▼ 

A síndrome metabólica é uma condição patológica de impacto global e recursos financeiros substanciais são gastos por governos no tratamento de doenças associadas como obesidade, diabetes mellitus e cardiopatias. O crescente índice de obesos no mundo não tem uma causa única e parece ter raízes evolutivas. É clara a participação do hipotálamo no controle da ingestão alimentar e do gasto energético, sendo ele um dos principais locais de integração de fatores centrais e periféricos que controlam a homeostase energética. Nosso grupo recentemente correlacionou o sistema calicreína-cinina como controle do gasto energético, mostrando que animais nocautes para o gene codificador do receptor B1 de cininas (B1-/-) apresentam um fenótipo de resistência à obesidade induzida por dieta. Estes animais apresentam, por exemplo, níveis séricos basais reduzidos de leptina, porém são mais sensíveis a este hormônio em comparação a animais controles selvagens. Além disso, esses animais possuem também um aumento na atividade física quando submetidos a uma dieta rica em lipídeos. A descoberta de que a leptina tem uma ação trófica sobre estruturas hipotalâmicas estimulou-nos a investigar se anormalidades estruturais no hipotálamo têm papel importante na causação do fenótipo observado. As técnicas de imuno-histoquímica e hibridização in situ com sondas para peptídeos classicamente implicados no controle do balanço energético - Neuropeptídeo Y (NPY), transcrito relacionado à cocaína e anfetamina (CART), -melanocyte stimulating hormone (-MSH) e sonda para o receptor de leptina (Ob-Rb) - foram usadas. A região do núcleo paraventricular hipotalâmico e a região perifornicial da área hipotalâmica lateral (em que a ação do CART está corelacionada com o aumento do gasto energético e aumento da atividade locomotora, respectivamente) de animais B1-/- apresentam um aumento significativo na expressão de CART em comparação a animais WT corroborando nossas observações experimentais prévias sobre estes animais.

The metabolic syndrome is a global aiction and substantial financial resources are spent by governments in the treatment of related diseases such as obesity, diabetes mellitus and cardiopathies. The growing index of obese people in the world has not a single cause and seems to have evolutionary roots. There is a clear role of the hypothalamus in the control of food intake and energetic expenditure. It is one of the major integration sites of peripheral and central factors regulating energy homeostasis. Our group has recently correlated the kallikrein-kinin system with the control of energy expenditure showing that mice that had the kinin B1 receptor gene knockedout( B1-/-) display a phenotype of resistance to diet-induced obesity. These mice have reduced leptin serum levels and are more sensitive to this hormone as opposed to wild-type mice. In addition, they diplay an increased motor activity when submited to a high-lipid containing diet. The discovery that leptin has a trophic action on hypothalamic structures has prompted…

Advisors/Committee Members: Ivarne Luis dos Santos Tersariol, Maria da Graça Naffah Mazzacoratti, Jackson Cioni Bittencourt, João Bosco Pesquero.

▼ 

A produção mundial de feijão, compreendendo os gêneros Phaseolus e Vigna, é superior a 18 milhões de toneladas e o Brasil ocupa o segundo lugar na produção mundial e o primeiro quando se trata apenas do gênero Phaseolus. Entretanto, sua produção ainda está aquém do necessário para suprir a demanda interna. Dentre os principais problemas relacionados com a baixa produção de feijão no Brasil estão a competição com plantas daninhas, estresse hídrico e o ataque de pragas e doenças como mosaico dourado do feijoeiro causado por um geminivírus. O Bean golden mosaic virus (BGMV), é transmitido por mosca-branca (Bemicia tabaci) de uma forma persistente, circulativa, causando mosaico dourado em feijão comum (Phaseolus vulgaris). Os sintomas característicos são: mosaico verde amarelado nas folhas, nanismo e vagens distorcidas. A doença é largamente disseminada nas regiões de produção de feijão no Brasil e América Latina causando perdas severas (40 -100%). Neste trabalho, a tecnologia de RNA interferente foi explorada usando uma seqüência do gene viral AC1 para gerar plantas transgênicas de feijão comum altamente resistentes a geminivírus. Desta maneira o gene viral (AC1) foi escolhido para a construção do vetor de transformação uma vez que a proteína Rep exerce uma função essencial no ciclo de infecção viral. Rep não é uma replicase porém é a única proteína requerida para a replicação do genoma viral. O vetor pBGMVRNAiAHAS foi construído a partir de um fragmento de DNA de 411 pb do gene AC1 do BGMV (1836-2247, acesso no GeneBank No. M88686). Dezoito linhagens de feijão foram obtidas com a construção de interferência, as quais poderão induzir o silenciamento pós-transcricional do gene AC1. Uma linhagem (denominada 5.1) apresentou alta resistência (aproximadamente 93% das plantas não apresentaram sintomas) após alta pressão de inoculação (mais de 300 moscas-brancas virulíferas por planta). Os siRNAs específicos foram detectados nas plantas transgênicas, ambas inoculadas e não inoculadas. Uma análise de PCR semiquantitativo revelou a presença do DNA viral nas plantas transgênicas expostas a moscas-brancas virulíferas por um período de 6 dias. Entretanto, após a retirada dos insetos, não foi detectado DNA viral após um período adicional de seis dias. Devido à importância social e econômica do feijão na América Latina e à falta de genes para resistência a doenças nos bancos de germoplasma, faz-se necessário o desenvolvimento de um programa de melhoramento associado à engenharia genética para o lançamento de novas variedades, que possibilitará a diminuição dos principais problemas relacionados a esta cultura.

The production of beans, including the genus Phaseolus and Vigna, is superior to 18 million tons. Brazil is the secondlargest producer of both species genus and the major world producer of Phaseolus. However, its production is still below the necessary to supply the internal demand. Competition with weeds, abiotic stress and the occurrence of diseases as bean golden mosaic are some of the main problems related to its low…

Advisors/Committee Members: Francisco José Lima Aragão, Tatsuya Nagata, Renato de Oliveira Resende, Alice Kazuko Inoue Nagata, Simone da Graça Ribeiro.

▼ O tecido adiposo representa um sítio primário de regulação da ingestão de alimentos, gasto energético e homeostase glicêmica do organismo. Assim, alterações no metabolismo dos adipócitos, pre-adipócitos e macrófagos, células que compõem esse tecido, podem resultar em modificações no grau de adiposidade e de tolerância à glicose. O receptor B1 de cininas tem sido descrito principalmente em processos inflamatórios. Foi visto ainda que este é expresso constitutivamente no tecido adiposo branco, onde parece induzir diferenciação de adipócitos e expressão de alguns genes envolvidos com o metabolismo lipídico e glicêmico. Demonstramos a presença e a funcionalidade do receptor B1 de cininas do tecido adiposo do animal transgênico através da metodologia de ensaio de competição com agonistas marcados radioativamente e através do ensaio de microfisiômetro. Posteriormente aos tratamentos, analisamos os parâmetros basais do animal transgênico com expressão específica do receptor B1 no tecido adiposo (aP2-B1/B1 -/-). Esse animal possui maior massa de tecido adiposo peri-epididimal quando comparado ao nocaute do receptor B1 (B1 -/-) e semelhante ao animal selvagem (B1 +/+), de massa do fígado e renal reduzida assim como o animal B1 -/-. Ao analisarmos o volume celular desse tecido, percebemos que o animal aP2-B1/B1 -/- possui células ainda menores que os animais B1 -/- que já são menores que as dos animais B1 +/+. Quando avaliamos a expressão gênica desse tecido observamos uma redução da expressão dos genes do CEBP-α, PPAR-γ. Além disso, quando comparamos os três grupos observamos que o grupo B1 -/- possui maior expressão de adiponectina que os demais. Dessa forma, já pudemos observar um fenótipo de diferenciado no animal aP2-B1/B1 -/-. Em seguida, esses animais foram submetidos à dieta hiperlipídica (DHL) para avaliarmos como o receptor B1 de cininas, presente no tecido adiposo, influencia o caráter de proteção à obesidade, visto no animal nocaute do receptor B1 de cininas. Foi observado que os animais aP2-B1/B1 -/-, assim como os B1 -/- são resistentes à obesidade induzida pela DHL. Entretanto, os animais aP2-B1/B1 - Resumo 18 /- são intolerantes à glicose diferentemente dos animais B1 -/- que são mais tolerantes. A expressão de GLUT-4 nos animais B1 -/- é maior quando comparada aos demais, o que explica a maior tolerância à glicose. Os animais B1 +/+ (selvagem) têm maior concentração que plasmática de triglicérides que os demais. Observamos que camundongos aP2-B1/B1 -/- , assim como os B1-/- apresentam uma baixa expressão do mRNA da leptina no tecido adiposo branco e níveis menores de leptina plasmática, sendo ambas aumentadas pela dieta hiperlipídica (DHL). Verificamos que os animais aP2-B1/B1 -/- apresenta adipócitos menores, mesmo após a DHL. Além disso, esses têm maior expressão de Pref-1, que explica a inibição da diferenciação celular, assim como menor expressão de CEBP-α e PPAR-γ quando comparado ao animal B1 -/- que têm maior expressão desses genes. Esses resultados indicam que o animal aP2- B1/B1… Advisors/Committee Members: Fabio Bessa Lima, Aparecida Emiko Hirata, Maria Teresa Riggio de Lima-Landman, João Bosco Pesquero.

▼ 

Vinte e oito estirpes de Bacillus thuringiensis autoaglutinantes foram estudadas, mediante o emprego de métodos fenotípicos e genotípicos, com o objetivo de se avaliar a similaridade e a homogeneidade intra-específica entre essas estirpes, isoladas de diferentes nichos ecológicos e distintos locais. Na avaliação da atividade biológica qualitativa foram efetuados bioensaios preliminares contra duas espécies de mosquitos-vetores: Aedes aegypti (vetor do Dengue e Febre Amarela) e Culex quinquefasciatus (vetor da Filariose Bancroftiana). Os resultados da atividade larvicida mostram que 26 estirpes foram patogênicas aos mosquitos-vetores (mortalidade larval >50%) e duas estirpes apresentaram baixa toxicidade (mortalidade larval entre 0% e 20%). Quanto aos caracteres fenotípicos, as estirpes demonstraram, em sua maioria, os mesmos parâmetros característicos para a espécie em estudo. No perfil de resistência, as estirpes revelaram múltipla resistência a antimicrobianos, destacando-se que as 28 estirpes apresentaram 100% de resistência a seis antimicrobianos (Bacitracina, Lincomicina, Penicilina G, Polimixina G, Rifampicina, Vancomicina) e somente dois, Netilmicina e Sulfametoxazol/Trimetoprim, demonstraram 100% de inibição para as estirpes estudadas. A análise das proteínas dos cristais de protoxinas revelaram cinco grupos com perfis protéicos distintos. O principal grupo incluem-se 23 estirpes mosquitocidas, as quais apresentaram o mesmo perfil protéico do sorovar israelensis. Através da eletroforese de isoenzimas, foi observada a presença de três tipos eletroforéticos (TEs). Todas as estirpes mosquitocidas agruparam-se em um único TE. O polimorfismo do DNA, obtido com amplificação do RAPD-PCR, formou para cada um dos seis iniciadores, três diferentes perfis de RAPD para as 28 estirpes autoaglutinantes, possibilitando, desta forma, correlacionar os perfis obtidos com a toxicidade verificada nos bioensaios qualitativos. Todos os amplicons produzidos pelas estirpes autoaglutinantes mosquitocidas, para cada um dos seis iniciadores utilizados, apresentaram-se idênticos ao amplicon produzido pelo sorovar israelensis. Para as estipes atóxicas, cada iniciador reproduziu amplicons distintos, o que demonstra tratar-se provavelmente de sorovares diferentes. Por fim, mesmo não sendo identificada pela sorologia flagelar clássica, as 26 estirpes autoaglutinantes de B. thuringiensis apresentaram na análise isoenzimática e no perfil de RAPD, características compatíveis com aquelas conhecidas em B. thuringiensis sorovar israelensis.

