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Foram realizados quatro tratamentos: tratamento 1: desde o nascimento e até nas primeiras 48 horas de vida, o bezerro mamou na própria mãe, nas quatro tetas, sendo um pouco em cada teta ad libitum; tratamento 2: desde o nascimento e até nas primeiras 48 horas de vida, o bezerro mamou apenas na teta anterior direita ad libitum; tratamento 3: desde o nascimento e até nas primeiras 48 horas de vida, todas as tetas foram ordenhadas e o colostro foi fornecido ao bezerro em mamadeira; tratamento 4: desde o nascimento e até nas primeiras 48 horas de vida, todas as tetas foram ordenhadas e um sucedâneo foi fornecido ao bezerro em mamadeira. Foi mensurada a concentração de imunoglobulina G (IgG) de amostras de sangue de 21 bezerros, colhidas às 48 horas de vida. Os testes utilizados para mensurar a concentração de IgG foram: imunodifusão radial, refratometria e coagulação por glutaraldeído. A densidade do colostro fornecido aos animais foi mensurada com lactodensímetro. Nos animais submetidos ao tratamento 3, foi detectada maior transferência IgG que naqueles submetidos aos tratamentos 1 e 2 que, por sua vez, apresentaram maior aquisição de imunidade passiva que os animais do tratamento 4. Não houve diferença significativa entre as respostas mensuradas nos tratamentos 1 e 2. Foi detectada alta correlação entre os resultados obtidos no teste de refratometria (r = 0,90) e os obtidos no teste de imunodifusão radial e houve coagulação em solução de glutaraldeído de todos os soros com concentração de IgG maior que 983,68 mg/dL.

Four treatments were performed: treatment 1: from birth until the first 48 hours after birth, the calf sucked ad libitum on her mother, the four teats, being a little in each teat ; treatment 2: from birth until the first 48 hours after birth, the calf suckled ad libitum on the right front teat; treatment 3: from birth until the first 48 hours of life, all teats were milked and the calf was provided colostrum by bottle; treatment 4: from birth until the first 48 hours of life, all teats were milked and milk replacer was fed to calves by bottle. We measured the concentration of Immunoglobulin G (IgG) in the blood of 21 calves harvested at 48 hours of life. The density of colostrum fed to the animals was measured with a hydrometer . In animals subjected to treatment 3, was detected higher transfer of IgG than those of treatments 1 and 2 which in turn showed acquisition of immunity to the animals of treatment 4. There was no significant difference between the responses measured in treatments 1 and 2. We have detected a high correlation between the results obtained in the test of refraction and the obtained in radial immunodiffusion test (r = 0,90) and there was coagulation solution of glutaraldehyde in all sera IgG concentration higher than 983,68 mg/dL.

Advisors/Committee Members: Joely Ferreira Figueiredo Bittar, Antônio Vicente Mundim, Edmundo Benedetti.

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Anaplasmosis is an important disease of cattle of tropical and subtropical areas of the world, caused by the intra-erythrocytic rickettsia Anaplasma marginale. Vaccination has been the most economical and efficient method to control anaplasmosis. Nevertheless, the traditional methods of immunization, which use A. marginale from infected blood, show limitations. Thus, studies concerning the development of new immunogens are important. In the last years, such studies have focused on the membrane proteins of the rickettsia, specially MSP1a and MSP2, which were the most promising in protection assays as native proteins, used individually. The main objective of this study was to evaluate the protection afforded by recombinant MSP1a and MSP2 of A. marginale, associated with CpG ODN 2006, against heterologous challenge, and evaluate the immune response elicited. For this purpose, various experiments were conducted, involving cloning and expression of the genes that encode both proteins; the standardization of the diagnostic tests; immunization and challenge of cattle and evaluation of the humoral and cellular responses. The indirect ELISAs, based on recombinant MSP1a and MSP2, showed sensitivities of 99.0% and specificities of 100% (for both tests). The PCR for msp5 was able to detect infections even in the prepatent period, before the serological conversion. Cattle (Aberdeen Angus breed) were immunized three times with 200 g of recombinant MSP2 and/or MSP1a (from Pernambuco - Zona da Mata isolate), associated with CpG ODN 2006 and alum. Then, cattle were challenged with 3 x 107 infected erythrocytes with the heterologous isolate of A. marginale from Mossoró -Rio Grande do Norte. The animals showed typical signs of anaplasmosis (reduction of packed cell volume, fever and detectable rickettsemias). No differences were detected between immunized and control groups with regards to the percentual of reduction of packed cell volume, maximum rickettsemias, or maximum rectal temperatures, indicating that the immunizations were not protective. Despite the significant production of total IgG to MSP1a and MSP2 at the challenge, cattle produced significant levels of IgG2 only against MSP1a. It was not possible to detect proliferative responses of periferical blood mononuclear cells, neither at the challenge nor after peak rickettsemias. Possibly, the lack of protection was due to a weak or absent stimulation of cellular immunity in immunized cattle.

