▼ Abstract: The nodal primordium is the early structure of the compact AV node. It differs from the other parts of the myocardium to exhibit large cells of bright red cytoplasm and "smooth' homogeneous appearence. Throught cariometrie study a significative larger nuclei has been found when compared with -the other cells of myocardium in the human embryos of the 16 and 20, O'RAHILLY stages, In the human embryos of the stages 15 and 16, the nodal primordium recovers the astride posterior muscular ventricular septum in development, and in embryos of the stage 20 it is located in similar position of the definitive AV node. This study is according to ANDERSON et alii's finding (1976), but differs from TRUES et alii's finding (1967, 1878) who had located cells of the nodal pr imord ium in dorsal walls of the primitive atrium Advisors/Committee Members: UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS (CRUESP), Fortuna, Antonio Benedicto Prado, 1928- (advisor), Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas (institution), Programa de Pós-Graduação em Medicina (nameofprogram).

▼ Apesar dos avanços obtidos nos últimos anos nas técnicas de maturação, fecundação e cultivo in vitro de embriões bovinos, a qualidade dos embriões produzidos in vitro ainda é inferior a dos in vivo. O ambiente de cultivo após a fecundação é considerado responsável pela qualidade dos embriões. Dentre os fatores que podem influenciar o ambiente de cultivo, o estresse oxidativo causado pela alta tensão de O2 tem recebido especial atenção. Atualmente, a maioria dos sistemas de cultivo utilizada para a PIV usa o meio SOFaaci com atmosfera de 5% de O2. Portanto, o presente estudo teve por objetivo comparar a produção de embriões em sistema de cultivo com alta e baixa tensão de O2. Um total de 1118 ovócitos obtidos de ovários de abatedouro foram maturados e fecundados in vitro. Dezoito horas após a inseminação (pi) os zigotos foram separados em 2 grupos. No primeiro grupo (T1) os zigotos foram lavados e transferidos para o meio de cultivo SOFaaci e cultivados por 7 dias em atmosfera de 5% CO2 em ar, à 39C. No outro grupo (T2), os zigotos foram desnudados por pipetagens sucessivas, e transferidos para o meio SOFaaci, onde foram cultivados em atmosfera de 5% CO2 e 5% de O2, a 39C. As taxas de clivagem foram avaliadas 48 horas pi e as de blastocisto em D6 e D7 pi. De ambos os grupos, um total de 94 embriões no estágio de blastocisto expandido em D7 foram fixados e corados com aceto-orceína para contagem do número de células, e 7 "pools" com 15 embriões de cada tratamento, foram congelados para avaliação da expressão de genes relacionados ao estresse oxidativo, sendo superóxido dismutase (Mn-SOD), catalase e glutationa peroxidase (GPX4). Os dados relativos à taxa de clivagem e blastocisto foram analisados pelo teste do Chi-quadrado, os de número de células pela análise de variância e os relativos à expressão gênica, pelo teste t de Student ou teste de Mann-Whitney. A taxa de clivagem foi semelhante (P>0,05) para os grupos sendo 77,4% para o T1 e 79,9% para o T2. A taxa de blastocisto em D6 foi maior (P<0,05) no grupo cultivado em baixa tensão de O2 (40,7%) do que no de alta tensão (33,8%). Entretanto, a taxa de blastocisto em D7 foi similar (P>0,05) para os dois grupos, sendo 44,7% e 47,1% para T1 e T2, respectivamente. O número total de células (T1= 175,654,1; T2= 160,641,8) dos embriões, não variou (P>0,05) entre os dois sistemas de cultivo. A quantidade relativa de transcritos para o gene Mn-SOD foi maior (P<0,05) na presença de alto O2, para a catalase e a GPX4 o nível de expressão foi semelhante nos dois sistemas de cultivo. Esses resultados sugerem que o cultivo de embriões bovinos em meio SOFaaci sob alta tensão de O2 na presença de células do cumulus não afeta a quantidade e qualidade dos embriões produzidos in vitro. É possível que as células do cumulus tenham um papel importante na retirada de substâncias indesejáveis minimizando o estresse oxidativo causado pela alta tensão de O2. Advisors/Committee Members: Margot Alves Nunes Dode, Rodrigo Andrés de Souza Penãloza.

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Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Biologia Molecular em Saúde.

Escola Superior de Saúde Egas Moniz.

A via de sinalização Notch é um mecanismo molecular conservado em termos evolutivos que regula o destino celular em vários sistemas, tanto na embriogénese como na idade adulta. No sistema reprodutor adulto masculino e feminino, o envolvimento desta via encontra-se descrito em diversos processos mas a informação acerca desta via na gónada embrionária é escassa. Assim, este trabalho pretende aprofundar o conhecimento acerca do envolvimento desta via na gónada embrionária, tendo como objetivos analisar o padrão de expressão dos membros da via durante o desenvolvimento da gónada e avaliar a função do ligando Dll4 durante este processo. Para realizar a caracterização do padrão de expressão dos membros da via Notch no desenvolvimento da gónada foram utilizados murganhos da estirpe CD1. Para determinar a função in vivo do ligando Dll4 foi utilizada a linha de murganhos transgénicos Dll4 lox/lox CAG-Cre, sendo analisados os seguintes estádios de desenvolvimento: indução das fêmeas gestantes aos 9.75dpc e recolha dos embriões aos 11.5dpc; e indução das fêmeas aos 11.5dpc e recolha dos embriões aos 13.5dpc.

Observou-se a expressão de membros e efetores da via na gónada embrionária de macho e de fêmea ao longo do seu desenvolvimento. Na gónada embrionária de macho observou-se expressão de vários membros da via nas células germinativas, salientando-se o facto de a expressão de Dll4 se tornar específica das células de Leydig a partir dos 12.5dpc. Este resultado sugere que a via poderá desempenhar um papel na regulação da população de células de Leydig fetais. Na gónada embrionária de fêmea observou-se durante o seu desenvolvimento a presença de membros e efetores da via nas células germinativas, facto que não tinha sido anteriormente descrito.

Não foi possível obter resultados conclusivos acerca da função do ligando Dll4 no desenvolvimento da gónada, contudo, este trabalho permitiu adquirir novos conhecimentos acerca da via Notch no desenvolvimento da gónada embrionária de ratinho.

Advisors/Committee Members: Trindade, Alexandre, Silva, Maria Elisabete.

▼ (Attalea phalerata e Bactris glaucescens (Arecaceae, Arecoideae): fenologia e ecologia da polinização no Pantanal, Brasil). Foram estudadas a fenologia reprodutiva e vegetativa e a ecologia da polinização das palmeiras simpátricas Attalea phalerata e Bactris glaucescens (Arecaceae) no Pantanal, Brasil, em área de mata ciliar sujeita a inundação periódica. Attalea phalerata tem estipe solitário e produz inflorescências estaminadas, pistiladas e mais raramente bissexuais que abrem durante o dia. Bactris glaucescens é uma palmeira com estipes múltiplos e tem inflorescências bissexuais com antese noturna. Ambas as espécies apresentaram quebra e brotamento foliar ao longo do ano. Attalea phalerata apresentou floração contínua durante todo o ano, com o amadurecimento dos frutos ocorrendo na época seca. Em B. glaucescens a floração ocorreu simultaneamente com a frutificação por cerca de sete meses, sendo que a produção de frutos pode ser influenciada pela temperatura e nível de inundação. As duas espécies não são anemófilas, e suas estruturas florais têm características morfológicas associadas à polinização por insetos, principalmente besouros. Em A. phalerata, os principais polinizadores foram os besouros Mystrops sp. (Nitidulidae) e Madarini (Curculionidae). Derelomus sp. (Curculionidae) e Paratenetus sp. (Tenebrionidae) visitaram B. glaucescens durante o dia podendo polinizar as flores desta espécie. É provável que as duas palmeiras estudadas compartilhem polinizadores, pois Mystrops sp., que é um polinizador habitual de espécies de Bactris, foi observado visitando inflorescências de A. phalerata. Advisors/Committee Members: Sigrist, Maria Rosângela (advisor).