Twenty eight autoagglutinating strains of Bacillus thuringiensis were studied by using through phenotypic and genotypic methods, aiming to evaluated the intra-specific similarity and homogeneity between them. Strains were isolated from different ecologic niches and distinct sites and could not be serologically typed. Biological activity was evaluated through bioassays against two species of mosquitoes: Aedes aegypti (vector of Dengue and Yellow Fever) and Culex quinquefasciatus (vector of Bancroftian…

Advisors/Committee Members: Leon Rabinovitch, Clara de Fátima Gomes Cavados.

▼ 

Chagas disease is caused by Trypanosoma cruzi. According to WHO, in Latin America, 16-18 million people is infected with this protozoan. Due the involvement of the proteasome in the cellular biology of the T. cruzi and the low efficiency of the drugs used in the individuals treatment with Chagas disease, we believed that the characterization of the catalytic subunits of the 20S proteasome, would help in the development of future drugs that could be used in the therapeutics of the Chagas disease. This work shows the molecular and biochemical characterization of the catalytic subunits of the 20S proteasome in a T. cruzi population with in vitro induced (17WTS and 17LER), in vivo (BZS and BZR) and strains naturally sensitive and resistant to benznidazole (CL and Colombian). Chromosomal localization by using the pulse field gel electrophoresis and hybridization profiles with specific probes showed several pattern in the different strains, suggesting that these genes are not associated with the drugs phenotype resistance in T. cruzi. Southern blot analyses showed that these genes are present in at least two copies for genome haploid of the parasite. The expression of those genes was evaluated through of Northern blot analyses and the levels of the 20S proteasome identified using Western blot and antibodies against alpha subunits. The mRNA levels did not vary among the strains, but a larger level of 20S proteasome were detected in the sensitive strains (17WTS, BZS and CL) when compared the resistant strains (17LER, BZR and Colombian). The absent of accumulation of poly-ubiquitin conjugated, suggest that the poly-ubiquitination pathway and degradation by 26S proteasome, are strongly regulated in the strains of T. cruzi studied. The measure of the peptidase activity using specific substrate for the subunit Beta-1, -2 and -5, showed that the main proteolytic activity is tripsin-like in all strains. Moreover, the strains 17WTS and 17LER also presented a high quimotripsin-like activity. These results obtained until the moment suggest that, in the epimastigote development stage of the T. cruzi the post-translation modifications are more efficient by the regulation of 20S proteasome function than the transcriptional or posttranscriptional modification.

A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. Segundo a WHO existem 16-18 milhões de pessoas infectadas com este protozoário na América Latina. Devido ao envolvimento do proteassoma na biologia celular do T. cruzi e a baixa eficiência das drogas utilizadas no tratamento de indivíduos com doença de Chagas, entendemos que a caracterização das subunidades catalíticas do proteassoma 20S, poderá ajudar no desenvolvimento de futuros quimioterápicos contra essa doença. Neste sentido, este trabalho mostra a caracterização molecular e bioquímica das subunidades catalíticas do proteassoma 20S em um padrão de cepas do T. cruzi com sensibilidade e resistência induzida in vitro ao benzonidazol (17WTS e 17LER), sensibilidade e resistência selecionada in vivo ao benzonidazol…

Advisors/Committee Members: Vanderlei Rodrigues, Marta de Lana, Renata Guerra de Sá.

▼ 

Infectious bursal disease virus (IBDV) is considered one of the most important pathogens for chickens of the poultry industry. Considering the differences in levels of virulence among isolates of IBDV, this paper proposes a non-arbitrary genotyping definition and a unified nomenclature for the viral isolates of IBDV. In this approach, the sets of 96 VP2 and 561 hvVP2 sequences available in GenBank are analyzed and clustered by four different methods (UPGMA, Neighbor-joining, Maximum Likelihood and Bayesian inference). A threshold value of 0.032 of pairwise distance was selected to group the IBDV isolates in three genotypes: IBDV-1, IBDV-2, and IBDV-3. In addition, the fourth group containing unclassified hvVP2 sequences was defined as genotype IBDV-4. The present work contributes to the establishment of a genotype definition for IBDV and provides clear criteria for IBDV classification below the genus level. The hvVP2 sequences are a reliable phylogenetic marker for IBDV genotypes since it were able to reconstruct the same tree as the whole VP2 sequences. In this work, an evolutionary epidemiology of viral isolates of IBDV was assessed. First, the selective forces that operated during the diversification of IBDV were tested. Then, Bayesian Markov chain Monte Carlo (MCMC) coalescent analyses and phylogeographical approaches were selected to predict IBDV dispersion. Six VP1 (RNA-dependent RNA polymerase) complete sequences and 26 VP2 (outer capsid protein) complete sequences were produced in this study. The results showed that negative selection is the main evolutionary force that affects nucleotide diversity and rates of evolution of IBDV. In addition, phylogeographic analysis of VP2 suggests that IBDV isolates were introduced in Brazil by at least three events of viral introduction.

O Infectious bursal disease virus (IBDV) é considerado um dos patógenos mais importantes da indústria avícola. Considerando as diferenças nos níveis de virulência entre os isolados de IBDV, este trabalho propõe uma definição de genotipagem não arbitrária e uma nomenclatura unificada para os isolados virais de IBDV. Nesta abordagem, 96 sequências completas da VP2 e 561 sequências correspondentes a região hipervariável da VP2 (hvVP2) disponíveis no GenBank foram analisadas e agrupadas por quatro diferentes métodos (UPGMA, Neighbor-joining, Máxima Verossimilhança e Inferência Bayesiana). O valor limite de 0,032 foi selecionado para agrupar os isolados de IBDV em três genótipos: IBDV-1, IBDV-2 e IBDV-3. Além disso, um quarto genótipo contendo sequências de hvVP2 não agrupadas foi definido como IBDV-4. Logo, foi possível estabelecer uma definição de genótipos para o IBDV e fornecer critérios claros para a classificação do IBDV abaixo do nível de gênero. As sequências da hvVP2 são marcadores filogenéticos confiáveis para a genotipagem do IBDV, uma vez que foram capazes de reconstruir a mesma árvore das sequências completas da VP2. Neste trabalho, a epidemiologia dos isolados brasileiros do IBDV foi também analisada em um contexto evolutivo.…

Advisors/Committee Members: Abelardo Silva Júnior, Juliana Lopes Rangel Fietto, Luiz Orlando de Oliveira, Maurício Resende, Nelson Rodrigo da Silva Martins, Márcia Rogéria de Almeida Lamêgo.

▼ 

Plant parasitic nematodes are responsible for huge economic losses in world agriculture that reaches US 125 billion yearly. The most important of these phytopatogens, Meloidogyne incognita, has six developmental stages during the life cycle (egg, four juveniles and female). The juvenile 2 enters the host root via mechanical force and enzymatic degradation to establish the host-pathogen interaction and differentiate in apomitic adult female, which deposits 2000 eggs. Current agronomic practices have usually been unsuccessful and expensive, so the cultivation of resistant varieties is actually the most efficient way to control nematodes. In this work, it was chosen to transform icotiana tabacum using plasmidial constructions for double strand RNA expression, aiming silencing target genes Isocitrate Lyase, Arginine Kinase, 14-3-3 Protein and Heat Shock Protein 90 of Meloidogyne incognita. Four regions of target genes were selected, isolated, subcloned in RNAi vector and are being used for plant transformation. In addition, it was done an expression analysis of the four target genes, normalized with housekeeping genes β-actin e 18S rRNA, using quantitative real time PCR. This experiment showed that these genes are differentially expressed when compared during egg, J2 and female phases. The major expression difference observed was the Isocitrate Lyase gene, which is a hundred times more expressed in egg or female when compared with J2.

Fitonematóides são responsáveis por grandes perdas econômicas na agricultura mundial estimadas em US 125 bilhões anuais. Esses fitopatógenos têm seu ciclo de vida dividido em seis estádios de desenvolvimento (ovo, juvenil 1-4 e adulto), durando em torno de 28 dias. O juvenil 2 penetra na raiz de planta hospedeira por força mecânica e degradação enzimática para estabelecer a interação planta-patógeno e se diferenciar em fêmea adulta apomítica, depositando em torno de 2000 ovos. Práticas agronômicas têm tido geralmente pouco sucesso e alto custo, sendo o cultivo de variedades resistentes, quando existentes, a forma mais eficiente de controle. Uma estratégia alternativa promissora é a transformação genética de plantas para expressão de moléculas que afetem o parasitismo. A metodologia de RNA interferente tem revolucionado a pesquisa experimental e muitas aplicações biotecnológicas estão sendo desenvolvidas. A abordagem planejada é a transformação genética de Nicotiana tabacum com construções plasmidiais para expressão de RNA dupla fita, tendo como propósito o silenciamento dos genes-alvo Isocitrato Liase, Arginina Quinase, Proteína 14-3-3 e Proteína de choque térmico 90 de Meloidogyne incognita. Desses genes-alvo, quatro fragmentos gênicos foram selecionados, isolados, subclonados em vetor para RNAi e estão em fase de transformação de planta, para futura realização de bioensaios avaliação de resistência a fitonematóides. Adicionalmente, foi realizada uma análise da expressão dos quatro genes-alvo, normalizados com os genes constitutivos de β-actina e 18S rRNA, por PCR…

Advisors/Committee Members: Fernando Araripe Gonçalves Torres, Thales Lima Rocha, Angela Mehta, Andréa Queiroz Maranhão.