A anaplasmose é uma importante enfermidade de bovinos de áreas tropicais e subtropicais do mundo, causada pela riquétsia intra-eritrocítica Anaplasma marginale. A vacinação tem sido a forma mais econômica e eficiente de controlar a anaplasmose bovina. No entanto, os métodos de imunização tradicionais, que utilizam organismos provenientes de eritrócitos infectados, apresentam limitações em seu uso, razão pela qual, estudos para o descobrimento de novos imunógenos são necessários. Nos últimos anos, esses estudos têm se concentrado nas proteínas de membrana da riquétsia, sobretudo MSP1a e…

Advisors/Committee Members: Roberto José Meyer Nascimento, Stenio Perdigão Fragoso, Maria Angela Ornelas de Almeida, Silvia Ines Sardi, Claudio Roberto Madruga.

▼ O Anaplasma marginale é um importante patógeno riquetsial de bovinos transmitido por carrapato que invade e se multiplica dentro de eritrócitos, causando anemia hemolítica durante a infecção aguda. A imunização com proteínas de membrana externa (OMP) purificadas induz proteção contra doença aguda. Das 21 OMPs descritas, seis MSPs (1a, 1b, 2-5) já foram bem caracterizadas. O complexo MSP1 (MSP1a e 1b) é adesinas de eritrócitos de bovinos. A MSP1a varia em tamanho pelo número de repetições in tandem de 28-29 aminoácidos. Vacina de DNA contra a anaplasmose tem sido investigada usando os genes msp1? e msp1?, e os resultados evidenciaram resposta celular e humoral em camundongos e bovinos. A imunização com DNA plasmidial que codifica genes de interesse é uma tecnologia nova e promissora no desenvolvimento de vacinas. Vacinas de DNA que visam múltiplos epitopos têm se mostrado mais eficientes aumentando a imunogenicidade e a proteção de animais vacinados quando comparadas com as de epitopo único. Os objetivos deste trabalho foram analisar a variabilidade do gene msp1a de amostras paranaenses de A. marginale, testar a capacidade dos plasmídios recombinantes expressarem MSP1a, MSP1b e MSP5 em células eucarióticas e avaliar a imunogenicidade destas vacinas administradas individualmente ou em associação, em camundongos BALB/c. A análise da região repetitiva do gene msp1a identificou a presença de seis, cinco e três repetições nas amostras PR1, PR2 e PR3, respectivamente, e seis padrões de repetições inéditas. Contudo, a região da MSP1a responsável pela imunogenicidade foi conservada. Os plasmídios pcDNA/ msp1a, pcDNA/ msp1 ? e pcDNA/ msp5, os quais codificam os genes das MSPs sob o controle do promotor do citomegalovirus e intron A, foram construídos, multiplicados em E. coli TOPO10 e purificados. A expressão das proteínas MSP1a, MSP1b e MSP5 in vitro foi realizada em células Vero usando lipofectamina 2000 e Imunofluorescência Indireta (IFA), utilizando anticorpos monoclonais. Sete grupos de camundongos foram imunizados para avaliar a produção de IgG total e determinar os isotipos IgG1 e IgG2a: G1-100 mL PBS; G2-100 mg de vetor; G3- 100 mg de corpúsculos iniciais de A. marginale + adjuvante de Freund; G4- 100 mg pcDNA-msp1a; G5-100 mg pcDNA-msp1b; G6-100 mg of pcDNA-msp5 e G7- pool de plasmídios (33 mg de cada plasmídio). Três semanas após a última imunização, os camundongos foram sacrificados para avaliar a proliferação dos esplenócitos. As células Vero transfectadas com plasmídios recombinantes reagiram com anticorpos monoclonais específicos, demonstrando a expressão dos genes msp. IgG específica para a MSP1a e MSP5 foram detectadas tanto por ELISA quanto por Western blot. Os grupos que receberam pcDNA-msp1a and pcDNA-msp5 mostraram predomínio do isotipo IgG2a, e proliferação de esplenócitos, sugerindo que estes plasmídios são bons candidatos para estimular reposta imune Th1. A associação dos três plasmídios recombinantes (pcDNA-msp1a, pcDNA-msp1b and pcDNA-msp5) empregados na imunização de camundongos induziram altos… Advisors/Committee Members: Marilda Carlos Vidotto ., Amauri A. Alfieri, João Luis Garcia.