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Tese de mestrado, Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento), 2007, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências

Fibronectin is an abundant glycoprotein of the extracellular matrix, which has been shown to play a role in a variety of functions such as cell proliferation, survival, migration and differentiation. Fibronectin is assembled into a fibrillar matrix through a cell-mediated process involving their heterodimeric membrane receptors, integrins. Recently, the work of our group has evidenced the importance of fibronectin in somitogenesis and how the ectoderm and mesoderm collaborate in the construction of the fibronectin matrix of presomitic mesoderm (Rifes et al., 2007). In the present work, we further characterised the expression patterns of fibronectin (Fn1), integrin α5 (Itga5), the main sub-unit involved in fibronectin assembly, and integrin α4 (Itga4), during chick embryonic development. Fn1 transcripts are strongly expressed in most epithelia, mainly in the ectoderm in all stages studied. Itga5 is initially expressed in the primitive streak and node and it is later found in the ingressing mesoderm and many of its derivates, especially the heart and vascular primordia. Itga4 transcripts are also detected in the node and mesoderm, but later it is expressed in the dorsal neural tube and somite derivates. Finally, we also established an in vitro culture system of presomitic mesoderm cells by using different enzymes and substrata. Immunofluorescence labelling of fibronectin shows that isolated PSM cells in culture can assembly a fibronectin matrix, even when it was previously removed by dispase. In the tested culture conditions, these cells remained in a non-proliferative mesenchymal-like state, expressing very low levels of both N-cadherin and ß-catenin. These data suggest that fibronectin is not only an important component of the extracellular matrix in vivo and in vitro, but also that its presence in various tissues during the early stages of chick development is imperative

Advisors/Committee Members: Rodrigues, Maria Gabriela.

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Tese de mestrado, Biologia (Biologia Evolutiva), 2008, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências

Após a fecundação, uma percentagem de 2-7% dos zigotos humanos são monopronucleados (1PN), ou seja, não apresentam uma constituição morfológica normal de dois pronúcleos e dois glóbulos polares (2PN2PB). As causas genéticas do aparecimento destes zigotos não se encontram bem esclarecidas, havendo somente dois estudos realizados em zigotos 1PN, nos quais as causas apontadas são a activação partenogenética, degeneração uniparental do genoma e cariogamia. O objectivo deste trabalho foi tentar esclarecer qual a origem genética dos zigotos 1PN e os mecanismos celulares que ocorrem durante a sua formação. Para tal, fomos analisar 82 zigotos 1PN, 18 de ciclos de fertilização in vitro (IVF) e 64 de ciclos de microinjecção intracitoplasmática (ICSI), sob consentimento informado dos pacientes do Centro de Genética da Reprodução A. Barros (CGR). Os 82 zigotos e seus glóbulos polares foram analisados por hibridização in situ com fluorescência (FISH) para marcação dos cromossomas 18, 21, X e Y. Vinte e dois destes zigotos foram também analisados por Imunofluorescência (IF) com anticorpos para marcação das laminas nucleares e histona H3 tri-metilada na lisina 9 (MeH3K9). Os resultados observados indicam que nos zigotos 1PN estão presentes dois pronúcleos e não apenas um em 88% dos casos IVF e 42% dos casos ICSI. Os mecanismos de formação predominantes na ICSI são a não descondensação do espermatozóide (58%) e a ruptura prematura do invólucro nuclear (pPNBD) (42%) mecanismo aqui descrito pela primeira vez e que consiste numa desagregação precoce das laminas nucleares. Já na IVF, o mecanismo predominante foi a pPNBD (89%). Quanto à constituição cromossómica dos pronúcleos, 69.5% apresentaram uma constituição haplóide e 30.5% aneuplóide. Foram observados mecanismos novos de formação destes zigotos: pPNBD quer feminino quer masculino e cariocinese, não se confirmando a activação partenogenética, degeneração uniparental do genoma e cariogamia, previamente descritos

After fertilization, 2-7% of the zygotes are unipronucleated (1PN), which means they do not display a normal morphological constitution of two pronuclei and two polar bodies (2PN2PB). The genetic causes of the appearing of these zygotes are not clear, and only two studies were done in 1PN zygotes, in which the reported causes are the parthenogenetic activation, uniparental genome degeneration and karyogamy. The objective of this study was trying to clarify what is the genetic origin of 1PN and the cellular mechanisms which occurs during their formation. For that, we analyzed 82 1PN zygotes, 18 from in vitro fertilization (IVF) cycles and 64 from intracytoplasmatic sperm injection (ICSI), under informed consent of the patients of the Centre for Reproductive Genetics A. Barros (CGR). The 82 zygotes and their polar bodies were analyzed by fluorescent in situ hybridization (FISH) to chromosomes 18, 21, X and Y. Twenty-two of these zygotes were analyzed by…

Advisors/Committee Members: Sousa, Mário, Thorsteinsdóttir, Sólveig, 1962-.

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Tese de mestrado, Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento), 2008, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências

A morfogénese da mesoderme inicia-se com a regionalização das células que ingressaram na gastrulação formando-se a mesoderme lateral, a intermédia, a paraxial e a axial. A morfogénese está relacionada com fenómenos de epitelização e desepitelização. A matriz extracelular, além de suportar as células, regula todo o seu comportamento (crescimento, proliferação, migração, etc). Fazem parte desta matriz colagénios, fibronectina, laminina, proteoglicanos entre outros. A função primária dos proteoglicanos é o de hidratarem a matriz podendo, no entanto, servir de barreira ou guia na migração de células ou proporcionar sinais parácrinos e funcionar como co-sinalizadores. Neste trabalho pretendeu-se estudou-sear a distribuição de alguns destes proteoglicanos durante a morfogénese da mesoderme. Pela sua distribuição nos espaços que separam as camadas germinativas e os diferentes tecidos mesodérmicos, foi estudada a função dos proteoglicanos de sulfato de condroitina (CSPG). Para isto fez-se cultura de explantes posteriores de embriões de galinha em meio de cultura contendo condroitinase. Sem CSPGs: (1) os espaços que separam os tecidos não se formam ficando estes justapostos; (2) a matriz de fibronectina não se forma convenientemente nem em quantidade nem em qualidade; (3) a polarização das células epiteliais é deficiente; (4) devido à polarização deficiente os sómitos e a notocorda perdem a sua forma original esférica ou cilíndrica; (4) os somitos epiteliais perdem a sua estabilidade chegando nalguns casos a fundir; e (5) os primórdios vasculares não se formam por falta de fendas somíticas. Estes resultados levaram-nos a concluir que os CSPGS e os espaços criados por eles têm a função de: (1) regionalizar a mesoderme; (2) permitir a formação de matriz extracelular capaz de orientar e polarizar as células em estruturas epiteliais; (3) manter a estabilidade das estruturas epiteliais por formar barreiras anti-migração e (4) proporcionar espaço para a construção de novas estruturas celulares

Morphogenesis of mesoderm starts with the regionalization of mesodermal cells that ingress through the process of gastrulation and their organization into lateral, intermediate, paraxial and axial mesoderm. The extracellular matrix is known to give structural support to cells within an organism, but also controls cell behavior (growth, proliferation, migration etc). It is composed of collagens, fibronectin, laminin, proteoglycans among others. The primary function of proteoglycans is to hydrate the extracellular matrix, but they can also serve as migration guides or barriers and bind paracrine factors, sometimes even function as co-signaling agents. In the present work, the distribution of some proteoglycans during the morphogenesis of mesoderm was studied. Because of its prominent presence in the space that separates the different germ layers and the different mesodermal regions, the role of chondroitin sulphate…

Advisors/Committee Members: Thorsteinsdóttir, Sólveig.

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Tese de mestrado, Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências

Hox genes play a fundamental role in anterior-posterior patterning and are remarkably conserved throughout evolution (Slack et al., 1993). Their products are transcription factors that regulate a specific set of genes with essential functions in development. Although different Hox genes show a notable functional specificity in vivo, they demonstrate a surprisingly low DNA-binding specificity in vitro. Sequence analysis can provide a way to understand how Hox genes achieve their biological specificity (Prince, 2002). Genetic experiments revealed that Hox genes are involved in global patterning processes in the axial skeleton to produce the axial formulae. Hox group 10 genes, in particular, have been shown to repress thoracic rib formation, since their overexpression in the presomitic mesoderm causes a ribless phenotype and their global inactivation resulted in extra ribs (Wellik et al., 2003, Carapuço et al., 2005). Two peptide domains were identified in Hox10 proteins which are conserved among all the Hox 10 members and are absent from all other Hox proteins. One of these is an octapeptide located just N-terminal to the homeodomain. The purpose of this work is to understand the role of this octapeptide in Hox10 protein function. This is being approached by the genesis and functional analysis of transgenic mice expressing mutant Hoxa10 proteins that contain specific deletions or amino acid changes in this domain. In previous transgenic assays, the overexpression of Hoxb9 gene in the presomitic mesoderm did not produce an abnormal axial skeleton phenotype. For this reason, this gene was used to generate chimeric contructs with the Hoxa10 gene. The results obtained show that the removal of the octapeptide is sufficient to block the rib-repressing activity of Hoxa10 when expressed in the presomitic mesoderm. In addition, introduction of this peptide motif, as well as the whole Hoxa10 sequence N-terminal to it, into the Hoxb9 protein produced a partial ribless phenotype. These results indicate that the octapeptide is necessary for the rib-repressing activity of Hoxa10 but it does not seem to be sufficient for this function, at least individually

Resumo alargado em português disponível no documento

Advisors/Committee Members: Crespo, Eduardo G., Perez, Moisés Mallo.