▼ 

This work presents the study of the effects of an RGD disintegrin from Rhinocerophis alternatus (ancient Bothrops alternatus) in key steps of the metastatic cascade. Disintegrins are cysteine-rich peptides, which have several biological activities related to cell-cell interaction and cell adhesion. The correct pairing of disulfide bonds exposes the adhesive motif which confers binding specificity of disintegrins. These molecules selectively blocks the adhesive function of integrins, which directly participate in various physiological and pathological processes. In the first part of this work, we use the DisBa-01, a disintegrin from B.alternatus in fusion with 6 histidines in pET28a expression vector. The DisBa-01 in the flow system inhibited adhesion of B16F10 melanoma cells and platelets to type I collagen and activated the adhesion of B16F10 melanoma cells to type III collagen. In transmigration and adhesion of breast cancer cells MDA-MB-231, the DisBa-01 had the tendency to reduce these stages of metastatic cascade. The disintegrins have been instrumental in the development of molecules with potential therapeutic application and the effects produced by DisBa-01 in this work as well as others from our laboratory, led us in the second part of this work, the production of the disintegrin B.alternatus without the fusion peptide (called ATN) which conferred increased solubility of the disintegrin. ATN was isolated by two molecular exclusions chromatography and ion exchange chromatography and biological characterization was directed to the anti-metastatic effect of this molecule. In this sense, the ATN was unable to promote the adhesion of human erythroleukemia K562 cells, but inhibited the adhesion of tumor cells K562, B16F10 and MDA-MB-231 to fibronectin had no effect in fibroblasts. ATN is not able to detach the fibroblasts adhered to fibronectin but promotes the detachment of K562 and B16F10 cells previously adhered to fibronectin. However, it does not induce fragmentation of cellular DNA, showing no pro-apoptotic effect. In cell proliferation, the ATN has negative effect with 48 hours of incubation with B16F10 tumor cells, but fibroblasts and MDA-MB-231 this effect was not observed. By flow cytometry we observed the interaction of ATN with αvβ3 integrin. The MDA-MB-231 Tx migration was inhibited by ATN and changed the actin cytoskeleton of these cells. However, an increased activity of MMP-9 was observed in MDA-MB-231 treated with ATN and the invasion of MDA-MB-231 was induced by the RGD disintegrin. These results encourage further studies with this disintegrin in seeking the best concentração of the disintegrin, the identification of cytotoxic activity as well as the best method of distribution of this molecule in vivo.

Este trabalho apresenta o estudo dos efeitos de uma desintegrina RGD de Rhinocerophis alternatus (antiga Bothrops alternatus) nas principais etapas da cascata metastática. Desintegrinas são peptídeos ricos em cisteína, os quais apresentam diversas atividades biológicas relacionadas à…

Advisors/Committee Members: Heloísa Sobreiro Selistre de Araujo.

▼ 

O vírus da febre aftosa (FMDV), um patógeno que afeta animais no mundo todo, possui um RNA genômico de fita simples que, após infectar a célula, é imediatamente traduzido numa única poliproteína. Esta poliproteína produzida é processada durante a síntese em várias proteínas maduras através de peptidases codificadas pelo próprio vírus. A primeira clivagem da poliproteína viral é realizada pela Lbpro entre sua própria região C-terminal e a região N-terminal da proteína VP4. Lbpro também cliva especificamente dois homólogos dos fatores eucarióticos de iniciação (eIF) 4G, resultando na supressão da translação proteica do hospedeiro realizadas através dos mRNAs cap-dependentes. Consequentemente, o RNA do FMDV, que inicia a tradução via IRES, e não requer o eIF4G intacto, pode usar livremente a maquinaria de síntese protéica do hospedeiro para tradução viral. Nós usamos uma série de peptídeos fluorogênicos desenhados especificamente para examinar a especificidade por substratos, efeitos do pH e força iônica sobre a atividade catalítica da Lbpro e sua mutante sLbpro. Comparadas com outras cisteínos peptidases, como a papaína e catepsinas, Lbpro e sLbpro possuem muitas caracteríticas únicas como alta sensibilidade à sais e um sítio de ligação ao substrato muito específico, extendendo-se até a posição P7. Análises de dados estruturais mostraram que Lbpro liga os resíduos P1-P3 do substrato em uma conformação extendida, enquanto os resíduos P4-P7 são ligados numa curta hélice 310. A especificidade da Lbpro, revelada através dos peptídios substituídos pode ser explicada para todas as posições, exceto para P5.

Foot-and-mouth disease virus (FMDV), a global animal pathogen, possesses a single-stranded RNA genome that, on release into the infected cell, is immediately translated into a single polyprotein. This polyprotein product is cleaved during synthesis by proteinases contained within it into the mature viral proteins. The first cleavage is performed by the leader protease (Lbpro) between its own C-terminus and the N-terminus of VP4. Lbpro also specifically cleaves the two homologues of the cellular eukaryotic initiation factor (eIF) 4G, resulting in shut-off of host capdependent mRNA translation. Consequently, FMDV RNA, which initiates translation via IRES, and does not require intact eIF4G, can freely use the host protein synthesis machinery for viral protein synthesis. We used a panel of specifically designed fluorogenic peptides to examine the substrate specificity, effects of pH and ionic strength on Lbpro activity and of its shorter mutant sLbpro. Compared with other cysteine peptidases, how papain and the cathepsins, Lbpro and sLbpro possesses several unusual characteristics, including a high sensitivity to salt and a very specific substrate binding site extending up to P7. Indeed, almost all substitutions investigated were detrimental to Lbpro and sLbpro activity. Analysis of structural data showed that Lbpro binds residues P1 to P3 in an extended conformation whereas residues P4 to P7 are bound in a short 310 helix.…

Advisors/Committee Members: Adriana Karaoglanovic Carmona, Jair Ribeiro Chagas, Luiz Juliano Neto, Vitor Marcelo Silveira Bueno Brandão de Oliveira, Hamilton Cabral.

▼ Esta análise indicou 417 genes diferencialmente expressos, sendo 178 de micélio e 239 de levedura. Para os microarranjos de cDNA, 1.152 genes foram selecionados, sendo 565 contigs formados por 6 ou mais ESTs de micélio e levedura, 39 contigs formados por 2, 3, 4 ou 5 ESTs exclusivos de micélio ou levedura e 548 singlets que apresentavam anotação funcional. Nos microarranjos, os fragmentos de cDNA foram amplificados por PCR e hibridados com RNA total das duas formas. Destes genes, 328 mostraram-se diferencialmente expressos, sendo 58 de micélio e 270 de levedura. Estas duas estratégias identificaram 110 genes diferencialmente expressos em micélio e levedura. Dentre estes, foram selecionados para análise os genes classificados em três categorias MIPS. Na categoria metabolismo, foram selecionados 12 genes, sendo 5 (icdh, scs, tal, adk, udk) mais expressos em micélio e 7 (icl, acylcs, pdh, adh, papsr, aca, amt) mais expressos em levedura. Na categoria metabolismo e transporte de íons, foram selecionados 5 genes, sendo 2 (chs, ats) da via de síntese de novo de cisteína do metabolismo de enxofre e 3 (isc, ktp, pct) envolvidos no transporte de íons. Na categoria controle e organização celular - parede celular, membrana e citoesqueleto, foram selecionados 5 genes: ags, pcd, vrp bgl e hex. O caráter diferencial de todos estes genes foi confirmado por experimentos de northern blot. Estas análises mostraram que: células de micélio apresentam uma tendência para o metabolismo aeróbico enquanto um metabolismo anaeróbico é sugerido para as células de levedura; a super expressão em levedura dos genes que codificam as enzimas ATP sulfurilase, APS quinase, PAPS redutase e coline sulfatase, pertencentes ao metabolismo de enxofre, mostram a importância do enxofre orgânico para os processos de crescimento e diferenciação deste patógeno; a expressão diferencial de genes envolvidos na organização celular é essenciais para o processo de diferenciação celular, virulência e conseqüentemente patogenicidade de P. brasiliensis. Neste contexto, o conjunto das informações geradas neste trabalho fornece novos caminhos para o entendimento da transição dimórfica do P. brasiliensis, bem como identifica novos genes importantes para a virulência/patogenicidade deste fungo, que constituem potenciais alvos para o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas Advisors/Committee Members: Maria Fatima Grossi de Sa, Maria Sueli Soares Felipe, Nilce Maria Martinez Rossi, Patricia Silva Cisalpino.

▼ 

Os SNPs (single nucleotide polymorphism) sao mutac oes resultantes de uma substituic ao, inserc ao ou delec ao que ocorrem em uma unica base. Tais substituic oes sao perpetuadas quando ocorrem erros de pareamentos (mismatch) que nao sao corrigidos. Existem dois tipos de substituic ao: transic ao, quando ha trocas entre purinas (A e G) ou entre pirimidinas (C e T), e transversao quando ha a substituic ao de uma purina por uma pirimidina ou vice-versa. Nos acreditamos que a ocorrencia e distribuic ao desses eventos evolutivos nos genomas ocorrem em func ao da pressao biologica seletiva mas por outro lado tambem podem estar relacionadas `as caracterısticas fısicas da microrregiao onde eles acontecem. Neste trabalho, nos avaliamos a influencia da energia livre e da flexibilidade da microrregiao genomica em func ao da distribuic ao de SNPs em um genoma de procarioto e oito genomas de eucariotos. Como as bases vizinhas tem um papel importante na ocorrencia desses eventos, analisamos as perturbac oes locais que um mismatch promove na estrutura do DNA levando em considerac ao a composic ao das bases imediatamente adjacentes ao erro. Para tanto, recuperamos da base de dados dbSNP (release 132) as sequencias depositadas de nove organismos as quais foram classificadas de acordo com a presenca de transic ao ou transversao nos seus genomas. A metodologia descrita na literatura para o calculo dos valores de energia livre e flexibilidade de dois pares de bases foi extrapolada para a avaliac ao dessas propriedades em uma microrregiao composta por tres pares de bases contendo um mismatch central. Nossos resultados indicam que para certos organismos, como por exemplo Apis Mellifera , existe uma correlac ao quase linear entre a ocorrencia de SNPs e a energia livre. E tambem possıvel constatar que os SNPs ocorrem preferencialmente em regioes do DNA cujas faixas de valores de energia livre sao altas. Por outro lado, nossos resultados tambem evidenciam que a flexibilidade de uma microrregi ao interfere na ocorrencia dos SNPs, uma vez que a maioria desses eventos tendem a ocorrer em regioes mais rıgidas quando comparadas `as regioes de pareamentos canonicos do DNA. Finalizando, ao correlacionar a energia livre e as flexibilidades, observamos que para genomas como os de mamıferos as transic oes tendem a ocorrer mais frequentemente em microrregioes mais estaveis e rıgidas da molecula ao passo que as transversoes sao frequentes em microrregioes menos estaveis, porem rıgidas do DNA.

