetrazólico em C-1 e fosforilado em C-5 foi obtido em cinco etapas. O composto 5-(D-arabino-4- dietilfosforiloxi-1,2,3-tri-hidroxibutil)tetrazol, bem como outros intermediários de síntese foram avaliados quanto às suas atividades antifúngicas e antibacterianas. Entretanto, nenhuma dessas substâncias exibiu atividade contra os fungos e bactérias testados.

Advisors/Committee Members: Fernao Castro Braga, Ricardo Jose Alves, Ricardo Jose Alves, Rosemeire Brondi Alves.

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The aminosugars are very important structural components of bacteria and fungi cell walls. Glucosamine-6-phosphate synthase (GlmS), which catalyses the first step of the aminosugar biosynthetic pathway i.e. the formation of D-glucosamine-6-phosphate from D-fructose-6-phosphate, is therefore an interesting target in the fight against microorganisms. In this work is described the synthesis of aromatics analogs of 2-amino-2-deoxy-D-glucitol-6-phosphate (ADGP) and its epimer 2- amino-2-deoxy-D-manitol-6-phosphate (ADMP) two important inhibitors of GlmS: three phosphoramides and two phosphates; and a fluorine derivative of D-fructose-6-phosphate, the substrate of GlmS. The aromatics derivatives were obtained from the reaction of 3-nitrophenol or 3- benzoylresorcinol with racemic epichlorohydrine or the appropriately protected R and S terc-butyl 1,1- dimethyl-4-hydroxymethyl-2,2-dimethyl-3-oxazolidine carboxylate. For the fluorine derivative synthesis, the protected D-arabinose was the starting material and the reaction with diethyl difluoromethylthiophosphonate afforded the difluorinated D-fructose derivative which was deprotected to give the derivative 1,1-difluoromethyl-D-fructose and was phosphorylated with hexokinase. None of the compounds showed antifungal activity against Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisae, Candida albicans and Candida tropicallys, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, Saccharomyces cerevisiae when evaluated using the agar diffusion method, in the concentration of 1 mg/mL. Antifungal activity of phosphates was evaluated by a serial dilution microplate method against Candida albicans, Candida krusei, Sacharomyces cerevisae and Escherichia coli. They showed no activity against the microorganisms tested, until the concentration of 10 mg/mL. In the enzymatic assay against GlmS, the aromatic phosphates analogs displayed modest inhibitory activity, with IC50 in the mmol L-1 range.

Os aminoaçúcares são importantes componentes estruturais da parede celular de fungos e bactérias. A enzima glicosamina-6-fosfato sintase (GlmS), que catalisa a primeira etapa da via biossintética dos aminoaçúcares que é a formação de D-glicosamina-6-fosfato a partir de D-frutose-6-fosfato, tem sido estabelecida como um alvo atrativo para o desenvolvimento de fármacos antimicrobianos. É descrita, neste trabalho, a síntese de análogos aromáticos de -amino-2-desoxi-D-glucitol-6-fosfato (ADGP) e seu epímero, o 2-amino-2-desoxi-D-manitol-6-fosfato (ADMP), dois inibidores importantes da GlmS. Além disso, é descrita também a síntese de um derivado fluorado, análogo de D-frutose-6-fosfato, um dos substratos da GlmS. Os derivados aromáticos foram obtidos por reação de 3-aminofenol ou 3- benzoilresorcinol com epicloridrina racêmica ou com derivados adequadamente protegidos de (R) e (S)-N-terc-butoxicarbonil)-2,2-dimetil-4-hidroximetil-1,3-oxazolidina. O análogo fluorado foi obtido a partir da D-arabinose protegida, a qual foi submetida à reação com o…

Advisors/Committee Members: Renata Barbosa de Oliveira, Ricardo Jose Alves, Ricardo Jose Alves, Célia Maria Corrêa, Rossimiriam Pereira de Freitas, Rosemeire Brondi Alves, Mauro Vieira de Almeida, Jorge Luiz Humberto.