▼ Para a avaliação de eficácia imunogênica do peptídeo sintético de RAP-1de B.bovis,15 bovinos com idades superiores a 12 meses, livres de hemoparasitores foram mantidos em isolamento para hemoparasitores e separados em três grupos de cinco animais.Os bovinos do Grupo Peptídeo receberam, por via subcutânea, nos dias D-90,D-60 e D-30,dois mg do paptideo emulsionado em Saponina.Os do grupo Saponina receberam adjuvantes saponina e os animais do grupo controle receberam soro fisiológico, sob o mesmo esquema do grupo peptídeo.Trinta dias após a ultima inoculação, os animais foram desafiados com 5 x 108 Hemácias parasitadas com B.bovina virulenta. Amostras de Sangue e Soro foram colhidos para a realização do estudo cinético de parâmetros parasitológicos e imunológicos nos estudos parasitológicos realizados por esfregaço sanguíneo de ponto a de orelha e por citometria de fluxo,com marcação com hidroetidina, observou-se que a citometria de fluxo permitiu a datação de B.bovis a partir do segundo dia após o desafio e manteve-se positiva por todo o experimento. Quanto ao esfregaço de ponta de orelha, a detecção do parasito se deu a partir do terceiro dia mas fois achado inconstante. A avaliação imunológica da resposta imune celular foi realizada no contexto ex vivo e in vitro, por exemplo pór intermédio da imunofenotipagem de leucócitos de sangue periféricos, com anticorpos monoclonais bovinos CD4,CD8 marcados com FITC e CD21 não marcado. A reposta imune humoral foi realizada por meio do teste imunoenzimático ELISA. A analise do resultados revelou que o grupo Peotideo desenvolveu respostas imune protetora precoce envolvendo linfócitos T, principalmente TCD4*,células B produtoras de anticorpos e células NTNB. O grupo controle foi capaz de montar uma respostas antígeno especifica pôs-desafio envolvendo células B, mas não apresentou habilidade de recrutar células T CD4, o que provocou a morte de três animais.O aumento de linfócitos T CD4, nesse grupo,so foi observado tardiamente. O gupo saponina apresentou percentuais mais baixos de linfócitos T e B, e de IgG durante todo o experimento ,porem , alto percentual de células não T não B(NTNB). A morte dos animais desse grupo provavelmente ocorreu devido a um resposta imune exacerbada .Aresposta linfoproliferativa in vitro na presença do mitogeno (Com-A) mostrou-se diminuída em todos os animais inoculados com amostra patogenicade B.bovis, enquanto que a resposta antígeno especifica apresentou-se elevada, somente no Grupo Peptideo. A partir dessas informações pode-se considerar que a imunização com o paptideo sintético de RAP-1de B.bovis foi capaz de reduzir a taxa de mortalidade,no grupo controle,de 60% para 20%,nos animais imunizados e desenvolver uma resposta antígeno especifica envolvendo resposta celular,humoral e inata. Advisors/Committee Members: Mucio Flavio Barbosa Ribeiro, Mucio Flavio Barbosa Ribeiro, Olindo Assis Martins Filho, Joaquim Herman Patarroyo Salcedo, Lygia Maria Friche Passos, Paulo Roberto de Oliveira.

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Fêmeas da raça holandesa, de primeira a terceira lactação (n = 103), foram submetidas à biópsia endometrial entre seis e 12 horas pós-parto, com o objetivo de comparar a expressão gênica dos receptores tipo toll (TLRs) 1/6, 2, 4 e 5, e da -defensina 5, entre vacas que tiveram ou não infecção uterina posteriormente. Os animais foram monitorados até 42 dias pós-parto, por meio de palpação transretal, ultrassonografia e vaginoscopia. As incidências de partos gemelares, partos auxiliados e retenção de placenta foram de 11,7%, 20,4% e 38,8%, respectivamente, e 64% das vacas tiveram metrite e/ou endometrite. A involução uterina, a detecção do primeiro corpo lúteo e a primeira inseminação artificial ocorreram, em média, aos 33,5 ± 11,1; 43,6 ± 21,5 e 75,9 ± 31,0 dias pós-parto, com diferenças (P<0,05) entre animais com ou sem infecção uterina. A taxa de gestação ao primeiro serviço foi de 20,7%. A produção de leite foi, em média, de 27,9 ± 7,3 litros/dia. Foram selecionadas dez pluríparas com puerpério normal (grupo 1) e dez com retenção de placenta e infecção uterina (grupo 2). Por meio de PCR em tempo real, foi verificada expressão gênica de todos os imunomediadores considerados, sem diferença entre os grupos. A involução uterina foi correlacionada (P<0,05; r>0,60) com a expressão do TLR4, contudo, não houve relação de TLRs e -defensina 5, com a ocorrência de infecções uterinas