The single nucleotide polymorphism (SNPs) are the result of mutations from a single substitution, insert, or deletion of base pair. These substitutions are perpetuated when mismatches occur and are not corrected. There are two types of substitution: transitions when there are base changes between a purine (A and G) or between pyrimidine (C and T), and transversions when a purine is replaced by a pyrimidine or vice-versa. We believe that SNPs occurence and distribuition in genomes do not occur just due to selective biological…

Advisors/Committee Members: Paula Regina Kuser Falcão, Renata Nascimento de Freitas, Gerald Weber.

▼ 

A uricase, uma enzima que converte ácido úrico em alantoína, é comumente usada em kits comerciais de dosagem de ácido úrico. Com a finalidade de produzir esta enzima em grande escala por técnicas de Engenharia Genética, o gene da uricase de Bacillus subtilis subtilis foi clonado e expresso em Escherichia coli. Para tanto, foi feita uma PCR utilizando-se como template o DNA cromossomal de B. subtilis e primers específicos para amplificação do gene pucLM. O amplicon foi sub-clonado seguindo-se seqüenciamento para a confirmação da seqüência do gene e clonagem do gene pucLM no vetor de expressão pET21a. Esse vetor de expressão permite a fusão do gene da uricase com uma cauda de histidina His . O vetor resultante, pETURI, foi usado para 6x transformar as linhagens de E. coli BL21 DE3? pLysS, BL21 (DE3) C41, BL21 (DE3) C43, BL21 (DE3) PRILL e SURE, e a indução da expressão. Amostras da linhagem de E. coli BL21 DE3? pLysS foram selecionadas para o presente estudo. Essas células foram coletadas em diversos tempos de indução e analisadas por SDS-PAGE, que revelou a presença de uma proteína de indução de ~63 kDa. A espectrometria de massa foi utilizada para determinar a massa molecular da enzima recombinante, tendo detectado um íon com massa molecular de 58,67 kDa. Análises de Western Blot confirmaram a presença da cauda de histidina na proteína de indução e detectaram degradação da enzima recombinante na porção N-terminal. A purificação foi realizada em uma coluna de afinidade Ni-NTA. Ensaios enzimáticos detectaram uma proteína estável com pH ótimo 8,0, temperatura ótima entre 25C e 37C e atividade uricásica na fração eluída com atividade específica de 39 U/mg.

Bacillus subtilis URICASE EXPRESSION IN Escherichia coli Uricase, an enzyme that converts uric acid into allantoin, is commonly used in commercial kits for uric acid detection. Aiming to produce this enzyme in industrial scale using Genetic Engineering techniques, the uricase gene of Bacillus subtilis subtilis was cloned and expressed in Escherichia coli. In order to achieve this, a PCR was performed using B. subtilis cromossomal DNA as template and specific primers to amplify the gene pucL. The amplicon was sub-cloned following sequencing to confirm the gene sequence and cloning of the gene pucL in vector of expression pET21a. This vector of expression permits the fusion of the uricase gene with a histidine tag His . The resulting vector, pETURI, was used to transform the strains of 6x E. coli BL21 DE3? pLysS, BL21 (DE3) C41, BL21 (DE3) C43, BL21 (DE3) PRILL, and SURE, and the expression was induced by adding IPTG to the culture media. Samples of E. coli BL21 DE3? pLysS strain were selected to be used in the present study. These cells were collected in several induction times and analyzed by SDS- PAGE, which revealed the presence of a ~63-kDa induction protein. Mass espectrometry was used to determine the molecular mass of the recombinant enzyme, having detected an ion with molecular mass of 58,67 kDa. Western Blot analyses confirmed the presence of the histidine…

Advisors/Committee Members: Lucília Helena Marcelino, Beatriz Dolabela de Lima, Fernando Araripe Gonçalves Torres.

▼ 

We describe a new software, PL-DOCK (Protein-Ligand Dock), that combines genetic algorithm and rotamer library in order to achieve protein-ligand rigid and semi-flexible docking simulations. This program compose a methodology/software bigger that take combines GA, rotamer library and normal modes analysis to simulate protein-ligand and protein-protein docking into account local conformational adjustments as well as the induced fit mechanism implying the whole structure. The PL-DOCK uses a rotamer library for changing the side chains conformations within and around the binding site. The Force-Field PL-DOCK has unbound and a implicit solvation term. We describe only the methodology and discuss the results and the performance obtained. The PL-DOCK was applied to study two complexes: HIV-1 ASPARTYL PROTEASE and DMP323 as ligand and Dihydrofolate reductase (DHFR) and MTX as ligand.

Esse trabalho consiste no desenvolvimento de um método/ferramenta (PL-DOCK), baseada em algoritmos genéticos e biblioteca de rotâmeros para simular docking rígido e semi-flexível para complexos proteína-ligante. Esse programa é parte de uma metodologia/software mais ampla e que combina algoritmos genéticos, biblioteca de rotâmeros e análise de modos normais para simular o docking molecular de complexos: proteína-ligante e proteína-proteína. O PL-DOCK permite a simulação do docking semi-flexível por meio da flexibilização das cadeias laterais da proteína (receptor). Nessa versão do PL-DOCK, o ligante possui movimentos rígidos (rotação e translação). O PL-DOCK utiliza um campo de força composto por termos não ligados e um termo de solvatação implícita. O programa utiliza uma biblioteca de rotâmeros dependente da estrutura do backbone proposta por Dunbrack. Nesse trabalho de mestrado, o PL-DOCK foi testado para estudar dois complexos; HIV-1 Protease/DMP323 e DFHR/MTX.

Advisors/Committee Members: Luis Paulo Barbour Scott.

▼ 

Currently, studies of aspects of evolutionary biology in neotropical fishes diversity are still lacking, despite the strong environmental impact caused by human action that has had a negative effect in native species, many of which probably still unknown to science. The knowledge of genetic variability within and between populations is of utmost importance for planning of both fish breeding and conservation of natural populations. In the present study we have analyzed, especially through molecular cytogenetics techniques, 29 specimens of Pseudoplatystoma reticulatum (Paraguay river, state of Mato Grosso do Sul), 14 specimens of Pimelodus britskii (Igua?u river, state of Paran?), 6 specimens of Sorubim lima (Paraguay river, state of Mato Grosso do Sul) and 10 specimens of Steindachneridion parahybae (Para?ba do Sul river, state of S?o Paulo). Results indicate 2n = 56 chromosomes for all species, a distinct karyotype formula composed mainly of biarmed chromosomes. Other particular features were found, regarding the location for Ag+NORs and fluorescent in situ hybridization with 5S and 18S probes. Except P. britskii, which showed NORs in the terminal region of the long arm, all species showed Ag+NORs in the terminal position of the short arm. Another peculiar feature of this fish was the co-localization of one of the 5S and 18S rDNA sites, which could be considered an apomorphy to the others Pimelodidae studied. The present work aims to contribute to the collection of data on the cytogenetics studies of Siluriformes, considering that much of the here presented information are the first characterization of the karyotype macro-struture of analysed fishes.

Considerando-se a diversidade ictiofaun?stica neotropical, estudos sobre aspectos de biologia evolutiva s?o ainda pouco expressivos. Em contraste, o forte impacto ambiental causado pela a??o humana tem refletido negativamente sobre as esp?cies nativas, muitas ainda desconhecidas da ci?ncia. O conhecimento da variabilidade gen?tica intra e inter populacional ? de extrema import?ncia para o planejamento tanto da piscicultura quanto para a conserva??o das popula??es naturais. No presente trabalho foram analisados citogeneticamente, sobretudo aplicando t?cnicas de citogen?tica molecular, 29 exemplares de Pseudoplatystoma reticulatum (rio Paraguai, MS), 14 esp?cimes de Pimelodus britskii (rio Igua?u, PR), 6 indiv?duos de Sorubim lima (rio Paraguai, MS), e 10 exemplares de Steindachneridion parahybae (rio Para?ba do Sul, SP). Os dados obtidos revelaram 2n = 56 cromossomos para todas as esp?cies analisadas, f?rmulas cariot?picas distintas, compostas basicamente de cromossomos de dois bra?os e caracter?sticas pr?prias em rela??o ? localiza??o das RONs atrav?s da impregna??o pelo ?on Ag+ e pela hibrida??o fluorescente in situ com sondas de DNAr 5S e 18S. Com exce??o de P. britskii, que apresentou RONs na regi?o terminal do bra?o longo, todas as outras esp?cies apresentaram marca??es das Ag+RONs em posi??o terminal no bra?o curto. Outra caracter?stica peculiar de P. britskii…

Advisors/Committee Members: Maria João Collares-Pereira, Claudio Henrique Zawadzki, Daniele Aparecida Matoso, Roberto Ferreira Artoni.

▼ 

A ordem Gymnotiformes compreende os peixes elétricos, que estão amplamente distribuídos pelas Américas Central e do Sul. A família Gymnotidae possui apenas dois gêneros Gymnotus e Eletrophurus, sendo que este último foi recentemente incluído à família. O gênero Gymnotus é o mais especioso da ordem com 33 espécies, e é também o que comporta maior número de estudos citogenéticos. O presente trabalho teve por objetivos analisar o comportamento meiótico do sistema de cromossomos sexuais múltiplo X1X1X2X2/X1X2Y em G. pantanal. Isolar sequências de DNA repetitivo das três espécies que habitam em simpatria o rio Piquiri Paraná Brasil: G. sylvius, G. paraguensis e G. pantanal, e neste último a possível associação dessas sequências aos cromossomos sexuais. E mapear o DNAr 5S em G. paraguensis e G. pantanal. A Análise meiótica revelou a formação de um trivalente no estágio de paquíteno da Prófase I em G. pantanal formado pelos cromossomos X1, X2 e Y, pareados complementarmente caracterizando um sistema de determinação sexual recente. A metáfase II apresentou células com 18+Y e 18+X1X2 cromossomos, caracterizando uma disjunção típica dos cromossomos sexuais, dando origem a gametas balanceados. O mapeamento de sequências de DNA repetitivos isolados por C0t 1 apresentou localização em região centromérica e na região das regiões organizadoras de nucléolos de todas as espécies analisadas, inclusive nos cromossomos sexuais de G. pantanal, padrão coincidente com blocos heterocromáticos. A hibridização com sondas de DNAr 5S revelou padrão de marcação próprio em todas as espécies analisadas. Nossos dados sugerem uma origem recente para os cromossomos sexuais de G. pantanal e uma dinâmica evolutiva diferenciada para distribuição do DNAr 5S no cariótipo das espécies analisadas. Sugerindo que este caráter possa ser mais amplamente utilizado entre os Gymnotidae como marcador citotaxonômico.

