Introdução: A malária é um problema de saúde pública amplamente distribuída nas regiões tropicais e subtropicais no mundo. No Brasil, a doença ainda apresenta elevados números de casos, no qual o Plasmodium vivax (P. vivax) é responsável pela maior parte de diagnóstico. Nos últimos anos, esses casos vêm se apresentando de forma complicada, tornando-se este um motivo de preocupação, pois está espécie apresenta ampla distribuição geográfica, dessa maneira torna-se necessário o controle da infecção. Uma das alternativas para controle da infecção seria o desenvolvimento de uma vacina. No entanto, um dos grandes problemas para seu desenvolvimento é a incompreensão das respostas imunológicas contra os antígenos candidatos. Dentre os antígenos candidatos, a “proteína 1” de superfície do merozoíto (MSP-1) de Plasmodium tem se destacado, pois estudos demonstram que anticorpos contra as diferentes regiões de MSP-1 conferem proteção clínica em indivíduos que residem em áreas endêmicas. O objetivo desta trabalho foi caracterizar a resposta imune humoral contra antígenos recombinantes de regiões variavéis e conservada da PvMSP-1 em indivíduos que residem em áreas endemicas no estado do Amazonas. Material e métodos: Para tanto, foram produzidas três proteínas recombinantes, duas correspondente a região variável (bloco 2) e uma da conservada (bloco do ICB1) da PvMSP-1 (utilizando sequencias identificadas em trabalhadores anteriores, e selecionadas por bioinformática como os epítopos de células B). Tais proteínas foram expressas e purificadas utilizando genes sintéticos otimizados para expressão em Escherichia coli. A reatividade de soros de pacientes sintomáticos e assintomáticos contra estas proteínas, juntamente com a proteína ICB2-5 de PvMSP-1 (obtida em trabalhos anteriores), foi avaliada por ELISA indireto. Resultados e Conclusão: A expressão e purificação das proteínas recombinantes foram realizadas com êxito. A análise sorológica contra os antígenos recombinantes demonstrou maior nível de anticorpos contra a proteína ICB2-5 para ambas as aéreas (Rio Pardo e Manaus). Em relação à resposta de anticorpos IgG contra às três proteínas (P1, P2 e P3), foi observado que a proteína P2 foi a mais reconhecida nos soros de pacientes sintomáticos de Manaus e Rio Pardo, enquanto que a P3 foi a mais reconhecida nos assintomáticos. Em análise a resposta de subclasses observou-se que o IgG3 foi o mais prevalente contra ICB2-5. Em relação às três proteínas o nível de reatividade foi baixo para as subclasses, porém quando as frequências de soros respondedores IgG3 e IgG2 foram reunidas in silico(ICB2- 5+P1+P2+P3). Estas superaram os resultados nos níveis de reconhecimento da ICB2-5 sozinha, sugerindo que o desenvolvimento de um repertório de proteínas recombinantes correspondentes ao Bloco 2 é capaz de expandir o espectro de soros reagentes.

Introduction: Malaria is a public health issue distributed in tropical and subtropical regions worldwide. In Brazil, the disease still has a high number of cases in…

Desde que foram descobertos, os nanotubos de carbono têm despertado o interesse de muitos pesquisadores devido às suas propriedades físicas, químicas e eletrônicas que possibilitam sua aplicação nas mais diversas áreas de conhecimento, incluindo aplicações biomédicas. Os nanotubos de carbono podem ser utilizados como nanosensores e ser utilizado como sensor de detecção de patógenos. Contudo, para sua aplicação em imunoensaios é preciso que haja uma boa solubilização destes nanotubos de carbono. O problema para uma boa solubilização é a agregação de nanotubos de carbono que reduz as importantes propriedades desses materiais, propostas para um único nanotubo. Este trabalho buscou desenvolver nanotubos de carbono solúveis aplicáveis em sistemas de fluxo lateral. Para isso foram utilizadas proteínas recombinantes (“Proteína 2” rica em Histidina, HRP2) obtidos em trabalhos anteriores. Além disso, foi realizada a caracterização física dos nanotubos de carbono através das análises por espectroscopia Raman, espectroscopia de absorção na região do ultravioleta-visível (UV-Vis), espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIV). Sua capacidade de dispersão e funcionalização foi medida por citometria de fluxo. Este trabalho mostrou que esta metodologia de solubilização de nanotubos de carbono permite sua utilização em sistemas de fluxo lateral, o que o torna interessante não só pela detecção de antígenos maláricos demonstrados neste estudo, mas também por outras aplicações em métodos de detecção. Esta metodologia de solubilização de nanotubos de carbono torna estes materiais aplicáveis em imunoensaios, cromatografias e testes moleculares.