Holstein females, from first to third lactation (n = 103), were submitted to endometrial biopsies between six and 12 hours postpartum, in order to compare the gene expression of toll-like receptors (TLRs) 1/6, 2, 4 and 5, and -defensin 5, in cows with or without uterine infection later. Animals were monitored until 42 days postpartum through rectal palpation, ultrasonography and vaginoscopy. The incidence of twin births, assisted births and retained placenta were 11.7%, 20.4% and 38.8%, respectively, and 64% of cows had metritis and/or endometritis. The uterine involution, the first detection of the corpus luteum and the first artificial insemination occurred, on average, 33.5 ± 11.1, 43.6 ± 21.5 and 75.9 ± 31.0 days postpartum, with significant differences (P<0.05) between cows with or without uterine infection. The conception rate to first service was 20.7%. Milk production was, on average, 27.9 ± 7.3 liters/day. Twenty pluriparous cows, ten with normal postpartum (group 1) and ten with retained placenta and uterine infection (group 2), were selected for gene expression studies through real-time PCR. The gene expression for all considered immune-mediated did not differ between groups. The uterine involution was correlated (P<0.05, r>0.60) to the expression of TLR4, however, no relationship was verified between uterine infections and TLRs and -defensin 5

Advisors/Committee Members: Alan Maia Borges, Alan Maia Borges, Jose Reinaldo Mendes Ruas, Andrey Pereira Lage.

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O carrapato Boophilus microplus afeta a produtividade bovina causando perdas econômicas na ordem de bilhões de dólares anualmente. Sabe-se que a saliva do carrapato exerce efeitos imunomodulatórios, uma adaptação evolutiva à resposta do hospedeiro que pode prejudicar a alimentação do carrapato. Tem sido sugerido que o resultado de muitas infecções parasitárias, com relação a resistência ou suscetibilidade, é determinada pelo padrão de resposta das células TH1 e TH2, as quais produzem citocinas específicas que podem direcionar a resposta imune para diferentes mecanismos. As informações relacionadas à resposta do hospedeiro ao B. microplus ainda é bastante limitada. Na tentativa de ampliar os conhecimentos sobre a resposta imune dos bovinos ao carrapato, este trabalho determinou os níveis de mRNA de algumas citocinas em dois grupos de bezerros da raça Nelore (Bos indicus): um grupo controle e um grupo desafiado por infestação de carrapatos. Nossos resultados demonstraram uma redução dos níveis de mRNA de IL-2 (P <0.03) nos animais desafiados, enquanto nenhum efeito foi observado para IL-4, IL-8, IL-12p35, TNF-α and MCP-1. A redução na expressão de uma importante citocina TH1 sugere uma tendência para o padrão de resposta TH2, o que está de acordo com estudos similares conduzidos em outros modelos carrapatohospedeiro.

Boophilus microplus tick affects cattle productivity causing economic losses in the order of billions of dollars annually. It is know that tick saliva exert immunomodulatory effects, an evolutionary adaptation to the immune response of the host that can counteract tick feeding. It has been suggested that the outcome of many parasitic infections with regard to resistance or susceptibility is determined by the pattern of response involving Th1 and Th2 cells, which produce specific cytokines that may direct the immune response towards different mechanisms. Limited information is available regarding to the host response to B. microplus tick infestation. In an attempt to improve our knowledge about cattle immune-response to ticks, this work determined the expression levels of cytokines mRNAs in two groups of Nelore (Bos indicus) calves: one control and other challenged by tick infestation. Our results demonstrated a down-regulation of IL-2 (P <0.03) mRNA levels in challenged animals, while no effect of tick challenge was observed for IL-4, IL-8, IL-12p35, TNF-α and MCP-1. The down regulation of an important Th1 cytokine suggests a tendency towards a Th2 response pattern, which is in agreement with similar studies conducted with other tick-host models.