The order Gymnotiformes ranges the electrical fish. Its distributed by South and Central America. Family Gymnotidae show two genus; Gymnotus and Eletrophurus, the last one was recently included in this family. Genus Gymnotus is the most widespread and show 33 species and present great number of cytogenetics studies. Our objectives in the present study were analyse the meiotic behaviour of multiple sexual chromosomes system X1X1X2X2/X1X2Y of G. pantanal, isolate sequences of repetitive DNA from three species of Gymnotus; G. sylvius, G. paraguensis and G. pantanal, inhabiting in simpatry at Piquiri River - PR BR, verify the association of these sequences with sexual chromosomes and mapping the rDNA 5S gene at G. paraguensis and G. pantanal. Meiotic analysis of G. pantanal presented one trivalent in pachytene of profase I formed by X1, X2 and Y chromosomes, totally paired characterizing a recent sexual chromosomes system. In the metaphase II was visualized cells 18+Y and 18+X1X2 chromosomes with normal disjunction of sexual chromosomes and balanced gametes. The mapping of repetitive DNA sequences, isolated by Cot1, presented location in centromeric and…

Advisors/Committee Members: Roberto Ferreira Artoni, Vladimir Pavan Margarido, Orlando Moreira Filho, Mara Cristina de Almeida.

▼ 

As células conjuntivas hepáticas possuem um papel importante na patogênese da infecção por Schistosoma mansoni, e dentre essas células destacam-se as células estreladas hepáticas. As células estreladas hepáticas derivadas do granuloma esquistossomótico podem ser cultivadas in vitro, sendo denominadas células GR. No estado fisiológico, essas células estão situadas no espaço de Disse de maneira quiescente, e representam as principais células armazenadoras de vitamina A do organismo. Quando ativadas essas células perdem sua capacidade de armazenamento e passam a ter o fenótipo de miofibroblastos, contribuindo na resposta granulomatosa e no processo fibrótico durante a infecção por S. mansoni. No entanto, ainda não foi descrito o envolvimento dessas células na intensa eosinofilia tecidual que é característica da esquistossomose. A fim de melhor entender o envolvimento da GR na ativação de eosinófilos, o objetivo deste trabalho foi identificar a produção de mediadores eosinopoéticos, assim como a presença dos corpúsculos lipídicos nas células GR. Demonstramos que as células GR expressam RNAm para Interleucina-5 (IL-5) e eotaxina, e também para 5-Lipoxigenase (5-LO), FLAP e LTC4-sintase, enzimas necessárias para a síntese de leucotrienos. No entanto, só foi detectada a presença de cisteinil leucotrienos (cysLTs) no sobrenadante dessas células em cultura. Além disso, observamos que parte da 5-LO expressa pelas células GR é compartimentalizada nos corpúsculos lipídicos, que são estruturas citoplasmáticas ricas em lipídeos presentes em células inflamatórias. Dessa forma, concluímos que as células GR parecem contribuir na eosinofilia observada durante a esquistossomose mansônica através da expressão de mediadores eosinofílicos.

The connective hepatic cells are very important cells during the pathogenesis of S. mansoni infection, and from these cells we can highlight the hepatic stellate cells. Hepatic stellate cells derived from shistosome granuloma can be maintained in vitro, and them named GR cells. In normal liver, these cells are located in Disses space, in a quiescent state and are the main source of vitamin A in the body. When activated these cells lose the ability to store vitamin A and transform into myofibroblastic cells, contributing to the granulomatous response and the fibrotic reaction during S. mansoni infection. However, there is no data related to the involvement of hepatic stellate cells in eosinophil mobilization during schistosomiasis. To better understand the involvement of GR cells in eosinophil activation, the aim of this work was to identify the production of eosinopoietic mediators, as well as the presence of lipid bodies in GR cells. We demonstrated that GR cells express mRNA for Interleukin-5 (IL-5) and eotaxin, and also to the leukotriene-forming enzymes, 5-lipoxygenase (5-LO), FLAP and LTC4-synthase. However in the supernatant of these cells was detected only the presence of cysteinyl leukotrienes (cysLTs). We also observed that part of 5-LO expressed by GR cells are compartimentalizated in lipid…

Advisors/Committee Members: Patricia Torres Bozza, Radovan Borojevic.

▼ 

Although extensively studied by its recognized potential as bioinseticide, B. thuringiensis ecology is poorly understood, and despite its increasing use, little is known regarding interactions between this microorganism and plants. Thus, a tractable marker for detection of this bacterium under specific environment and physiological conditions is a valuable tool. A plasmid (pAD43-25) bearing a functional gfp gene and the parental vector, bearing the promotorless gfp gene, were introduced in the Brazilian wild-type strain B. thuringiensis kurstaki S76, allowing, in the first case, the constitutive synthesis of GFP during vegetative growth. Additionally, both vectors were transferred to a Cry- B. thuringiensis host. Green bright cells could be detected, by fluorescence microscopy and in both hosts, since 2h after inoculation in liquid medium and could be seen throughout remaining cultivation time, until complete sporulation was accomplished. Strain S76GFP+ seems to grow slower than the remaining recombinants and parental cells, whereas no perceptible change in cell or colony morphologies was observed. Protein profile and plasmidial DNA analyses indicate, respectively, that this recombinant maintained Cry proteins expression and resident plasmid outline. To our knowledge, it is the first time fluorescence is detected in a B. thuringiensis strain, as well as, that GFP is expressed in a wild-type B. thuringiensis.

B. thuringiensis é um importante entomopatógeno amplamente estudado e empregado como agente de controle biológico, ainda assim, a ecologia desse microrganismo é pouco explorada. Apesar da crescente utilização na agricultura desse agente, as interações com plantas são pouco conhecidas. Com o intuito de construir uma ferramenta eficaz para o rastreamento dessa bactéria, foi desenvolvida a estirpe S76GFP+ a partir de uma estirpe brasileira selvagem de B. thuringiensis. O vetor de expressão pAD43-25 contendo o gene gfpmut3a funcional, além do vetor parental, pAD123, contendo o mesmo gene, porém sem promotor foram transferidos para a estirpe S76, permitindo no primeiro caso a expressão constitutiva do gene durante o crescimento vegetativo. Adicionalmente, como controle, ambos vetores foram transferidos para uma estirpe acristalífera (Cry-). Células verdes brilhantes foram detectadas por microscopia de fluorescência, em ambas hospedeiras transformadas com o vetor pAD43-25, a partir de duas horas após a inoculação em meio líquido e que puderam ser observadas pelo restante do tempo de cultivo até o fim da esporulação. A estirpe S76GFP+ apresentou um discreto acréscimo no tempo de geração, embora não tenham sido observadas alterações morfológicas das colônias e células. Análises dos perfis protéico e plasmidial indicaram, respectivamente, a manutenção da expressão das proteínas Cry e do elenco dos plasmídeos residentes. Do nosso conhecimento, não apenas é o primeiro relato de visualização da emissão de fluorescência pela expressão de GFP em B. thuringiensis. Igualmente, é o primeiro relato de expressão de GFP em uma…

Advisors/Committee Members: Ildinete Silva Pereira, Leila Maria Gomes Barros, Marlene Teixeira De-Souza, José Ivo Baldani.

▼ 

O Rio São Francisco compõe uma das maiores e mais importantes bacias hidrográficas do território brasileiro e uma de suas principais características é a variedade da ictiofauna. O gênero Salminus (Characiformes: Characidae), constitui um grupo de peixes migradores com grande importância econômica, na pesca esportiva e na gastronomia. Dentro desse gênero, destaca-se Salminus hilarii (tabarana), devido ao seu alto grau de seletividade pelo ambiente e por ocupar o topo da cadeia alimentar. Isso confere à espécie uma grande importância para o ecossistema e a coloca na posição de uma boa indicadora de impactos ambientais. Muitos estudos sobre genética da conservação e de populações têm sido realizados utilizando marcadores moleculares, tais como os microssatélites, capazes de fornecer dados sobre os processos genéticos que estão atuando em uma determinada população. Esses marcadores possuem sequências flanqueadoras relativamente conservadas, o que permite a utilização de primers que foram desenhados originalmente para outra espécie em espécies filogeneticamente próximas. Assim, utilizando nove locos polimórficos de microssatélites isolados de Salminus franciscanus, o objetivo do presente estudo foi analisar a variação genética de S. hilarii coletados em três localidades na bacia do alto São Francisco e identificar evidências de estruturação populacional, produzindo conhecimentos genéticos aos estudos de conservação deste grupo de peixes e contribuindo de maneira efetiva para a manutenção da biodiversidade desse ecossistema. Os resultados obtidos evidenciaram que a amplificação heteróloga foi eficiente e permitiu identificar uma variação genética relativamente alta na espécie em estudo. Além disso, foi possível observar a ausência de estrutura genética entre as populações, indicando a ocorrência de fluxo gênico entre as populações suficiente para manter a homogeneidade genética entre elas. Esses resultados constituem ferramentas importantes, uma vez que contribuem para o entendimento do comportamento e biologia desses peixes, e para programas de manejo de pesca e conservação da tabarana.

The São Francisco river comprises one of the largest and most important river basins of Brazil and one of its main characteristics is the variety of fish species. The genus Salminus (Characiformes: Characidae) constitutes a group of migratory fish with great economic importance in fishing and gastronomy. Within this genus, Salminus hilarii (tabarana), due to its high degree of selectivity for the environment and to occupy the top of the food chain, of great importance to the ecosystem and a good indicator of environmental impacts. Many studies on conservation and population genetics have been conducted using molecular markers such as microsatellites, which can provide data on the genetic processes that are acting in a given population. These markers have relatively conserved flanking sequences, which allows the use of primers that were originally designed for other phylogenetically related species. In this study, nine polymorphic…

Advisors/Committee Members: Pedro Manoel Galetti Júnior.

▼ 

Compostos da família das pirrolbenzodiazepinas (PBD) são conhecidos por apresentarem atividade antitumoral promissora. Dentre elas, as chamadas híbridas que possuem uma porção PDB uma cadeia espaçadora e outro grupo funcional, como as cumarinas deste trabalho, têm sido muito exploradas. Sabe-se que estes compostos se ligam ao DNA, mas não há dados estruturais mostrando como a ligação ocorre. Para suprir esta falta de informação foram realizados cálculos de docking molecular para estudar a formação de complexos entre estas PBDs híbridas e o DNA. Os compostos estudados foram modelados e as coordenadas de complexos DNA-receptores com diferentes ligantes foram obtidas do Protein Data Bank. O redocking serviu para validar as condições dos experimentos e os escores foram utilizados como parâmetro de avaliação dos complexos formados. A análise das interações intermoleculares, conhecimento essencial para o entendimento das estruturas obtidas, foi feita utilizando visualização molecular de alta resolução. Os resultados dos experimentos in silico mostraram a formação de complexos no modo de ligação misto, com os ligantes intercalando a porção PBD entre bases do DNA e a porção cumarina ocupando o sulco menor, mostrando ter preferência pela intercalação entre bases GG. Mais ainda, é possível postular que o complexo se torne um aduto com a formação de uma ligação covalente entre a porção PBD intercalada e uma base nucleotídica G. Finalmente foi estabelecida uma correlação entre os resultados do docking e as atividades biológicas dos compostos estudados.