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Tese de mestrado, Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências

In this thesis, we sought to analyze the dynamics of amniote and anamniote embryo axis elongation and the possible role of the notochord. For that, we chose the chick and zebrafish as representative model organisms of each group. We found that in the zebrafish embryo, elongation has two different phases during the stages analysed, from shield to 15 somite stage. The first phase is characterized by a constant (i.e., linear) growth rate which is faster than that observed during the second phase. The first phase occurs simultaneously with the epiboly movements of the basltoderm and yolk-syncytial layer (YSL). In chick embryos, we also find a constant (linear) growth phase which spans from stage HH4-11 (Hamburger & Hamilton 1951), a period during which the chick embryo forms structures homolog to those formed by zebrafish embryos during the first (linear) growth phase. Furthermore, in chick embryos, we found that the cranial portion elongates at a slower rate than that of two other portions of the embryo: the segmented and pre-somitic portions of the embryo, which contain all tissues adjacent to the segmented and pre-somitic mesoderm, respectively. Using micromanipulation techniques we show that elongation in the chick is independent of the primitive streak and a direct connection of Hensen's node to the extra-embryonic tissues. This contrasts with zebrafish embryo development where it has been well established that axis extension only occurs if there is an intact connection between the embryo and the YSL. We propose that the structures that could contribute to axis extension are: the notochord, the neural tube and the paraxial mesoderm. Again, using micro-manipulation techniques, we show that none of three different portions of the notochord (cranial, segmented and pre-somitic ) are essential for embryo axis elongation. However, preliminary experiments suggest that the presence of the whole notochord might contribute to the process of embryo axis extension. This work shows that the notochord is not the main driver of early embryo axis extension in amniotes, a hypothesis that had been advanced in the literature often but had not yet been formally tested. Clearly, the forces that shape the early vertebrate embryo into its typical elongated shape come from tissues inside the embryo itself, other than the notochord. In amniotes, these forces have evolved in order to allow the embryo to extend autonomously, without the additional force produced by expanding extra-embryonic tissues, as still seen in most anamniotes (e.g., fish and amphibians)

Resumo alargado em português disponível no documento

Advisors/Committee Members: Martins, Gabriel G., Thorsteinsdóttir, Sólveig, 1962-.

▼ Abstract: It was studied in rats the influence of 5-fluoruracyl on the formation of dental germ and external malformations of rats embryo born from treated mothers. 5-fluoruracyl was administered intraperitonealy in single dose to each rat, that is 10, 20, 30 and 40 mg/kg in different phases of pregnancy: 9th, 10th, 11th, 12th or 13th days. The fetuses were examined at the 21st of day of pregnancy, after Caesarian operation. They were examined regarding to external malformations, the heads cut out of hystological examination of dental germ. The results were the following according the days of pregnancy the drug was administered: a)9th day:dose of 10 mg/kg caused respectively 21 and 20% of external malformations and 15 and 19% of anormal dental germ; all of the embryos were reabsorbed with doses of 30 and 40 mg/kg; 10th day:doses of 10, 20 and 30 mg/kg caused no malformations and dose of 40 mg/kg induced 94,2% of fetal reabsortionl 11th day:doses of 10 and 20 mg/kg caused no malformations while with those of 30 and 40 mg/kg total reabsortion of fetuses occurred; 12th day:only the dose of 10 mg/kg caused no abnormal fetuses; the doses of 20 and 30 mg/kg induced respectively 22 and 47% of malformations and 26-21% of dental germ agenesis; the dose of 40 mg/kg induced 97% of embrionary reabsortion; 13th day: doses of 10 and 20 mg/kg had no influence on fetuses; the one of 30 mg/kg caused 72% of malformations and 20% of dental agenesis; with the dose of 40 mg/kg 63% of the embryo were dead at the birth Advisors/Committee Members: UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS (CRUESP), Mattos Filho, Thales Rocha de, 1947- (advisor), Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba (institution), Programa de Pós-Graduação em Ciências (nameofprogram).

▼ Condições de cultivo in vitro também afetam a produção de embriões e a expressão de importantes genes, podendo alterar a competência de oócitos para a produção de embriões futuros. O FSH em baixas concentrações pode afetar a produção desses embriões. A busca por melhores condições de cultura e um sistema in vitro que seja menos variável e ao mesmo tempo em que simule o animal in vivo, levou ao desenvolvimento de vários sistemas de cultura para a maturação in vitro de oócitos bovinos. Para comparar a eficiência dos sistemas de MIV foram utilizados quatro grupos: 1) TCM-199 controle; 2) α-MEM, 3) α-MEM 1 FSH 4) α-MEM 10 FSH. O meio de cultura do grupo 1, é um meio não definido, devido a presença de soro fetal bovino utilizado. Os grupos dois, três e quatro são definidos, onde foi usado o polyvinilalcohol-PVA como doador de macromolécula sintética. FSH de suíno foi usado nos grupos 1, 3 e 4. No 1 e 3 grupo o a concentração de FSH foi de 1 ng /mL e no 4 grupo a concentração foi 10ng/mL. Ovários bovinos foram coletados em um abatedouro. Oócitos com citoplasma homogêneo e com mais de três camadas de células da granulosa foram utilizados. Oócitos maturos dos quatro tratamentos foram fertilizados in vitro com sêmen preparado pelo método de gradiente Percoll. Prováveis zigotos com até duas ou três camadas de células do cumulus foram cultivados em gotas de 50 ml de meio SOF, acrescido de 10% de SFB e 1 mg /mL BSA sob óleo mineral em uma atmosfera úmida 5% CO2 a 38,5 C. A taxa de clivagem foi avaliada 72 horas após a FIV, taxa de blastocisto foi avaliada 168-192 horas pós FIV. As taxas de clivagem e blastocisto foram calculados com base no número de oócitos. A expressão dos seguintes genes (Bax, Bcl-2 e Jogadas 43) foram avaliadas, em blastocistos por RT-PCR. O teste de ANOVA foi utilizado para comparar o número de blastocistos. Não houve diferença na proporção de embriões com mais de oito blastômeros em todos os grupos testados, indicando que a taxa de desenvolvimento durante as primeiras 72h pós FIV, foi semelhante nos oócitos maturados em meio quimicamente definido e de oócitos maturados no meio contendo soro. O gene Bax é um marcador pró-apoptóticas e o Bcl um marcador anti-apoptótico. A conexina 43 (Cx43) pode ser um marcador de competência do embrião. GAPDH foi utilizado como controle interno. O gene Bax não foi expresso em nenhum grupo. Os genes Bcl-2 e da conexina 43 foram expressos, principalmente no α-MEM 10. Resultados inéditos mostram que não foram observadas diferenças na taxa de blastocisto em nenhum dos grupos (30% a 40%), a forte expressão de BCL2 e da Cx43 no grupo contendo 10 ng / mL de FSH podem indicar que FSH pode melhorar a qualidade do embrião, sob condições definidas. Advisors/Committee Members: Alzira Amélia Martins Rosa e Silva, Adriana Lofrano Alves Porto, Lucilia Domingues Casulari da Motta.

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Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011

During limb development, the proximal-distal outgrowth is controlled by a thickening of ectodermal cells at the distal tip of the limb, termed apical ectodermal ridge (AER). This transient embryonic structure is essential for the patterning and limb outgrowth, being a conserved feature in vertebrate development and it is also important to maintain proliferation in adjacent tissues before their differentiation. Despite AER induction and maintenance are orchestrated by complex interactions between the FGF, WNT/β-catenin and BMP signaling pathways, little is known about the molecules involved in the maintenance of the proliferation versus apoptosis and the renewal of its cells during development. In recent studies, it has been showed by our lab that one of these molecules, oct4, could be involved in the control of proliferative balance within the AER cells. In this thesis we present evidences of the involvement of two more molecules in this process, lgr5 and lgr6, which are known as adult stem cells markers. In here, we describe the expression pattern of lgr5 and lgr6 during limb bud development using the chicken embryo as a model and show that their expression patterns in the limb bud are consistent with the areas of cell proliferation within the AER. Moreover, we performed lgr5 gain-of-function experiments through in ovo electroporation and studied the relationship of lgr5 and lgr6 with different signaling pathways known to be involved in the AER induction and maintenance. The phenotypes obtained point to the involvement of lgr5 in the maintenance of a proliferative niche in the AER. We also present here, evidences showing that lgr6 is controlled by WNT signaling. Our results support a model in which lgr5 and lgr6 control the activation and maintenance of a niche of undifferentiated cells that are in continuous proliferation at the base of AER. This niche can be responsible for the renewal of AER until it disappears by massive programmed cell death.

Advisors/Committee Members: Rodríguez-León, Joaquín, Sucena, Élio.