Advisors/Committee Members: Luciana Correia de Almeida Regitano.

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Frações hidrofóbicas e hidrofílicas de Brucella abortus, obtidas a partir da extração de lipopolissacarídeos de formas lisas (S-LPS) e por detergente não-aniônico (Triton X-114), respectivamente, foram avaliadas em ensaios imunoenzimáticos com o objetivo de caracterizar o perfil de anticorpos produzidos por bovinos vacinados com B. abortus S19 e animais soropositivos não-vacinados. Foram empregados o teste imunoenzimático indireto (iELISA), utilizando-se Proteína A ou anti-IgG bovina marcadas com peroxidase como conjugados, bem como os testes immunoblot e immunoblot-avidez. Quatro grupos de 15 amostras de soros bovinos previamente analisados por testes tradicionais de aglutinação foram estudados: (I) bovinos soropositivos não vacinados procedentes de área endêmica para Brucella; (II) bovinos soropositivos não vacinados procedentes de área não endêmica para Brucella; (III) novilhas vacinadas com B. abortus S19 e procedentes de área endêmica; e (IV) bovinos soronegativos não vacinados procedentes de área não endêmica. O valor limiar do índice ELISA (IE) para ser considerado como um resultado positivo foi selecionado mediante a análise TG-ROC (two-graph receiver operating characteristic). Os testes iELISA foram mais capazes de identificar novilhas vacinadas como animais negativos (87%) em relação aos testes clássicos de aglutinação (13%). Níveis de anticorpos IgG anti-S-LPS de B. abortus foram maiores em bovinos não vacinados soropositivos (grupos I e II) quando Proteína A/peroxidase foi empregada, refletindo uma predominância de anticorpos da subclasse IgG2. Immunoblot-avidez utilizando a fração hidrofílica Triton X-114 de B. abortus revelou uma significativa queda de reatividade para bandas antigênicas imunodominantes (57, 43 e 35 kDa) reconhecidas por amostras de soros de novilhas vacinadas, refletindo a presença de anticorpos vacinais de baixa avidez para estes marcadores antigênicos. Pode-se concluir que o teste iELISA com S-LPS de B. abortus utilizando Proteína A/peroxidase como conjugado demonstrou ser uma importante ferramenta para diferenciar a síntese de anticorpos induzida pela resposta à vacina S19 em comparação com a síntese induzida pela infecção natural, devido à detecção preferencial da subclasse IgG2. Além disso, o perfil de reatividade de anticorpos IgG específicos para B. abortus por immunoblot-avidez demonstrou que anticorpos vacinais apresentaram baixa avidez para componentes com massa molecular aparente de 57, 43 e 35 kDa, constituindo-se em potenciais marcadores antigênicos para diferenciar bovinos vacinados dos animais com infecção natural.

Brucella abortus hydrophobic and hydrophilic fractions obtained from smooth lipopolysaccharide (S-LPS) and Triton X-114 extractions, respectively, were evaluated in immunoassays in order to characterize the antibody response of B. abortus S19 vaccinated heifers and non-vaccinated seropositive cows. Indirect enzyme immunoassays (iELISAs) using Protein A or anti-bovine IgG as peroxidase conjugates as well as immunoblot and avidity-immunoblot were used. Four…

Advisors/Committee Members: Marcelo Emílio Beletti, Jose Roberto Mineo, Andrey Pereira Lage.