Compounds of the pirrolbenzodiazepine (PBD) family are known for their promising antitumor activity. Among these, the hybrids, those that have a portion PDB a chain spacer and another functional group, such as the coumarins of this work, have been extensively explored. It is also known that these compounds bind to DNA, but there is no structural data showing how it occurs. To overcome this lack of information molecular docking calculations were performed to study the formation of complexes between these PBD-hybrids and DNA. The compounds were modeled and the coordinates of complexes DNA-receptors with different ligands were obtained from the Protein Data Bank. The redocking served to validate the conditions of the experiments and the scores were used as the parameter to evaluate the complexes formed. The analysis of the intermolecular interactions, an essential knowledge for understanding the obtained structures were analyzed using high-resolution molecular imaging. The results of the in silico experiments showed the formation of complexes in the mixed-mode with the PBD ligand moiety intercalating between the DNA bases and the coumarin portion occupying the minor groove, and a preference for intercalation between GG bases. Moreover, it is possible to postulate that the complex becomes an adduct with the formation of a covalent bond between the intercalated portion PBD and a nucleotide base G. Finally, a correlation between the docking results and the biological activities of…

Advisors/Committee Members: Ignez Caracelli.

▼ 

A metaloproteinase de membrana 1 (MT1-MMP) é envolvida em processos de adesão proliferação, migração celular e morte celular durante a organogênese e na fase adulta de vertebrados. Entretanto, o seu papel no desenvolvimento do intestino delgado de vertebrados ainda não foi estabelecido. Nós formulamos a hipótese de que essa metaloproteinase de membrana teria um papel relevante no processo de desenvolvimento da mucosa intestinal. Para avaliar essa hipótese, detectou-se a marcação da MT1-MMP por imunohistoquímica na mucosa intestinal ao longo do desenvolvimento pré e pós-natal de ratos e galinhas para que, a partir de uma análise comparativa, fosse possível inferir a respeito do papel dessa metaloproteinase. No período pré-natal de ratos, a marcação da MT1-MMP correlaciona com eventos que levam à morfogênese das vilosidades e estabelecimento da homeostase tecidual. No período pré-natal de galinhas, a marcação da MT1-MMP correlaciona com eventos que levam ao crescimento do intestino. No período pós-natal de ratos e galinhas, a marcação da MT1-MMP foi mantida no epitélio intestinal, o que nos levou a sugerir que essa metaloproteinase tem um papel importante na homeostase tecidual durante toda a vida adulta.Nós sugerimos que o papel da MT1-MMPna remodelação e crescimento da mucosa intestinal de ratos e galinhas está relacionado com adesão, proliferação, migração e morte de células epiteliais e migração de células mesenquimais. Esse é o primeiro trabalho que evidencia a MT1-MMP no intestino delgado de vertebrados durante o desenvolvimento, possibilitando estudos subsequentes que venham a esclarecer o papel dessa metaloproteinase na formação desse importante órgão.

Membrane type I MMP (MT1-MMP) is involved in cellular adhesion, proliferation, migration and cell death during organogenesis and adult phase of vertebrates. However, its role in the development of the small intestinal has not been established. We formulated the hypothesis that this metalloproteinase would play a relevant role in the development of the intestinal mucosa. To assess this hypothesis was detected the labeling of MT1-MMP by immunohistochemistry in the intestinal mucosa along the pre-and postnatal development of rats and chickens so that from a comparative analysis, it were possible infer about the role of this metalloproteinase.In thepre natal phase of rats, the labeling of MT1-MMP correlates with events that lead to morphogenesis of villi and establishment of the tecidual homeostasis. In the pre natal phase of chickens, the labeling of MT1-MMP correlates with events that lead to growth of the intestine. In the postnatal phase of rats and chickens, the labeling of MT1-MMP was maintained in the intestinal mucosa, which led us to suggest that this metalloproteinase have a relevant role in the tecidual homeostasis throughout adulthood.We suggest that the role of that MT1-MMPin the remodeling and growth of the intestinal mucosa of rats and chickens is related with adhesion, proliferation, migration and death of epithelial cells and migration of…

Advisors/Committee Members: Maria Albertina de Miranda Soares, Marcia Regina Paes de Oliveira, José Rosa Gomes, Luzmarina Hernandes.

▼ 

Aedes aegypti is the most important vector of human arboviral diseases and it is responsible for dengue and urban yellow fever transmissions. Trypsin-like enzymes plays an important role in the Ae. aegypti adult and larval life stages digestion. In the present work, we identified the two major trypsin-like enzymes of Ae. aegypti larval midgut through the trypsin cDNA fragments library construction. They are AAEL005607 and AAEL006371, with expression frequencies of 29.3% and 20%, respectively. Semi quantitative PCR analysis showed that the AAEL005607 was transcripted in all larval instars, but AAEL006371 appeared only in 3rd and 4th larval instars. In order to confirm the transcription data, trypsin-like enzymes from 4th instar larvae of Ae. aegypti midgut were purified by affinity, ionic exchange and reversedphase chromatographies. Purified trypsin presented molecular mass of 28 kDa by SDS-PAGE. Its partial amino acid sequence allowed us to suggest that the trypsin activity is encoding by AAEL005607 sequence. The purified trypsin (AAEL005607) showed Km value of 36.4 μM for Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa substrate and was strongly inhibited by AaTI and HiTI, both trypsin inhibitors, with Ki of 0.94 pM and 160 pM, respectively. In conclusion, for the first time, the major digestive enzyme of 4th larval instar of Ae. aegypti was identified and characterized.

O Aedes aegypti é o vetor mais importante de arboviroses humana sendo responsável pelas transmissões de dengue e febre amarela urbana. As enzimas tipo tripsina apresentam um importante papel na digestão de estádios de vida larval e adulto de Ae. aegypti. No presente trabalho, nós identificamos as duas enzimas tipo tripsina majoritárias do intestino médio larval através da construção de uma biblioteca de fragmentos de cDNA de tripsina. Elas são AAEL005607 e AAEL006371, com frequências de expressão de 29,3% e 20%, respectivamente. Análises por PCR semi-quantitativo mostraram que a tripsina AAEL005607 foi transcrita em todos os instars larval, mas a tripsina AAEL006371 apareceu somente nos 3 e 4 instar larvais. A fim de confirmar os dados de transcrição, enzimas tipo tripsina do intestino médio de larvas de 4 instar foram purificadas por cromatografias de afinidade, troca iônica e fase reversa. A tripsina purificada apresentou massa molecular de 28 kDa por SDS-PAGE. Sua sequência de aminoácidos parcial nos permitiu sugerir que a atividade de tripsina é codificada pela sequência AAEL005607. A tripsina purificada (AAEL005607) exibiu um valor de Km de 36,4 μM para o substrato Tosyl-Gly-Pro-Arg-pNa e foi fortemente inibida por AaTI e HiTI, ambos inibidores de tripsina, com valores de Ki de 0,94 pM e 160 pM, respectivamente. Em conclusão, pela primeira vez, a enzima digestiva majoritária de 4 instar larval de Ae. aegypti foi purificada e caracterizada.

Advisors/Committee Members: Mariana da Silva Araujo, Jair Ribeiro Chagas, Aparecida Sadae Tanaka, Itabajara da Silva Vaz Junior.

▼ [ES] C3G es un factor de intercambio de nucleótido de guanina (GEF) de las GTPasas pequeñas celulares Rap1, Rap2, R-Ras, TC21 y TC10 (Gotoh et al. 1995, Gotoh et al. 1997). Estas proteínas promueven el intercambio del nucleótido unido a la GTPasa, facilitando la transición del estado inactivo, unido a GDP, al estado activo, unido a GTP(Cherfils et al. 1999, Vetter et al. 2001). En general, en ausencia de estimulo los GEFs de la familia Ras permanecen en un estado autoinhibido regulado a través de interacciones intramoleculares que envuelven regiones catalíticas y no catalíticas (Pufall et al. 2002). La perdida de estos mecanismos de autorregulación produce una activación espuria de las GTPasas que puede derivar en el desarrollo de enfermedades como Cáncer o enfermedades congénitas (Simanshu et al. 2017). Por ejemplo, la perdida del mecanismo de autoregulación de SOS produce el síndrome de Noonan (Lepri et al. 2011, El Bouchikhi et al. 2016). C3G es una proteína formada por tres regiones estructural y funcionalmente diferentes: (I) la región N-terminal es rica en alfa-hélices, interacciona con E-cadherina, y establece contactos intramoleculares con el dominio REM (Hogan et al. 2004, Gómez-Hernández 2014). Además, el N-terminal de la proteína se une a fosfolípidos, una característica típica de otros GEFs (Gómez-Hernández 2014). (II) la región central, o SH3b, es intrínsecamente desordenada y contiene cuatro motivos ricos en Prolina que median la interacción con proteínas que contienen dominios tipo SH3, como las proteínas Crk (Knudsen et al. 1994, Wu et al. 1995), p130Cas (Kirsch et al. 1998), Grb2 (Tanaka et al. 1994), Hck (Shivakrupa et al. 2003), c-Abl (Radha et al. 2007),y la onco-proteína Bcr-Abl (Gutierrez-Berzal et al. 2006). De todas ellas, las proteínas Crk se unen a C3G con alta afinidad y median la función adaptadora a través del reclutamiento del complejo C3G-CrkL a la membrana, en condiciones de estimulación (Birge et al. 2009, Braiman et al. 2015). C3G contiene en su región central múltiples residuos de Tyrosina, susceptibles de ser fosforilados por las kinasas de las familias Src y Abl. Entre ellos, la fosforilación de la Tyrosina 504 produce la activación de la actividad GEF en células COS1(Ichiba et al. 1999). (III) La región C-terminal, o región catalítica, esta formada por los dominios REM y Cdc25H. El dominio Cdc25H se une directamente a la GTPasa y desestabiliza la interacción del nucleótido unido (Boriack-Sjodin et al. 1998). El dominio REM establece contactos con el dominio Cdc25H que son esenciales para la regulación de su actividad en otros GEFs de la familia (Margarit et al. 2003, Freedman et al. 2006). C3G participa en multitud de funciones en la célula, como el establecimiento de uniones adherentes, la remodelación del citoesqueleto de actina, el desarrollo del sistema nervioso central, la activación de integrinas tras la activación del receptor de células T, y la fisiología plaquetaria entre otros (Nolz et al. 2008, Radha et al. 2011, Gutierrez-Herrero et al. 2012, Martin-Granado et… Advisors/Committee Members: DE PEREDA, JOSÉ MARÍA (advisor), Guerrero Arroyo, María Carmen (advisor).