▼ Dada a importância comercial de Pinus elliottii e do híbrido Pinus elliottii x Pinus caribaea, e a necessidade de desenvolver uma bateria de protocolos de cultura in vitro para aplicação em programas de (micro) propagação e em programas de investigação em geral (eg, fisiologia, biologia molecular, etc), estabeleceu-se como objetivo principal estudar o efeito de vários fatores (endógenos e exógenos) na indução de: a) tecido caloso (importante em estudos fundamentais de fisiologia, manutenção de germoplasma, morfogénese, etc); b) tecido caloso embriogénico (importante para a regeneração de plantas por ES, estudos de criopreservação, etc). Neste sentido, embriões zigóticos maduros (EZM) e cotilédones foram sujeitos a diferentes concentrações de reguladores de crescimento (2 mg/L de 2,4-D; 2 mg/L de NAA e 0,02 mg/L de TDZ). Os primeiros sinais de callus surgiram ao fim de 15 dias. A concentração de reguladores de crescimento mais eficiente em EZM foi 2 mg/L de 2,4-D com uma taxa de indução de calli de 85% e em cotilédones foi 2 mg/L de 2,4-D com 55% de indução de calli. EZM foram sujeitos a diferentes concentrações de reguladores de crescimento (2,4 mg/L 2,4-D + 1 mg/L 24-epiBr; 8 mg/L 2,4-D + 4 mg/L BAP); fontes de carbono (30 g/L de sacarose e 30 g/L de maltose) e diferentes fatores de stresse, nomeadamente calor (80ºC), frio (-15ºC), ácido salicílico (AS) (1 mg/L), prolina (250 mg/L), peróxido de hidrogénio (H2O2) (9 μL/L) e putrescina (2 mg/L) com o objetivo de testar o seu potencial na indução de callus. A combinação 2,4-D + 24-epiBr resultou em 10 % de explantes com calli, e a 2,4-D + BAP representou 30 %. Os meios com sacarose e maltose representaram, igualmente, 20% de explantes com calli. O frio induziu callus em 100% dos explantes contrariamente ao calor que apenas produziu 5 %. Em resposta ao AS, prolina, H2O2 e putrescina a indução de callus foi de 93%, 95%, 90% e 100%, respetivamente. As condições que levaram a maior produção de callus foram o frio e a putrescina. Estes resultados suportam a possível indução de callus nestas duas coníferas, e suportam dados preliminares no sentido da otimização de protocolos eficazes para a ES. Advisors/Committee Members: Pinto, Glória Catarina Cintra da Costa (advisor), Santos, Maria da Conceição Lopes Vieira dos (advisor), Dias, Maria Celeste Pereira (advisor).

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O ácido retinóico (AR) é essencial para a embriogênese. A principal enzima sintetizadora de AR durante o desenvolvimento é a ALDH1A2 (RALDH2), uma retinaldeído desidrogenase que converte retinaldeído a AR. Para entendermos como o gene da aldh1a2 é regulado identificamos regiões evolutivamente conservadas (ECRs) em vertebrados e testamos seu potencial regulatório. Identificamos uma ECR localizada no intron1 da aldh1a2, conservada em anfíbios, aves e mamíferos que atua como um enhancer em estruturas derivadas de ectoderme, endoderme e mesoderme. Animais transgênicos transientes e permanentes mostram a ativação desse enhancer na região da placa do teto do tubo neural e epicárdio, local onde esse enhancer é ativado em células derivadas do órgão pro-epicárdico após o contato e/ou proximidade com células do miocárdio. A identificação de um enhancer conservado no gene da aldh1a2 suporta a idéia de que esse gene possui uma regulação modular e mostra que a abordagem evolutiva é uma eficiente ferramenta para a identificação de mecanismos de controle desse gene.

Retinoic acid (RA) is essential for embryogenesis. The key RA synthetic enzyme during early development is ALDH1A2 (RALDH2), a retinaldehyde dehydrogenase that converts retinaldehyde into RA. To understand how aldh1a2 is regulated we screened the gene for evolutionary conserved regions (ECRs) among vertebrates and assayed their regulatory potential. We describe an aldh1a2 intron 1 ECR (identified as RALDH2.2) that is conserved in amphibians, avians and humans and acts as an enhancer in derivatives of ectoderm, endoderm and mesoderm. Transient and stable transgenesis in mice reveal strong activity of the raldh2 intron 1 enhancer at the roof plate of the neural tube and at the growing epicardium. Transgenic mice indicate that the enhancer is activated in proepicardium-derived cells by contact and/or close proximity to the myocardium. The identification of an aldh1a2 conserved enhancer supports the idea of a modular regulation and shows that the evolutionary approach is an efficient tool to identify control mechanisms of the aldh1a2 gene.

Advisors/Committee Members: Xavier Neto, José.

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Tese de mestrado, Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências

A AER é uma estrutura ectodérmica que tem um papel essencial no desenvolvimento dos membros, sendo conservada desde peixes a tetrápodes. A sua acção depende da via de sinalização por Fgf. Os estudos realizados neste trabalho visam perceber a influência, a nível do desenvolvimento do membro em vertebrados, de elementos de uma família de proteínas denominada Flrt. Esta família é composta por 3 elementos, Flrt1, Flrt2 e Flrt3 e está ainda pouco estudada. São proteínas transmembranares caracterizadas por motivos de repetições ricas em leucinas na sua parte extracelular. Existe ainda um domínio intracelular, pouco estudado, mas que se sabe ser essencial ao papel desta família como regulador da actividade da sinalização por Fgf. Flrt3 é o membro mais bem caracterizado. Em Xenopus laevis foi verificado que Flrt3 é regulado positivamente por Fgf, e sendo ele próprio um regulador positivo desta via. Em galinha Flrt3 é essencial à correcta expansão do eixo proximal-distal do membro em desenvolvimento, sendo regulado por Wnt. Este gene é expresso na AER em galinha e ratinho. Em Peixe-zebra a sua função ainda não é completamente percebida. Este trabalho de investigação consiste na clonagem de dois membros da família Flrt (Flrt2 e flrt3) e análise da expressão destes genes em embriões de Peixe-zebra nos estádios 32 e 48 horas pós fertilização. Os resultados não mostraram marcação para o gene Flrt2 e para Flrt3 sugerem uma marcação no mesênquima, ao contrário do que ocorre com outros modelos. No entanto estes resultados devem ser considerados preliminares, sendo necessária a avaliação de hibridações in situ e análises de imunohistoquímica em cortes histológicos

AER is an ectodermal structure, preserved in animals from fish to tetrapods, that plays an essential role in limb development and whose function depends on Fgf signalling. The studies conducted within this research project aim for the understanding of the influence exerted by elements from the Flrt protein family on the limb development in vertebrates. This family consists of 3 elements - Flrt1, Flrt2 and Flrt3 - and still needs further study. These are transmembrane proteins identifiable by their extracellular leucine-rich repeat motifs. There is also an intracellular domain, yet to be further studied, that is known to be of vital importance to the part played by this family as a regulator of Fgf signalling activity. Flrt3 is the best characterised member of this family. In Xenopus laevis, Flrt3 was proved to be positively regulated by Fgf, and acts itself a positive regulator of this signaling pathway. In chicken embryos Flrt3 is vital to the correct expansion of the proximal-distal axis from the developing limb, being regulated by Wnt. This gene shows expression in AER from chicken and mouse. In zebrafish its function is not yet fully understood. This project consists in cloning two members of the Flrt family (Flrt2 and flrt3) and analysing the…

Advisors/Committee Members: León, Joaquín, Thorsteinsdóttir, Sólveig.

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Tese de mestrado, Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências

Haematopoiesis is a tightly regulated developmental cascade responsible for the generation of all haematopoietic cell types. Many molecules have been involved in this process, namely tyrosine kinase family members. This family includes the tyrosine kinase receptor RET, encoded by a proto-oncogene and classically allocated to nervous system function. Herein we show that Ret and its co-receptors Gfra1 and Gfra2 are highly expressed in haematopoietic stem cells (HSC). Using mice homozygous for a null mutation of Ret we show that ablation of this gene has a major impact in the foetal liver cellularity. Accordingly, the HSC compartment of Ret deficient embryos shows a 2.2 fold reduction when compared to their WT littermate controls. Despite reduced foetal liver cellularity, HSC from Ret null mice display normal differentiation into B lymphocyte, erythroid and myeloid lineages. Conversely, Ret null HSCs have a reduction of quiescent cells, which also correlated with a reduction in long‐term reconstitution haematopoietic stem cells. These findings suggest defects in haematopoietic activity and reconstitution potential. Accordingly, HSCs from Ret-/- origin have a reduction in CFU‐S potential and poorly reconstitute lethally irradiated hosts. In fact, two months after competitive transplantation, cells from Ret null origin represented less than half of the haematopoietic cells in recipient mice, while WT cells already accounted for more than 80% of the haematopoietic pool of the host. Thus RET emerges as a novel molecule in haematopoiesis, supporting the concept that molecular mechanisms historically ascribed to specific tissues can be more widely used in order to orchestrate the function of systems derived from different germ layers

Resumo alargado em português disponível no documento

Advisors/Committee Members: Veiga-Fernandes, Henrique, Sucena, Élio.