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Com o intuito de entender os mecanismos imunofisiológicos da gestação em vacas esta tese teve como objetivo avaliar a quantidade de transcritos do Complexo de Histocompatibilidade Principal (MHC) de classe I clássico (BoLA-N*) e não clássico (BoLA-NC*), bem como das citocinas TNF-α (Fator de Necrose Tumoral alfa) e TGF-β1 (Fator de Crescimento Transformador beta 1) em úteros não gestantes, carúnculas, blastocistos e cotilédones bovino durante todo o período gestacional. Utilizou-se a quantificação por qPCR, a qualificação (presença ou ausência) via RT-PCR convencional e a imunofluorescência com anticorpo primário monoclonal MHC de classe I ovino. Como controle positivo foi utilizado uma amostra de tecido de linfonodo e/ou baço bovino em todos os ensaios experimentais. A quantidade de transcrito de BoLA de classe I clássico e não clássico foi pequena (fold change variando de 0 a 3) nos blastocistos e cotilédones. Nos cotilédones a transcrição de BoLA-NC* foi maior do que a transcrição de BoLA-N*. Nos blastocistos houve maior transcrição de BoLA-N* do que de BoLA-NC*. BoLA-NC2 transcreveu mais nos blastocisto do que nos cotilédones. BoLA-NC4 não transcreveu nos blastocistos. Os cotilédones transcreveram mais BoLA-NC4 do que BoLA-NC2. As carúnculas apresentaram grandes quantidades de transcritos (fold change variando de 5 a 400), que foram maiores nos períodos gestacionais de 8 a 9 para BoLA_N* e até 1 mês para BoLA-NC*. A transcrição de BoLA-NC2 foi maior do que a de BoLA-NC4 nas carúncula. O útero não gestante teve menor quantidade de transcritos de BoLA-N* e BoLA-NC* do que nas carúnculas. Não há transcrição de BoLA-NC2 no útero não gestante, mas há uma pequena quantidade de transcritos de BoLA-NC4 neste tecido. A presença de grandes quantidades de transcritos (fold change variando de 50 a 500) de BoLA-NC2 nas carúnculas, com idade gestacional maior do que um mês, parece proteger o feto da rejeição. Nas carúnculas parece existir um pico de transcrição de TGF-β1 no sexto e sétimo meses de gestação, justamente quando o feto tem seu maior crescimento, sinalizando um provável envolvimento desta citocina neste fenômeno. O TNF-α surge em maior quantidade no final da gestação, tanto nas carúnculas quanto nos cotilédones, demonstrando o início de uma reação inflamatória, necessária para a adequada expulsão do concepto e da placenta durante o parto.

The purpose of this study is to evaluate the amount of transcripts from the Major Histocompatibility Complex (MHC) class I classical (BoLA-N *) and non-classical (BoLA-NC*), as well as of TNF-α (Tumor Necrosis Factor alpha) and TGF-β1 (Transforming Growth Factor beta 1) cytokines in bovine non-pregnant uterus, caruncles, cotyledons and blastocysts throughout the pregnancy period, in order to understand the immune and physiological mechanisms that occur in pregnancy in cows. The samples were analyzed by qPCR, the qualification (presence or absence) by conventional RT-PCR and the immune fluorescence with sheep monoclonal antibody against MHC class I.…

Advisors/Committee Members: Carlos Ueira Vieira, Marcelo Emílio Beletti.

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O Anaplasma marginale (ordem Rickettsiales, família Anaplasmataceae) é o agente etiológico da anaplasmose bovina. Esta doença ocorre mundialmente, com maior freqüência nas regiões tropicais e subtropicais, determinando perdas econômicas consideráveis à pecuária bovina. O A. marginale possui seis proteínas principais de superfície designadas de MSP1a, MSP1b, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5. A proteína MSP1a tem massa molecular de 105kDa e a MSP1b de 100kDa. Os objetivos deste trabalho foram clonar, produzir, caracterizar as MSP1a e MSP1b recombinantes (rMSP1a e rMSP1b) e avaliar a resposta imune humoral de camundongos imunizados com a Escherichia coli BL21 recombinante expressando estas proteínas. Os genes msp1a e msp1b foram obtidos pela PCR de um isolado Paranaense de A. marginale e clonados em vetores pET102 e pET101/D-TOPO, respectivamente. Após a certificação da inserção dos genes nos vetores, as proteínas foram induzidas com IPTG e purificadas em colunas de resina ligadas ao níquel. As proteínas rMSP1a e rMSP1b separadas em SDS-PAGE, reagiram com soros anti-rMSP1a e anti-rMSP1b produzidos em coelhos, pelo Western blotting, mostrando massas moleculares de 70kDa a 105kDa e 100kDa, respectivamente. A BL21/rMSP1a e a BL21/rMSP1b aglutinaram as hemácias de bovinos e esta hemaglutinação foi inibida na presença de IgY anti-rMSP1a e anti-rMSP1b, confirmando a função de adesão destas proteínas. A reação de IFI realizada com as IgY anti-rMSP1a e IgY anti-rMSP1b, produzidas em galinhas, demonstraram a presença destas proteínas na membrana externa das E. coli BL21 recombinantes. As BL21/rMSP1a e BL21/rMSP1b também foram utilizadas para imunizar camundongos Balb/c para avaliação de produção de IgG total e IgG2a, por meio de técnica de ELISA. Os animais imunizados com BL21/rMSP1a tiveram uma forte resposta humoral (IgG total e IgG2a), enquanto que os camundongos imunizados com a BL21/rMSP1b apresentaram uma fraca resposta após as três primeiras imunizações. Pelo Western blotting foi detectado, resposta de IgG total contra as proteínas rMSP1a e rMSP1b. Soros de camundongos imunizados com BL21/rMSP1a reagiram com a BL21 e rMSP1a com massas moleculares variando de 70 a 105 kDa e uma banda de 20 kDa sugerindo a quebra da proteína. Soros de animais imunizados com a BL21/rMSP1b reagiram com a BL21 e rMSP1b com massa molecular de 100 kDa. Os resultados deste trabalho confirmam o papel das MSP1a e MSP1b como adesinas no processo de invasão de eritrócitos e evidenciam a importância destas proteínas na elaboração de uma vacina de subunidades para o controle da anaplasmose bovina. Também demonstram que as BL21 expressando as rMSP1a e a rMSP1b na membrana externa são capazes de produzir resposta imune em camundongos.

The Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) is a pathogen that cause bovine anaplasmosis. This disease occurs in world wide, and it is more frequently in tropical and subtropical areas, causing important economic losses in cattle herds. Six Major Surface Protein (MSP1a, MSP1b, MSP2, MSP3, MSP4 and MSP5) have been…

Advisors/Committee Members: Odilon Vidotto ., João Luis Garcia, Amauri Alcindo Alfieri.

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O objetivo deste estudo foi caracterizar uma nova preparação antigênica de Brucella abortus obtida pela extração com o detergente Triton X-114 (TX-114) por análise imunoproteômica e immunoblot-avidez, utilizando os conjugados de detecção anti-IgG bovina e Proteína A, marcados com peroxidase. Amostras de soros de três grupos de bovinos foram analisadas: (GI) 30 vacas soropositivas não-vacinadas; (GII) 30 novilhas soropositivas e vacinadas com B. abortus S-19; (GIII) 30 vacas soronegativas não-vacinadas. Os perfis eletroforéticos unidimensionais (1-D) e bidimensionais (2-D) do antígeno TX-114 revelaram amplo espectro de polipeptídeos (10 a 79 kDa), e immunoblot 1-D mostrou um extenso perfil de reatividade por soros de GI comparado a um perfil mais restrito por soros de GII, independente dos conjugados de detecção utilizados. Anticorpos IgG de alta avidez foram detectados em soros de GI por ambos os conjugados analisados, mas Proteína A/peroxidase mostrou maior capacidade de detectar anticorpos IgG2 de baixa avidez em soros de GII. Cinco componentes antigênicos imunodominantes (24, 28, 35, 47 e 52 kDa) foram predominantemente reconhecidos por anticorpos IgG de alta avidez em GI, em adição a três componentes antigênicos não imunodominantes reconhecidos exclusivamente por soros deste grupo (10, 12 e 17 kDa), sendo considerados como potenciais marcadores de infecção e exclusão de resposta vacinal. A caracterização proteômica revelou 42 spots no gel 2-D e permitiu a identificação de 22 proteínas citoplasmáticas hipotéticas, enquanto o immunoblot 2-D demonstrou sororeatividade de polipeptídeos abaixo de 20 kDa exclusivamente com soros de GI. A análise por espectrometria de massa destes polipeptídeos permitiu a identificação de cinco proteínas antigênicas de B. abortus (Bfr, Dps/Ndpk-I, Sod e Proteína B de invasão), das quais Ndpk-I e proteína B de invasão foram identificadas em cepa vacinal de B. abortus S-19 pela primeira vez no presente estudo, e relacionadas com a antigenicidade em amostras soropositivas de bovinos não vacinados. Em conclusão, a análise imunoproteômica deste novo antígeno solúvel de B. abortus permitiu a caracterização de várias proteínas antigênicas da cepa S-19 que podem ser candidatas ao sorodiagnóstico da brucelose bovina e diferenciação entre animais vacinados e infectados. A avaliação da avidez de anticorpos IgG2 específicos a marcadores antigênicos do antígeno TX-114 pode ser também considerada como ferramenta adicional para permitir melhor distinção sorológica no perfil de afinidade funcional de anticorpos IgG em resposta à infecção e vacinação na brucelose bovina.

The aim of this study was to characterize a new soluble antigen of Brucella abortus obtained by Triton X-114 (TX-114) extraction by immunoproteomic analysis and immunoblot-avidity, using the detection conjugates anti-bovine IgG and Protein A labeled with peroxidase. Serum samples of three groups of bovine were studied: (GI) 30 nonvaccinated seropositive cows; (GII) 30 S19-vaccinated seropositive heifers; (GIII) 30 nonvaccinated…

Advisors/Committee Members: Deise Aparecida de Oliveira Silva, Jair Pereira da Cunha Junior, Maria Cristina da S. Pranchevivius, Marcelo Emílio Beletti, Jose Roberto Mineo, Renato Fontana.