▼ Neste trabalho propusemos e analisamos metodologias empregadas no uso da tecnologia dos Ácidos Nucléicos Livres de Células Fetais (cffDNA = Cell Free Fetal DNA) no diagnóstico pré-natal não invasivo (DPIN = Non-invasive Prenatal Diagnosis). Dada a modernidade das tecnologias empregadas e a sua repercussão nas famílias envolvidas, procuramos discutir algumas implicações éticas, sociais e legais. Ao contrário da crença popular de que a placenta constitui uma barreira impermeável entre mãe e filho, há tráfego bidirecional entre o feto e a mãe durante a gravidez. Vários estudos têm demonstrado que tanto células fetais intactas e ácidos nucléicos livres de células fetais (cffNA, ou seja, DNA e RNA) atravessam a placenta e circulam na corrente sanguínea materna. Identificamos quatro diferentes aplicações da tecnologia de análise do cffDNA: a) Determinação pré-natal do sexo, utilizada em gestações com risco de uma doença ligada ao sexo e realizada através da detecção do cromossomo masculino Y; b) O diagnóstico de certas doenças de gene único, normalmente através da detecção de mutação herdada paternalmente; c) Aneuploidia fetal, tal como a Síndrome de Down, onde há alterações cromossômicas; d) Detecção do tipo de sangue fetal em gestações com risco de incompatibilidade, sobretudo RhD. Para realizar este trabalho utilizamos a determinação pré-natal do sexo em 53 gestantes em diferentes períodos gestacionais. Para tal, testamos e propusemos metodologias de extração do DNA; amplificação do DNA extraído através da técnica da PCR (Polymerase Chain Reaction) e de uma nova metodologia denominada LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification); e a análise final dos resultados. Além disso, comparamos a eficiência da PCR e LAMP amplificando diferentes segmentos do cromossomo Y: DSY14 e TSPY. Em três casos as amostras foram descartadas porque não houve a confirmação do sexo fetal após os testes moleculares devido à perda de contato com as gestantes. Em outros dois casos os resultados apontaram para fetos masculinos, entretanto, no ultra-som eles foram confirmados como femininos, provavelmente devido a uma contaminção. No final obtivemos 28 amostras (58,33%) masculinas, com a amplificação das sequências do cromossomo Y e 20 amostras (41,67%) femininas que não amplificaram a sequência do cromossomo Y e apenas para o controle. Nossos resultados demonstraram que a amplificação por LAMP é mais eficiente que a PCR na análise de DSY14, sendo que o limite de detecção é de 10 pg e 0,1 pg, para a PCR e o LAMP, respectivamente. Concluímos que a amplificação utilizando a metodologia de LAMP é mais rápida (60 minutos) e apresenta uma alta especificidade, sensibilidade e não requer equipamentos sofisticados para reação, comparada com a técnica da PCR. Tais características viabilizam esta metodologia em laboratórios com poucos recursos. Advisors/Committee Members: Euclides Matheucci Junior.

▼ 

Esta dissertação trata do desenvolvimento de novas abordagens e ferramentas computacionais focadas nas seguintes aplicações: aperfeiçoamento do fluxo de informação de Plataformas Tecnológicas de Seqüenciamento e de Bioinformática; montagem de seqüências em projetos genomas; detecção de seqüências repetitivas; análise comparativa e anotação de genomas. A maioria das ferramentas foram desenvolvidas e/ou aplicadas no projeto genoma do Mycobacterium bovis cepa BCG Moreau-RJ, que foi seqüenciado, montado e anotado em nosso laboratório. Uma parte dos resultados deste projeto genoma foi utilizada no desenvolvimento de ferramentas de identificação e controle de qualidade que possam ser utilizadas na manutenção e produção da vacina BCG Moreau-RJ, e foram objetos de um depósito de patente, no âmbito nacional e internacional. Além disto, vários sistemas independentes, porém complementares, foram desenvolvidos para a análise de genomas em geral, os quais permitem uma série de aplicações na interface in silico in vitro. (1) ReRep (Read Repeat Finder) é um sistema que detecta seqüências repetitivas em um conjunto de dados oriundos de seqüenciamento aleatório (GSS), visando a caracterização de repetições e permitindo um auxílio na montagem de seqüências genômicas, tendo sido aplicado em um conjunto de GSS com cobertura de 1,4 % do genoma de Leishmania braziliensis. (2) AnEnPi (Analogous Enzyme Pipeline), composto por um banco de dados de enzimas para a anotação de vias metabólicas e detecção de possíveis alvos terapêuticos, com várias possibilidades de comparação e geração de mapas metabólicas, aplicado em L. major e Trypanosoma cruzi. (3) Conjunto de ferramentas para assistir a montagem e a anotação do genoma BCG Moreau-RJ: páginas web do projeto, incluindo monitoramento de estatísticas de montagem e visualização do mapeamento das leituras contra o genoma do Mycobacterium bovis; fluxo de montagem para o projeto; dois programas utilizados na finalização da montagem, para caracterização de gaps (GFK Gap-Find-Kill) e PCR in silico; uma ferramenta para anotar um genoma alvo com um genoma de referência; abordagens e o programa AceSNPFinder para encontrar inserções, deleções, inversões, rearranjos, trocas, duplicações e polimorfismos para comparar o genoma do BCG Moreau-RJ com outras cepas de BCG e M. tuberculosis, e comparação de genomas em geral; (4) Implementação das plataformas: Genoma - Seqüenciamento de DNA e de Bioinformática, ambas vinculadas ao Programa de Desenvolvimento Tecnológico em Insumos para Saúde (PDTIS).

This dissertation deals with the development of new methods and computational tools with the following applications: improvement of the pipeline of the sequencing and bioinformatics technological platforms; sequences assembly; detection of repetitive sequences; comparative analysis and annotation of genomes. The majority of the tools was applied in the genome project of the Mycobacterium bovis strain BCG Moreau-RJ, which was sequenced, assembled and annotated in our laboratory. Results of this genome project, such…

Advisors/Committee Members: Celso da Cruz Carneiro Ribeiro, Wim Maurits Sylvain Degrave.

▼ A utilizaÃÃo de microrganismos como sistemas heterÃlogos de expressÃo de proteÃnas tem se mostrado uma estratÃgia alternativa e/ou complementar aos passos tradicionais utilizados no processo de purificaÃÃo de proteÃnas. Diante deste contexto, quitinases (EC 3.2.1.14), enzimas hidrolÃticas capazes de degradar quitina, tÃm sido expressas em diferentes sistemas heterÃlogos, incluindo bactÃrias e leveduras. Quitina à um polÃmero linear composto de resÃduos de N-acetil-β-D-glucosamina (GlcNAc), sendo um importante constituinte estrutural da carapaÃa de crustÃceos e membrana peritrÃfica de insetos e, ainda, da parede celular de fungos. Este trabalho teve por objetivo expressar uma quitinase, codificada pela ORF cv3316, de Chromobacterium violaceum ATCC 12472 na levedura metilotrÃfica Pichia pastoris, estirpes GS115 e KM71H, alÃm de purificar e caracterizar a proteÃna recombinante (rCHI3316). A estirpe GS115, portando a construÃÃo (pPICZαA-CV3316), foi selecionada para os experimentos posteriores, pois apresentou um maior nÃvel de expressÃo quando comparada à cepa KM71H. Cromatografia de afinidade em coluna de nÃquel imobilizado foi utilizada para purificar a quitinase recombinante (rCHI3316), que foi eluÃda como um Ãnico pico com imidazol 0,04 M. A proteÃna purificada se mostrou homogÃnea quando submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida 15% em presenÃa de SDS e -mercaptoetanol (SDS-PAGE). Nessas condiÃÃes, uma Ãnica banda com massa molecular aparente de aproximadamente 87 kDa foi observada. A quitinase rCHI3316 de C. violaceum foi expressa de forma solÃvel utilizando o sistema de expressÃo P. pastoris e, alÃm disso, sua purificaÃÃo foi realizada de forma satisfatÃria. O conteÃdo de estrutura secundÃria foi estimado por espectroscopia de dicroÃsmo circular (CD), com a proteÃna submetida a diferentes temperaturas (10-90 ÂC). Na temperatura de 24 ÂC, o espectro de CD revelou a predominÃncia do conteÃdo de hÃlice alfa (38%), folha beta (26 %) e estrutura randÃmica (37%). Entre as temperaturas de 10-50 ÂC, rCHI3316 exibiu um espectro caracterÃstico de folha beta. A partir de 60 ÂC atà 90 ÂC, rCHI3316 adquiriu uma conformaÃÃo caracterÃstica de hÃlice alfa. A temperatura mÃdia para essa transiÃÃo conformacional foi calculada como sendo 59,6  1,21 ÂC. Experimentos de espectroscopia de fluorescÃncia, com excitaÃÃo a 280 e 290 nm, produziram espectros de emissÃo com comprimentos de onda mÃximos iguais a 339 e 342 nm, respectivamente. Esses valores sÃo caracterÃsticos de resÃduos de triptofano parcialmente expostos ao solvente. Atividade quitinolÃtica contra vÃrios substratos e dependÃncia de pH da atividade enzimÃtica da proteÃna pura foram avaliados. A rCHI3316 exibiu atividade hidrolÃtica sobre os substratos quitina coloidal (1.189,40 U/mgP), 4-nitrofenil N-Nâ-diacetil-β-D-quitobiosÃdeo (30.411,0 U/mgP) e 4-nitrofenil N-Nâ-Nââ-triacetilquitotriose (13.150,0 U/mgP); entretanto, nenhuma atividade enzimÃtica da rCHI3316 foi detectada frente a 4-nitofenil N-acetil-β-D-glucosaminÃdeo. A… Advisors/Committee Members: Thalles Barbosa Granjeiro.