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Humana e Ambiente), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências

Resumo alargado em português disponível no documento

Advisors/Committee Members: Plancha, Carlos E., Dias, Deodália Maria Antunes, 1952-.

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Tese de mestrado, Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências

As correntes e campos eléctricos endógenos são conhecidos desde o século XVIII. Surgem da acumulação diferencial de iões em ambos os lados de uma estrutura electricamente isolante, consequência de um transporte iónico direccional e selectivo através dela. Isto resulta na formação de uma diferença de potencial que, se a estrutura for danificada, gera uma corrente eléctrica. A importância das correntes e campos eléctricos tem sido reconhecida em processos biológicos importantes, mas a sua influência na regeneração tem suscitado grande interesse devido às potenciais aplicações biomédicas. Observações prévias de fluxos iónicos realizadas pela equipa sugerem que as correntes protónicas poderão também estar envolvidas na regeneração da barbatana caudal de peixe-zebra adulto. Reforçando estes dados, provou-se1 que as correntes protónicas são necessárias e suficientes para induzir a regeneração em larvas de Xenopus laevis, e que eram mantidas activamente pela regulação positiva de transportadores iónicos específicos as V-ATPases. Este trabalho teve como objectivo a análise específica do papel das V-ATPases na regeneração da barbatana caudal de peixe-zebra adulto. Os padrões de expressão génica obtidos confirmam localização deste gene nas células do blastema e revelam uma forte presença da proteína correspondente nas células mais exteriores do epitélio de ferida. O silenciamento génico específico da V-ATPase em barbatanas caudais em regeneração mostrou que este transportador parece ser especialmente importante no final da maturação do blastema e início do crescimento regenerativo. Em geral, os resultados obtidos neste estudo são consistentes com os dados de fluxos iónicos e com os perfis de expressão génica previamente obtidos, apontando para um possível papel da V-ATPase no estabelecimento e manutenção de correntes iónicas e campos eléctricos endógenos essenciais à regeneração

Endogenous electric fields and currents arise as a consequence of specific and directional ion transportation. Consequently, ions accumulate differentially and establish a voltage difference across an electrically resistant structure. Disrupting this barrier leads to an ion flow, which generates an electric field across the surrounding tissues. These phenomena have been shown to have an important role in various biological processes, including vertebrate regeneration. Previous results from the lab implicate proton fluxes and, in particular, V-ATPases in zebrafish caudal fin regeneration. These findings were further reinforced by a recent study that implicated these pumps on the onset and maintenance of electric currents during tail regeneration in Xenopus laevis larvae, which were proven to be necessary and sufficient to induce this process1. This work aimed to analyze the particular role of V-ATPases in the caudal fin regeneration of adult zebrafish. Gene and protein expression patterns showed that this proton pump is…

Advisors/Committee Members: Afonso, Ana Catarina Caetano Certal, Thorsteinsdóttir, Sólveig.

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Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013

Left-Right (LR) asymmetry is a conserved feature across the Bilateria and is characterized by differential morphogenesis and positioning of internal organs across the LR axis. This pattern is established during early embryogenesis and involves a number of highly regulated developmental mechanisms. Based on the fact that initially all organisms appear morphologically symmetric (zygotes or early embryos), a major question emerged: how symmetry is broken internally and which is the first asymmetric event? Studies performed on different model organisms suggest that distinct symmetric-breaking mechanisms may occur during their early development. In vertebrates, regulation of LR asymmetry downstream of symmetry-breaking seems to be conserved between different taxa and many reports show that it is established through the Nodal signalling molecule. Nodal starts being expressed symmetrically and then becomes asymmetrically expressed on the left side of lateral plate mesoderm at the early somite stage in chordates. However this is not true for Echinodermata, Nodal is always expressed asymmetrically and is found only on the right side. In the protostome models C. elegans and D. melanogaster Nodal has not been found, and hence it was thought that probably it evolved within the early deuterostome lineage. However, recently an orthologue of Nodal was found in snails (Mollusca) and it was shown that it also plays a role in left-right asymmetry, demonstrating it is of much earlier evolutionary origin. Pitx is a mediator of Nodal and it is involved in many processes related with the asymmetric growth. FoxH1 is a transcription factor that despite not being a canonical member of Nodal signalling pathway has been shown to modulate Nodal expression in vertebrates. The main goal of my project is to characterise FoxH1, Nodal and Pitx expression pattern across three different animals, Patella, Amphioxus and Lamprey during early embryo development and address if FoxH1 plays a role on Nodal signalling in protostomes.

A assimetria esquerda-direita (ED) é uma característica que se mantém conservada e bem patenteada em animais do grupo dos Bilateria. Esta consiste na morfogénese e posicionamento diferencial de órgãos internos ao longo do eixo ED. Por exemplo, por norma em humanos esta padronização assimétrica manifesta-se pela presença do coração e do estômago do lado esquerdo e o fígado do lado direito. Trata-se de um traço que é estabelecido numa fase muito precoce do desenvolvimento embrionário e que envolve inúmeros mecanismos moleculares altamente regulados. Tendo em consideração que inicialmente todos os organismos são bilaterais e morfologicamente simétricos, impõe-se uma questão essencial: como é que a simetria é quebrada internamente e qual o primeiro evento assimétrico a ter lugar? Estudos realizados em diferentes modelos animais sugerem mecanismos de quebra de simetria distintos, sendo actualmente…

Advisors/Committee Members: Shimeld, Sebastian, Thorsteinsdóttir, Sólveig, 1962-.

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Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013

Os cílios são organelos semelhantes a antenas que se projetam para fora da célula em todas as células de vertebrados. Existem dois tipos de cílios que são classificados de acordo com a sua função: cílios móveis, que estão envolvidos no movimento de fluidos e cílios primários (mais pequenos e imóveis) que têm funções sensoriais e sinalizadoras. Dependendo da sua função e localização nos epitélios ou órgãos a estrutura ciliar é também diferente. Alterações ao nível da motilidade ciliar causam doenças específicas do cílio que afetam principalmente o aparelho respiratório, a fertilização e o estabelecimento da assimetria esquerda-direita do corpo. O nó embrionário, também conhecido como organizador da esquerda-direita do embrião vertebrado, é uma estrutura ciliada onde os cílios móveis originam um importante fluxo de fluido, chamado de Fluxo Nodal (necessário para a formação do eixo esquerdo-direito). Por vezes há falhas na correta formação do padrão esquerdo-direito durante o desenvolvimento que levam ao aparecimento de defeitos como situs inversus. O mecanismo pelo qual este processo ocorre é ainda desconhecido mas existe informação na área que suporta duas vias: mecano-senora e quimio-sensora. Assim, existem dois modelos que tentam explicar como é que ocorre a ativação da expressão de genes assimétrica e como é que esta informação é transferida para a placa lateral da mesoderme. O “Modelo dos Morfogénios” defende que determinados morfogénios são transportados do lado direito para o lado esquerdo do nó, em resposta ao fluxo nodal e ficam concentrados do lado esquerdo onde iniciam uma sinalização intracelular. O outro modelo, conhecido como “Modelo dos Dois tipos de Cílios”, sugere que existem dois tipos de cílios diferentes a desempenharem funções distintas no nó. Este modelo foi baseado na descoberta de que no nó embrionário do rato existem cílios móveis, na zona central, identificados pela presença de dineínas (proteínas motoras que conferem o movimento ciliar), mas também existem cílios imóveis a cercar os cílios móveis. Estes cílios imóveis foram localizados por imunofluorescência na zona mais periférica do nó, também conhecida por região perinodal. Ambos os modelos descrevem que a libertação de Ca2+ intracelular do lado esquerdo do nó é um fator essencial para a ativação da expressão assimétrica de genes envolvidos no estabelecimento do padrão esquerdo-direito. A partir de dados novos, ainda não publicados, obtidos após a análise de resultados de uma experiencia de expressão genética usando microarrays, feita no nosso laboratório, foram escolhidos dois genes de acordo com a sua expressão na vesicula de Kupffer (orgão análogo ao nó do rato, importante também no estabelecimento da assimetria esquerda direita no peixe zebra e medaka). Usaram-se embriões selvagens (wt) e mutantes deltaD-/- para podermos comparar as diferenças de expressão nestas duas condições em embriões de peixe zebra.…

Advisors/Committee Members: Lopes, Susana Santos, Feijó, José A., 1962-.