▼ Coelhos foram inoculados pelas vias subcutânea e intramuscular, com imunógenos procedentes das espécies equina e bovina, num esforço para definir o melhor tratamento para a produção de anti-soros específicos, utilizáveis em provas de identificação de carnes. Os imunógenos empregados foram: Soro sanguíneo normal; Soro sanguíneo inativado por aquecimento; ­ Soro sanguíneo precipitado pelo alúmen; Extrato de carne normal; Extrato de carne fervida e autoclavada. Utilizou-se cinco doses de 2 ml de imunógeno, acrescidas de igual quantidade de adjuvante incompleto de FREUND, administradas a intervalos de sete dias sangrando-se os animais sete dias após a última inoculação. Em testes de gel-imunoprecipitação, frente ao soro homólogo, os anti-soros obtidos pela administração de extrato de carne normal por via intramuscular, determinam os valores médios mais altos à titulação, sendo estes valores de 1:13.200 para a espécie equina e de 1:9.000 para a espécie bovina. Advisors/Committee Members: Paulo Caldeira Brant, Bolivar Mendes, Nivaldo da Silva, Paulo Caldeira Brant.

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A problemática da desertificação apresenta como base fundamental para o seu conhecimento os estudos ambientais integrados com o uso de Sistemas de Informação Geográfica (SIG) e Sensoriamento Remoto. Foi escolhida como área de estudo um local limitado do sertão pernambucano (NE do Brasil), denominado Quixaba com aproximadamente 190 km². Dentre as abordagens metodológicas desenvolvidas para estudos integrados do meio ambiente, podem-se destacar as metodologias da escola da Ecologia da Paisagem. A abordagem metodológica realizada teve como fases principais: a realização de processamento digital de imagens CBERS 2 - CCD; o Modelo Digital de Elevação (MDE), a partir de dados SRTM interpolados para 30m, e o mapeamento geomorfológico da área; a classificação da dinâmica da cobertura vegetal e uso do solo entre os anos de 1983 e 2004; os mapeamentos integrados da paisagem, com a delimitação dos geossistemas e das geofácies e com a geração do índice de vulnerabilidade à perda de solo; a avaliação e validação em trabalho de campo dos resultados obtidos; e, por fim, a análise integrada dos resultados com ênfase nos dados de campo a partir da análise de agrupamentos e de uma reflexão tendo como base a problemática da desertificação. O processamento digital de imagens teve como principais resultados a modelagem linear de mistura espectral (MLME) e a análise de componentes principais (ACP). O MDE e os produtos gerados a partir de dados SRTM se mostraram fundamentais para a realização dos mapeamentos geomorfológico e integrado da paisagem, através de uma melhoria na interpretação de variáveis ambientais importantes para a compreensão holística da paisagem. O mapa geomorfológico representou as unidades geomorfológicas identificadas com base numa classificação hierárquica das formas de relevo. A cobertura vegetal e uso do solo tiveram seu mapeamento baseado na estrutura, fisionomia e dinâmica, buscando a definição das fácies de vegetação natural e as de cunho antrópico. As unidades geossistêmicas mapeadas se basearam na hierarquia paisagística da área, através da descrição dos modelados e geossistemas, com ênfase nos fatores paisagísticos de cunho físico, ecológico e antrópico. A delimitação das geofácies foi baseada nos critérios da dinâmica da cobertura vegetal e da antropização das unidades de paisagem. O índice de vulnerabilidade à perda de solo se caracterizou como um mapeamento sintético da paisagem que apresenta subsídios à interpretação dos processos erosivos. A análise de agrupamento revelou alguns padrões que remetem a relações envolvendo fatores geomorfológicos, pedológicos e também da integração de variáveis de um mosaico paisagístico específico com a distribuição fitogeográfica da área. Por fim, este trabalho mostrou a potencialidade da aplicação dos produtos e metodologias de sensoriamento remoto e SIG em estudos paisagísticos com uma abordagem complexa e integrada.

The desertification problem presents as a research fundamental basis the integrated environmental studies with the use of Geographic Information Systems…

Advisors/Committee Members: João Roberto dos Santos, José Simeão de Medeiros, Vitor Celso de Carvalho, Teresa Gallotti Florenzano, Roberto Verdum.