▼ A síndrome metabólica é caracterizada pela presença de alguns fatores de risco que ocorrem simultaneamente em indivíduos obesos, tais como Diabetes mellitus tipo 2, dislipidemias e hipertensão arterial. O GLP-1 é uma importante incretina que que pode melhorar o rendimento das células beta pancreáticas. O tecido adiposo é considerado um tecido endócrino complexo e ativo, o qual secreta fatores, denominados adipocinas, que por meio de um sistema dinâmico de sinalização participam de vias biológicas importantes no balanço energético, metabolismo de nutrientes e sistema imune. Estudos indicam que a prática regular de atividade física tem relação com a prevenção e tratamento da obesidade. Assim, este trabalho avaliou os efeitos do treinamento físico na expressão das seguintes adipocinas coletadas de tecido adiposo visceral: adiponectina, TNF alfa, PPAR gama e PPAR alfa. Além disso, foi avaliada a expressão de GLP-1 de íleo distal, bem como a ação insulinotrópica desta incretina nas ilhotas pancreáticas. O modelo animal de obesidade utilizado neste trabalho foram ratos tratados com glutamato monossódico (MSG) durante o período neonatal, levando os animais a desenvolver obesidade na vida adulta. Os animais foram divididos em quatro grupos: MSG sedentários, MSG exercitados, controles sedentários e, controles exercitados. Animais dos grupos exercitados foram submetidos à natação. Aos 90 dias, os animais foram sacrificados, parâmetros bioquímicos e biométricos foram analisados, as ilhotas pancreáticas foram isoladas e secções da gordura mesentérica e do íleo distal foram armazenadas para ensaios de qRT-PCR (Quantitative Real-Time polímerase Chain reaction) e imunohistoquímica. Nossos dados mostram que a prática regular e precoce de atividade física melhora os quadros patológicos relacionados à obesidade apresentada pelos ratos MSG obesos. Os animais exercitados apresentaram uma diminuição da hipertrofia dos adipócitos, levando a uma alteração da expressão de adiponectina e do PPAR alfa, o que pode ter contribuído para uma melhora da homeostase energética nestes animais, entretanto foi demonstrado que o exercício não corrige completamente o perfil inflamatório neste modelo de obesidade. Pela primeira vez, foi demonstrado que o exercício não apresentou ação direta na potencialização da insulina pelo GLP-1, estimulada por níveis pré-prandiais de glicose, bem como não houve aumento na expressão desta incretina nos animais exercitados. O treinamento físico reduziu estes parâmetros apenas nos animais nos ratos CON-EXE. Independentemente da condição (jejum ou glicose) e atividade (exercitados ou sedentários), o tratamento com MSG não teve efeito na expressão de GLP-1 no íleo. A natação induziu uma redução no acúmulo de tecido adiposo e preservou a homeostase glicêmica em ratos MSG obesos, mais provavelmente por modular diretamente a ação insulinotrópica do GLP-1 ou sua resposta nas ilhotas pancreáticas. O treinamento físico inibiu a ação do GLP-1 na presença de menor concentração de glicose. Porém, o treinamento físico foi capaz de… Advisors/Committee Members: Sabrina Grassiolli, Giovani Marino Faveró, Henriettte Rosa de Oliveira Emilio, Viviane Nogoroto.

▼ 

Nosso laboratório mostrou que um único gene codifica um precursor protêico, cujo processamento gera o peptídeo natriurético tipo C (CNP) e uma variedade de peptídeos ricos em prolina, conhecidos como peptideos potenciadores da bradicinina ou BPPs. Com pequenas diferenças, esse precursor é expresso na glândula do veneno e na região neuro-endócrina do cérebro da Bothrops jararaca. Todos os produtos desse processamento têm como característica comum sua ação sob o sistema cardiovascular, levando à redução da pressão arterial e da frequência cardíaca. Esse fato intrigante levou-nos a questionar se esses diferentes peptídeos teriam mecanismo de ação semelhante. Surpreendentemente, esse trabalho mostrou que a resposta é negativa embora ainda não possamos explicar detalhadamente como cada um desses peptídeos atua no complexo mecanismo responsável pelo tônus vascular e pela frequência cardíaca. Historicamente, a demonstração de que os peptídeos potenciadores da bradicinina da Bothrops jararaca (Bj-BPPs) eram inibidores naturais da enzima conversora de angiotensina (ECA) teve ampla repercussão médica. Essa inibição parecia explicar a forte ação anti-hipertensiva desses peptídeos, dai servirem de modelo estrutural para o desenvolvimento de um inibidor sítio-dirigido, o Captopril, medicamento mundialmente utilizado para o tratamento da hipertensão arterial sistêmica humana. Contudo, recentes evidências experimentais sugerem que a atividade anti-hipertensiva dos Bj-BPPs não está relacionada somente com a inibição da ECA. Nosso grupo demonstrou para o Bj-BPP-10c que sua ação anti-hipertensiva se deve à ativação da geração de L-arginina, essencial para produção de óxido nítrico, potente vasodilatador, bem como pela regulação do barorreflexo arterial e pela sinalização de cálcio intracelular, ações que contribuem para a produção de NO em células endoteliais e neurais. Outros Bj-BPPs derivados do mesmo precursor foram aqui analizados. Demonstramos que o mecanismo de ação do Bj-BPP-5a envolve receptores B2 da bradicinina, o receptor muscarínico do subtipo M1 e a produção de NO. Curiosamente, o Bj-BPP-9a que serviu de modelo para a síntese do Captopril, parece atuar predominantemente como um clássico inibidor da ECA. O Bj-BPP-11e deve ter ação num receptor de membrana, assim explicando seus efeitos sobre parâmetros cardiovasculares. O mecanismo de ação do Bj-BPP-12b poderia ser explicado pela potenciação da BK e/ou pela inbição da ECA e do Bj-BPP-13a por ação em receptor muscarínico do subtipo M3 e sobre a ASS. Adicionalmente, o presente trabalho mostrou, pela primeira vez na área de toxinologia, que toxinas de serpentes já se valem do recurso bem conhecido na geração de hormônio-peptídeos em mamíferos, isto é, utilizam o processamento de uma poliproteina para gerarem peptídeos de ação sinérgica.

Our laboratory has shown that one gene codes for the protein precursor that yields the natriuretic peptide type C (CNP) after having been processed, along with a variety of proline-rich peptides, known as bradykinin-potentiating peptides or…

Advisors/Committee Members: Antonio Carlos Martins de Camargo, Paulo Lee Ho, Zuleica Bruno Fortes, Adriana Karaoglanovic Carmona.

▼ O ataque de fitopatógenos gera redução na quantidade e qualidade de importantes produtos agrícolas destinados ao mercado nacional e internacional. Agrotóxicos vêm sendo utilizados como forma de controlar esses agentes fitopatogênicos. Entretanto, além do custo financeiro, este tipo de prática é danoso ao meio ambiente e pode ser prejudicial à saúde. Uma alternativa para solucionar esses problemas é desenvolver variedades de plantas que apresentem resistência genética contra patógenos. Arabidopsis thaliana vem sendo utilizada como sistema modelo para estudos de fatores genéticos envolvidos na interação patógeno-hospedeiro. Este trabalho visou estudar a interação entre A. thaliana e um importante patógeno de brássicas responsável pela podridão-negra, a bactéria Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc). Numa primeira fase, trinta e três ecótipos de A. thaliana foram avaliados quanto a sua resposta ao isolado CNPH 17 de Xcc. Ainda que não tenha sido encontrada uma resistência absoluta, os ecótipos CS 1308, CS 1566 e CS 1643 crescidos em luz contínua apresentaram maior resistência em testes de infiltração foliar com 5 x 106 UFC/mL de suspensão bacteriana. Em contraste, os ecótipos CS 1194 e CS 1492 apresentaram uma maior suscetibilidade, exibindo fortes sintomas de clorose. Resultados similares foram obtidos quando os mesmos ecótipos foram crescidos em fotoperíodo de dias curtos. Para quantificar as diferenças no grau de sintomas da doença, clorofila total foi extraída dos ecótipos contrastantes em diferentes dias após a inoculação. Foi comprovado um menor declínio na quantidade de clorofila dos ecótipos considerados resistentes em comparação aos suscetíveis. Para testar a abrangência da resistência encontrada, os ecótipos CS 1308, CS 1566 e CS 1643, resistentes a Xcc CNPH 17 e o ecótipo CS 1438, com resistência intermediária, foram inoculados com o isolado de Xcc CNPH 77. Em todos os ecótipos houve maior severidade de sintomas a esse isolado. Entretanto, o ecótipo CS 1566 apresentou-se como resistente. Além disso, os ecótipos CS 1308, CS 1566 e CS 1643, resistentes ao isolado de Xcc CNPH 17 foram inoculados com um isolado de Ralstonia solanacearum (Rs CNPH 221). O ecótipo CS 1308 foi o mais resistente em relação aos ecótipos CS 1566 e CS 1643 que mostraram resistência intermediária a este isolado. Para iniciar testes que auxiliem no entendimento do mecanismo de resistência dos ecótipos CS 1308, CS 1566 e CS 1643 a Xcc CNPH 17, estes foram inoculados com uma concentração de 5 x 108 UFC/mL e o desenvolvimento de sintomas foi monitorado em 7, 24 e 48 h após a inoculação. Nenhum sintoma de reação de hipersensibilidade foi observado. Para viabilizar futuros estudos de crescimento bacteriano in planta é necessário utilizar meio seletivo livre de contaminantes. Por essa razão, a sensibilidade do isolado CNPH 17 a diferentes antibióticos foi testada. O isolado Xcc CNPH 17 apresentou sensibilidade a cloramfenicol, kanamicina, espectinomicina, estreptomicina, tetraciclina e rifampicina, nas concentrações testadas. Devido a… Advisors/Committee Members: Tatsuya Nagata, Betania Ferraz Quirino, Alice Maria Quezado Duval.

Criptografado. Advisors/Committee Members: Ricardo Luiz Smith, Luiz Eduardo Ribeiro do Valle, Eduardo Moacyr Krieger, Débora Rejane Fior Chadi, Charles Julian Lindsey.

▼ 

[pt] A aparição do HIV na década de 80 e de outros vírus presentes no sangue dos doadores, assim como a expansão de doenças como a hepatite C, tem estimulado as pesquisas para desenvolver substitutos do sangue. Pesquisas recentes têm sido realizadas em derivados artificiais da albumina de soro humano (human serum albumin - HSA) associados com heme, representando uma linha promissora nesse sentido. No presente trabalho, fazemos um estudo computacional da ligação do heme e de seu precursor, a protoporfirina IX, com a HSA, com o objetivo de conhecer os aminoácidos que contribuem à estabilidade da ligação, a natureza do sítio de ligação, a formação de possíveis sítios secundários de ligação e a influência das porfirinas na estrutura global da proteína. Para conseguir este objetivo ut ilizamos técnicas de cálculo quântico usando a Teoria do Funcional de Densidade, Docking Molecular e Dinâmica Molecular. Finalmente fazemos um estudo da correlação existente entre as diferentes regiões da HSA e de como este padrão muda na presença das porfirinas. Para este propósito usamos os coeficientes de correlação generalizada baseados na formulação de Kraskov. Com base nestas informações, discutimos a contribuição que poderiam fornecer nossos cálculos para a reengenharia do HSA, no sentido de fornecer- lhe características de hemoproteínas.

[en] The uprising of HIV and other viruses in the beginning of the 80s, as well as the expansion of other diseases like hepatitis C has stimulated research in order to develop blood substitutes. Research based on modified Human Serum Albumin associated with heme has shown a promissory line in this direction. In the present work we make a computational study about the heme and its precursor, the Protoporphyrin IX complexed with HSA, in order to know the contribution of the main amino acids to the stability of the binding, the character of the binding site, secondary binding sites formation, and the influence of the porphyrins in the global protein structure. To find this objective we use quantum calculations based on Functional Density Theory, Molecular Docking and Molecular Dynamics. Finally, a correlation study between different regions of HSA and the pattern modifications caused by the porphyrins were performed, using the generalized correlation coefficients based on the Kraskov formulation. We also discuss the contribution that our calculations could give to the reengineering of HSA, to provide them with hemeprotein characteristics.

Advisors/Committee Members: SONIA RENAUX WANDERLEY LOURO.