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Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013

Seed formation in Arabidopsis thaliana requires a coordinated development between embryo, endosperm and seed coat. While the first two structures are originated by a simultaneous fertilization event of egg and central cell, the seed coat is solely of sporophytic origin. Still, initiation of its development is triggered by the presence of the sexual endosperm. In fact, the type I MADS-box transcription factor, AGL62 is necessary to form an endosperm-derived signal that upon fertilization, triggers seed coat development. The nature of such signal is however still unknown. Symplastic connections between endosperm and seed coat are not known to exist, therefore phytohormones, due to their ability to actively cross cell membranes, are good candidates to be involved in this signaling process. Molecular evidence, such as gene expression studies, suggests that auxin is involved in seed coat development. In this study the role of this phytohormone in seed development, and more particularly in seed coat initiation were investigated. Reporter gene analysis revealed that auxin is present in all tissues of the ovule and seed throughout their development, and suggest that a fertilization-dependent increase in biosynthetic activity may be the initial drive for seed development. Additionally, it was found that auxin has the ability to induce autonomous seed formation, bypassing the developmental repression exerted by PcG proteins, in the absence of fertilization. Also, auxin partially rescued the phenotype of the agl62 mutant, which fails to develop a seed coat. Moreover, the results obtained here show that auxin is essential for correct cell specification and positioning in the embryo sac. Altogether, these results indicate that auxin has a predominant role in ovule and seed development and that this hormone seems to be involved in the pathway that leads to seed coat formation, most likely not as an exclusive participant.

Durante o desenvolvimento das plantas observa-se a alternância entre uma fase esporofítica diplóide e uma fase gametofítica haplóide. Em angiospérmicas, ambos os gametófitos unissexuais são constituídos por um pequeno conjunto de células que se encontram envolvidos pela flor. O gametófito feminino forma-se em duas fases distintas: megaesporogénese e megagametogénese e após o desenvolvimento estar completo, o óvulo possui um conjunto de células gametofíticas envolvidas pelo tecido maternal esporofítico – o integumento. A composição final do gametófito feminino inclui uma oosfera, uma célula central formada a partir da fusão dos dois núcleos polares, duas sinérgides e duas antípodas. Na ausência de fertilização, proteínas PcG reprimem o desenvolvimento da semente. Estas proteínas estão organizadas em complexos que inibem a transcrição de vários loci através da sua metilação na lisina 27 da histona 3 (H3K27) e cada complexo actua em tecidos específicos durante o desenvolvimento. Assim, no óvulo, o…

Advisors/Committee Members: Köhler, Cláudia, Silva, Jorge Miguel Luz Marques da, 1965-.

▼ A partenogênese tem sido descrita como um método alternativo para produzir embriões para estudos com células embrionárias, principalmente em humanos para os quais existe a restrição do uso de embriões fecundados. Procedimentos utilizados na partenogênese são também necessários para se produzir embriões por transferência nuclear com células somáticas nas espécies domésticas. Contudo, muitos aspectos biológicos, celulares e moleculares dos embriões partenogenéticos ainda são desconhecidos. Este estudo objetivou comparar a cinética do desenvolvimento, índice de apoptose e expressão de genes de estresse e metabolismo celular em embriões bovinos partenogenéticos e embriões fecundados in vitro. Oócitos (n=1541) obtidos de ovários de matadouro foram maturados in vitro e submetidos à ativação partenogenética (4,62 M ionomicina por 5 min seguido de 2 mM 6-DMAP por 4h) ou fecundação in vitro (2 x 106 espermatozoides/ml por 20h, com sêmen de uma única partida). Com 72h pós-ativação/fecundação (hpaf) parte dos embriões (8 células) foram congelados para posterior análise da expressão gênica e outra parte foi separada em grupos de alto ou baixo potencial de desenvolvimento: Part≥8 - embriões partenogenéticos com 8 ou mais células (alto potencial de desenvolvimento); Part<8 - embriões com menos de 8 células (baixo potencial de desenvolvimento); FIV≥8 - embriões fecundados in vitro com 8 ou mais células; e FIV<8: embriões com menos de 8 células. Os embriões foram cultivados em meio CR2aa com 2,5% SFB em 5%CO2, 5%O2, 90% N2 a 38,5C e avaliadas as taxas de blastocistos com 168hpaf (D7) e 196hpaf (D8). Embriões com 8 células obtidos após 72hpfa foram analisados quanto à expressão gênica. Blastocistos em D8 foram fixados e posteriormente foram avaliados pela técnica de TUNEL o índice apoptótico. Os dados foram comparados por análise de variância e as médias por teste de Student Newman Keuls. A expressão gênica foi avaliada pelo software REST. Os valores são mostrados como médiaerro padrão. Embriões com 8 ou mais células produziram maiores (P<0,01) taxas de blastocistos no D7 e D8 do que os embriões com menos de oitos células mostrando seu maior potencial de desenvolvimento, independentemente se foram partenogenéticos ou fecundados. Embriões do grupo Part≥8 apresentaram maior (P<0,05) taxa de blastocistos no D7 (63,63,4%) que os FIV≥8 (45,38,9%), porém a taxa no D8 foi semelhante (56,73,0% e 44,28,9% para Part≥8 e FIV≥8, respectivamente; (P<0,05). Não houve diferença (P<0,05) quanto às taxas de blastocistos no D7 e D8 entre embriões com menos de 8 células oriundos da partenogênese ou fecundação. Não houve diferença quanto ao número total de células (92,03,4; 102,304,8), células apoptóticas (10,81,22; 9,51,07) e índice apoptótico (11,41,27; 9,81,8) nos blastocistos partenogenéticos e FIV, respectivamente. Nos embriões com 8 células analisados, houve subexpressão dos genes DNAJB1, HSPA1L, HSF1, GLUT1 nos Part em relação aos FIV, enquanto o HSF2 esteve sobrexpresso nos Part quando comparado aos FIV.… Advisors/Committee Members: Carlos Antônio de Carvalho Fernandes, Eduardo Kenji Nunes Arashiro, Luiz Sérgio de Almeida Camargo.

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Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010

A Evolução e o Desenvolvimento (Evo-Devo) é uma area da biologia que tem por objectivo o estudo e a interpretação de conhecimentos de ambas as areas de evolução e da biologia do desenvolvimento. Tenta assim, explicar e testar as teorias evolutivas ao nivel morfologico. (David 2001) A transição de invertebados para vertebrados é um marco importante na historia evolutiva das especies. A relação filogenética no Filo Chordata é importante para compreender esta transição. O Filo é constituido de tres subfilos Vertebrata, Cephalocordata e Urochordata. As caracteristicas que os une neste Filo é a presença de uma notocorda, um tubo nervoso dorsal, tubo nervoso dorsal, fendas branquiais, um endostélio e uma cauda pós-anal, em pelo menos uma fase de sua vida. Contudo, a relação filogenética dentro do Filo Chordata foi controversa. No século XIX os urocordados foram colocados na base da filogenia do Filo, estando deste modo, os cefalocordados mais proximos dos vertebrados (Fig.1). No entanto, dados moleculares recentes levaram a reversao destas posições estipulando que os cefalocordados se separam antes, localizando-se basalmente ao grupo Urochordata-Vertebrata (Fig.1) (Delsuc 2006). O Filo Cephalochordata compreende dois generos (Branchiostoma and Epigonichtys). O anfioxo (Branchiostoma floridae - especie americana - Branchiostoma lanceolatum -especie europeia) possede uma faringe com fendas branquiais, uma cauda pos anal, um sistema circulatorio ausente de coração e um sistema excretor rudimentar (Fig.2). Contudo carecem de algumas caracteristicas de vertebrado como as células migratorias da crista neural, um endoesqueleto, um cérebro regionalizado e orgãos sensorias pares. Por apresentar um genoma não duplicado, uma copia unica para a maioria das familias multigenicas dos vertebrados, pelas suas caracteristicas morfologicas e do desenvolvimento transitorias aos vertebrados, pela disponibilidade de ferramentas de manipulação génica e vantagens de manutenção em laboratorio e do genoma de Branchiostoma floridae estar completamente sequenciado, o anfioxo é considerado como sendo um bom organismo modelo para estudar a transição de invertebrado a vertebrado. Em 1987, o primeiro receptor de efrina foi clonado. Os receptors (Eph) e ligandos (efn) de efrinas formam a maior das 14 subfamilias de receptores do tipo tirosina kinase. Estas possuem um dominio extracellular N-terminal que permite a interacção com o ligando; um dominio intracelular com funçao de kinase; um dominio SAM; e um dominio PDZ (Fig.4). Os ligandos estão subdivididos em dois grupos, as efnA que se encontram ancoradas à membrana via GPI (glycosylphosphatidylinositol) e as efn B que estão ancoradas por um dominio transmembranar (Fig.4). Os receptores EphA interagem preferencialemente com as efnA e as EphB com as efnB. Esta interacção ligando-receptor tem um papel crucial em processos celulares como a adesão, comunicação, rearranjos de…

Advisors/Committee Members: Garcia Fernàndez, Jordi, Sucena, Élio.

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Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento).Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011

All muscle cells of the trunk and limbs are derived from the delamination of myogenic precursor cells (MPCs) from the dermomyotome of somites. Myogenic differentiation is then activated and orchestrated by myogenic regulatory factors. In the trunk, myogenesis begins with the formation of the myotome, a segmented muscle which progressively differentiates, reorganizes and translocates to form the definitive adult skeletal muscles. Nevertheless, external factors such as the extracellular matrix (ECM) are also important in myogenesis. Previous studies have proved that ECM plays important functions in primary myogenesis. It is thought that the fibronectin matrix may help muscle cell reorganization through its integrin receptors, in particular through α4, α5 and αv subunits. Here we mapped the 3D distribution of the fibronectin matrix in embryos throughout myotome development until its final reorganization. We also described thedistribution pattern of the αv integrin subunit. To assess the effect of fibronectin during the translocation of myocytes, we performed explant cultures, using the 70kDa fragment and the RGD peptide to inhibit fibronectin matrix assembly and cell-ECM interactions, respectively. Our data highlights a very dynamic behavior of fibronectin matrix in myogenesis. Fibronectin seems to be used as a guide by the MPCs entering the myotome from the central dermomyotome. αv subunit is present in all elongated myocytes and enriched at their tips, showing that myocytes are able to attach to the thick fibronectin matrix at intersegmental borders, possibly serving as a tendon structure. Disruption of fibronectin assembly induces the collapse of the elongated muscle cells and disruption of the myogenic program. Similarly, inhibiting cell-ECM interactions does not perturb muscle morphology, but affects myogenic differentiation. Together, these observations highlight the importance of fibronectin during muscle development, including skeletal muscle morphogenesis. All muscle cells of the trunk and limbs are derived from the delamination of myogenic precursor cells (MPCs) from the dermomyotome of somites. Myogenic differentiation is then activated and orchestrated by myogenic regulatory factors. In the trunk, myogenesis begins with the formation of the myotome, a segmented muscle which progressively differentiates, reorganizes and translocates to form the definitive adult skeletal muscles. Nevertheless, external factors such as the extracellular matrix (ECM) are also important in myogenesis. Previous studies have proved that ECM plays important functions in primary myogenesis. It is thought that the fibronectin matrix may help muscle cell reorganization through its integrin receptors, in particular through α4, α5 and αv subunits. Here we mapped the 3D distribution of the fibronectin matrix in embryos throughout myotome development until its final reorganization. We also described thedistribution…

Advisors/Committee Members: Thorsteinsdóttir, Sólveig, 1962-, Deries, Marianne.

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Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011

The first evidence of metamerization in the vertebrate body plan is the segmentation of the paraxial mesoderm into somites which happens early during the embryonic development. The genetics and signalling involved in the process have already been thoroughly studied, and recent works have shed some light in the morphogenetic movements that presomitic mesoderm cells undergo and during somite formation and epithelialisation. In the present work, the role of the adhesion molecule N-cadherin in sómitogenesis was studied in more detail. The expression pattern in chick embryo has previously been shown, as well as the common defects caused by the lack of N-cadherin in mouse embryo. Though apparently not fundamental for the somite formation, Ncadherin is important for the correct epithelialization. By electroporating two different truncated versions of the N-cadherin, one without the extracellular domain and another without the intracellular domain, it was visible that the somites formed had different sizes when compared with the control and other phenotypes occurred: fusions and fissions of somites. Preliminary results showed that each domain of the N-cadherin affects differently the medial, rostral and caudal epithelia in terms of number and position of cells, which suggests that both domains mediate cellular events which important for the correct epithelialization and maintenance of the epithelium. Because previous work in chick embryo suggested that the first ten formed somites were more susceptible to the impairment of N-cadherin, so the expression patterns of N-cadherin and cadherin11 were studied for these stages. The hypothesis was that both cadherins would be cooperating in the 10th somite and beyond, so cadherin11 would compensate for the lack of N-cadherin and reduce the effects visible in the first ten somites. This was not confirmed, since cadherin11 only expresses transiently in the somites first ten somites. This work sheds light into the possible role(s) of N-cadherin during early sómitogenesis.

Os sómitos são a primeira estrutura metamérica visível aquando do desenvolvimento dos vertebrados, e formam-se aos pares por segmentação da mesoderme paraxial no eixo antero-posterior, um processo ao qual se da o nome de sómitogénese. Para isto, as células mesenquimatosas da mesoderme paraxial tem de fazer uma transição mesênquima-epitélio e posicionar-se no local correcto. Esta transição exige que as células sofram várias modificações na sua morfologia, o que ocorre de uma forma dinâmica. As células na parte média da mesoderme paraxial não segmentada tornam-se progressivamente epiteliais à medida que se aproximam do momento de formarem sómitos. Algumas células mesenquimatosas ligam-se a células já epiteliais e usam-nas para elas mesmas se tornarem epiteliais, um movimento a que se dá o nome de acreção. Este movimento parece ser o principal responsável pela formação do epitélio rostral e…

Advisors/Committee Members: Martins, Gabriel G..

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Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011

Research in the area of mesenchymal stem cells (MSCs) has come to prove the extensive therapeutic value of these cells. Increasing evidence supports that MSCs play a role in tissue regeneration not by means of cellular engraftment and differentiation, but through the secretion of soluble trophic factors which enhance and assist in the repair and regeneration of damaged tissues by paracrine activation of surrounding cells. This thesis aims to evaluate the therapeutic value of conditioned media prepared from umbilical cord matrix derived MSC (ucmMSC) culture on cellular migration and wound regeneration. For this purpose an in vitro migrational scratch assay in human dermal fibroblasts and in human keratinocytes; and an in vivo wound healing assay in the mouse model were performed. A novel ovine model for the wound healing assay was also developed. Conditioned media containing 0% and 2% FBS were prepared with confluent or growing ucmMSCs cultures and growing bmMSC and applied to the models mentioned above. Media supplemented with 0% and 2% FBS that were not in contact with cells were herein used as controls. Overall, it could be observed that conditioned media enhanced cellular migration when compared to the respective controls. Moreover, it was concluded that growing MSCs secreted a richer protein profile which resulted in increased cellular migration and consequent wound healing, further validating the therapeutic value of MSCs in cutaneous wound healing via secretion of soluble trophic factors. Since the use of ucmMSCs represents an inexhaustible source of easily isolated MSCs from a non-controversial origin, future mass production of MSC trophic factors could be achieved in an off-the-shelf manner. The prospective of a commercially available concentrate of MSC secreted factors which accelerates the healing of cutaneous injuries upon topical application would be a momentous achievement, reducing the invalidity and morbidity associated with cutaneous wounding and excessive scarring.

Durante todo o desenvolvimento embrionário, desde do oócito fertalizado até ao feto desenvolvido, as células atravessam vários estádios de potência. Desde a célula totipotente que existe até à 3ª divisão celular [1], à celula pluripotente existente no botão embrionário do blastocisto e que após isolamento é conhecido como célula estaminal embrionária [1-2], até às células progenitoras dos diversos orgãos que permanecem durante toda a vida do organismo [1]. A célula estaminal mesenquimatosa, em particular, é um subtipo de célula estaminal multipotente, capaz de se diferenciar em vários tecidos da linhagem da mesoderme. Estas células existem em vários tecidos extra-embrionários, fetais e adultos, tais como: o sangue, fígado e medula óssea fetais [3]; o saco e líquido amnióticos, a placenta [4-5], o sangue do cordão umbilical [6] e a matriz do cordão umbilical [7] e; em vários tecidos adultos como a medula óssea, o tecido…

Advisors/Committee Members: Rodrigues, Maria Gabriela, 1965-, Miranda, Joana.

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Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011

Embryonic stem (ES) cells are characterized by their self-renew and pluripotency properties – the stemness state. A complex gene regulatory network (GRN), with three core transcription factors, NANOG, OCT4 and SOX2 (NOS network), underlies this state, but despite extensive work on this GRN, little is still known about how these factors interact in order to maintain it. Recent work has shown that NANOG expression is heterogeneous in ES cells, while OCT4 and SOX2 seem to be expressed more homogeneously. In addition, NANOG-negative ES cells have a reduced capacity to self-renew and a tendency to differentiate, while cells that constitutively express high levels of Nanog are apparently resistant to differentiation stimuli. These facts suggest that NANOG has a crucial functional role in stemness maintenance and show the necessity of understanding how different levels of Nanog expression control an ES cell’s response to differentiation cues. Previous studies with FGF/ERK inhibitors have shown that the inhibition of this pathway enhance ES cells growth1. Thus, once activation of ERKs apparently impairs self-renewal, FGF/ERK pathway is one of the cues that has to be blocked in order to maintain ES cells in the stemness state and prevent differentiation. Since both the NOS network and the FGF/ERK pathway play a decisive role in controlling the stemness potential of ES cells, it is essential to better understand the relationship between the two pathways. To achieve this, ES cell lines that allow the monitoring, in real-time, of the stemness and differentiation potentials are essential. In this work, I have developed novel ES cell lines that allow the real-time visualization of NANOG and FGF5 expression, the first as an indicator of stemness and the second as a marker of commitment to differentiation. These cell lines have been validated regarding their stemness potential and the adequacy of the reporters and shall help to unveil the complex gene network behind stemness by the analysis of movies in which the dynamic of the genes may be followed.

Células estaminais embrionárias são um tipo particular de células estaminais com origem no botão embrionário do blastocisto e que quando mantidas in vitro, sob condições de cultura específicas, têm a capacidade de manter a sua “estaminalidade” que se resume a duas características fundamentais: a competência para diferenciação em várias linhagens (pluripotencialidade), e a capacidade de auto-renovação. Estas células, devido às suas características têm um enorme potencial terapêutico, mas para que tal aconteça é imperativo perceber de que forma emergem estas células com propriedades tão específicas. Na origem da estaminalidade encontra-se uma rede genética complexa, cujo núcleo central pode ser reduzido a três genes codificando os factores de transcrição: NANOG, OCT4 e SOX2 (NOS). No entanto, continua por desvendar de que forma a interacção concertada destes factores…

Advisors/Committee Members: Abranches, Elsa, Duarte, Júlio António Bargão, 1957-.

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Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011

The simultaneous production of several cell-types during embryonic development of the retina was previously shown to be regulated by the Notch-signaling pathway at multiple levels, through the sequential expression of two Notch ligands, Dll1 and Dll4. While Dll1 activity has been shown to be responsible for progenitor maintenance, Dll4 function has not been addressed until now, although a role in the regulation of cell-fate acquisition and celldiversity had been suggested. To address the role of Dll4 in the developing retina, we first characterized the intrinsic differentiation potential of Dll4-expressing cells during the first wave of retinal differentiation, at E13.5, by comparing its expression with that of three bHLH-encoding genes (Ngn2, Math5 and NeuroD), whose combined expression identify different retinal progenitors. Taking advantage of a Dll4 conditional knock-out (Dll4 cKO) mouse strain, we have used the expression of the same set of genes to evaluate the effects caused by Dll4 deletion on the profile of the differentiating population of cells. Our analysis of Dll4-expressing cells has revealed that these are still multipotent, although heavily biased towards the photoreceptor fate. We have also found that Dll4 absence leads to an increase in the production of photoreceptor and amacrine cells. The present work has allowed us to propose that during the first wave of differentiation Dll4-mediated Notchsignaling inhibits photoreceptor and amacrine cell production through inhibition of Ngn2 and NeuroD in the surrounding cells.

Advisors/Committee Members: Gaspar, Cláudia, Zilhão, Rita, 1959-.

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Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências

O ácido retinoico (AR) é um morfogénio derivado da vitamina A, que a par com outras vias de sinalização (e.g. factores de crescimento de fibroblasto (FGF), fatores de crescimento de transformador beta (TGF-β), Sonic hedghog (Shh) e Wnt) está envolvido diretamente no desenvolvimento embrionário sendo, por exemplo, fundamental na especificação do eixo ântero-posterior durante fases precoces da embriogénese. A transdução de sinal da via do AR é feita principalmente através de duas famílias de recetores nucleares, os recetores X de retinoides (RXR) e os recetores de ácido retinoico (RAR). Classicamente, estes recetores atuam sob a forma heterodimérica ligando-se especificamente a regiões promotoras, no ADN. Estas regiões são denominadas elementos de resposta ao ácido retinoico (RARE) e são tipicamente caracterizadas pela dupla repetição da sequência conservada (A/G)G(G/T)TCA, ou na forma mais relaxada (A/G)G(G/T)(G/T) (G/C)A, e encontram-se normalmente separadas por um, dois ou cinco nucleótidos. O heterodímero RXR/RAR encontra-se normalmente ligado ao promotor específico, mas na ausência de ligando este recruta um complexo co-repressor, o qual é responsável pela condensação da cromatina e, consequentemente, pela repressão da expressão génica. Na presença do AR, este liga-se ao complexo RXR/RAR no qual induz uma alteração conformacional o que, por sua vez, leva ao recrutamento de co-activadores permitindo a descondensação da cromatina e a ligação do complexo de pré-iniciação da transcrição à região do promotor. O AR é endogenamente sintetizado através de um processo que consiste em duas oxidações. A primeira é reversível e origina retinaldeído a partir de vitamina A, também conhecida como retinol. Esta reação é levada a cabo por enzimas da família das desidrogenases de álcoois e por membros da família das desidrogenases de retinol. A segunda oxidação é uma reação irreversível e transforma o retinaldeído em AR, sendo as desidrogenases de retinaldeído as principais enzimas envolvidas nesta reacção. Além disso, a biodisponibilidade de AR é regulada ao nível da degradação. Este processo é principalmente controlado por enzimas da família de citocromos P450 subfamília 26 (Cyp26) e transforma AR em metabolitos biologicamente menos ativos. Até um passado bastante recente, a via AR foi tida como exclusiva na linhagem dos vertebrados. Porém, estudos mais recentes demonstraram que está presente nas diferentes linhagens de cordados (vertebrados, tunicados e cefalocordados). Por outro lado, estudos recentes recorrendo a bioinformática levaram a que a origem evolutiva da via de sinalização do AR fosse alterada uma vez mais, dada a existência de genes ortólogos a componentes básicos desta via em ambulacrários e lofotrocozoários. Assim sendo, a sinalização por AR tem provavelmente a sua origem na base dos bilatérios. Assim, para um escrutínio detalhado da evolução da via de sinalização do AR e dos seus mecanismos…

Advisors/Committee Members: Schubert, Michael, Sucena, Élio.

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Tese de mestrado.Biologia (Biologia Evolutiva e do desenvolvimento), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012

A somitogénese é um processo característico do desenvolvimento embrionário dos vertebrados durante o qual segmentos repetidos, denominados somitos, são gerados de forma periódica, sob o controlo temporal imprimido por um Relógio Molecular, primeiramente descrito pela expressão cíclica do gene hairy1. O nosso laboratório identificou uma interacção proteica entre Hairy1 e Brachyury (T), um marcador de identidade mesodérmica. T regula e é regulado pela sinalização FGF e desempenha um papel fundamental na activação da expressão dos genes de identidade Hox. Este resultado levantou a hipótese de que Hairy1 e T interagem ao longo do desenvolvimento, aliando informação temporal e posicional. Para prosseguir o estudo desta hipótese, neste trabalho realizou-se a caracterização da interacção proteica entre Hairy1 e T in vivo por Bimolecular Fluorescent Complementation (BiFC), identificando a sua localização subcelular e os domínios proteicos envolvidos. Os resultados mostram que o dímero T:Hairy1 é exclusivamente nuclear, que a homodimerização de Hairy1 ocorre no núcleo e no citoplasma, e sugerem que a porção bHLHOR é suficiente para estas interacções. Os padrões de expressão de hairy1 e T apresentam domínios de co-expressão ao longo do desenvolvimento, corroborando um possivel papel funcional para a interacção entre as duas proteínas. Observou-se que a expressão de T apresenta um gradiente de mRNA na mesoderme pré-somitica (PSM), sendo que o seu dominio de transcrição activa se revelou mais restrito ao botão caudal, assim como foi descrito para fgf8. A caracterização da dinâmica temporal da expressão de T e fgf8 revelou que estes genes apresentam pulsos de transcrição, com periodicidade diferente de 90min. Verificou-se ainda que a ausência da notocorda por 90min e 4,5h, provoca uma diminuição da transcrição e da expressão de mRNA maduro em T e fgf8, sendo mais acentuada para fgf8. Globalmente, estes resultados sugerem que T e fgf8 possuem mecanismos de regulação da expressão na PSM muito semelhantes.

Somitogenesis is a characteristic process of vertebrate embryo development whereby repeated segments, called somites, are generated with a tight temporal control dictated by a Molecular Clock, primarily described by hairy1 gene expression oscillations. Our lab found that Hairy1 protein interacts with the mesoderm marker Brachyury (T). T is involved in a positive feed-back loop with FGF signaling and plays a fundamental role on Hox gene expression activation. This raised the hypothesis that Hairy1 and T may interact throughout development, linking temporal and positional information. To pursue studying this hypothesis, in this work we performed the characterization of Hairy1 and T protein interaction in vivo by Bimolecular Fluorescent Complementation (BiFC), identifying its subcelular localization and the protein domains involved. Our results show that the T:Hairy1 dimer is exclusively nuclear, that Hairy1…

Advisors/Committee Members: Andrade, Raquel P., Martins, Gabriel.