Since they were discovered, the carbon nanotubes have attracted the interest of many researchers due to their physical, chemical and electronic properties that allow its application in different areas of knowledge, including biomedical applications. Carbon nanotubes may be used as nanosensors and used as pathogens detection sensor. However, for application in immunoassays there must be a good solubilization of these carbon nanotubes. The problem for a good solubilization is aggregation of carbon nanotubes which reduces the important properties of these materials, proposals for a single nanotube. This study sought a method for solubilization of carbon nanotubes and their application in lateral flow systems. For this they used recombinant proteins ( "protein 2" rich in Histidine, HRP2) already obtained in previous work. In addition, the physical characteristics of carbon nanotubes was obtained through analysis by Raman spectroscopy, absorption spectroscopy in the ultraviolet-visible region (UV-Vis) spectroscopy in the infrared Fourier transform (FTIR) was performed. And its dispersion and functionalization was measured by flow cytometry. This work showed that methodology dispersion of carbon nanotubes allows their use in lateral flow systems. What makes it interesting not only for the detection of malarial antigens demonstrated in this study, but also for other…

Shigelose é uma disenteria bacilar causada pela Shigella, um patógeno Gram negativo e intracelular. Um dos modelos animais mais comuns para avaliar a resposta imune da Shigella é a infecção pulmonar em camundongos devido a fácil manipulação e similaridade com as respostas intestinais. Neste estudo, nós levantamos a hipótese de como cepas clínicas isoladas de pacientes com shigelose possuem expressão de resposta imune diferencial quando comparados com cepas padrões (M90T). Nossa principal proposta foi analisar quatro cepas de Shigella clínicas com diferentes genes de virulência e a cepa padrão M90T quanto as respostas imunes após invasão murina em 24 e 48h. Métodos: Cepas clínicas de Shigella foram selecionadas pela presença de genes de virulência específicos por PCR. Primers relacionados ao sistema imune foram desenvolvidos. As cepas clínicas e a padrão foram submetidas à análise de expressão gênica pelo Fluidigm (Bioamark Platform). Os resultados foram analisados em programa estatístico R. Resultados: Nós agrupamos os mRNA em cinco grupos: Pró Inflamatórios (CXCL15, IL-1β, IL-6, IFN-β, TNF-α), Anti Inflamatórios (TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3), Resposta Inata (NOD 1, NOD 2, TLR4 e TLR9), Resposta adaptativa (Th1-like, IFN- γ, IL-17A e IL-17B) e Macrófago (NOS, H2 -Aβ1, H2-Eβ, H2-K1, MHC-like 2). Como principais resultados, todas as amostras clínicas demonstraram uma expressão mRNA em 24h de infecção que foi gradativamente aumentado após 48h, enquanto a cepa padrão M90T teve a regulação oposta com taxas de mRNA em 48h, sugerindo grandes diferenças entre as respostas a cepas clínicas e a padrões bem caracterizados. A cepa clínica5 não alterou a expressão de mRNA em 24 e 48h nos genes da resposta adaptativa, sugerindo baixas taxas de invasão e controle do hospedeiro nas etapas iniciais da infecção. A cepa clínica #11 demonstrou alta atividade macrofágica devido a maior expressão de IFN-γ e NOS. A cepa #14 e #27 demonstraram um possível potencial de proteção Th1 devido a alta expressão mRNA para MHC-like II e Th1 quando comparado a outras cepas e o controle positivo. A presença de alta expressão de IL-17 na cepa #27 relação com células Th17. O potencial imunológico da cepa #27 pode ter relação com as enterotoxinas (shET1A, shET1B e shET2). A presença do conjunto completos destas enterotoxinas foi confirmado na cepa #27 por PCR. Conclusão: As diferenças entre cepas clínicas e padrões foram evidentes neste estudo. Cepa clínica 27 parece ser uma ótima candidata para estudos futuros e pode prover novas perspectivas para as diferenças de invasão e resposta imune vista nos hospitais.

Introduction: Shigellosis is a bacillary dysentery caused by Shigella, a gramnegative intracellular human pathogen. One of most common animal models to evaluate Shigella’s immune response is mice pulmonary infection due easy manipulation and similar gut responses. At this study, we have hypothesized how clinical strains isolated from Shigellosis patients had differential immune response expression when compared…

Devido as crescentes taxas de morbidade e mortalidade causada por Rotavírus humanos, métodos de detecção têm sido empregados rotineiramente em estudos clínicos epidemiológicos. O diagnóstico das infecções por Rotavírus baseia-se na detecção das partículas, antígenos ou RNA virais a partir de material fecal. O objetivo deste estudo foi desenvolver ferramentas de detecção das proteínas VP4 e VP6 para imunodiagnósticos de Rotavírus do tipo A. IgG de coelho e camundongos anti-VP4 e anti-VP6 foram obtidos a partir de imunizações feitas com as proteínas recombinantes VP4 e VP6 de Rotavírus A (ambas construídas neste estudo) e testados através de citometria de fluxo e western blot contra o antígeno recombinante e o antígeno nativo. A região da proteína VP4 selecionada para a geração de IgG de camundongo e coelho anti-VP4 foi eficiente para o reconhecimento do antígeno nativo em sua forma desnaturada, como foi possível observar nos ensaios de western blot. As análises de citometria demonstraram que os mesmos anti-VP4 gerados não foram específicos o suficiente para serem utilizados em técnicas onde a proteína VP4 está em sua forma nativa. As regiões selecionadas para a produção da proteína VP6 foram eficientes para a geração de anticorpos anti-VP6 capazes de reconhecer a proteína nativa em sua forma desnaturada e não desnaturada. Futuros trabalhos terão como objetivo o aumento da especificidade dos anticorpos obtidos de modo a permitir sua aplicação em um maior número de imunoensaios.

Due to rising rates of morbidity and mortality caused by human rotavirus, detection methods have been used routinely in clinical and epidemiological studies. The diagnosis of rotavirus infections is based on the detection of particles, antigens or viral RNA from the fecal material. This study aimed to develop the VP4 and VP6 protein detection tools for immunodiagnostic of Rotavirus group A. Rabbit and mice anti-VP4 and anti-VP6 IgGs were obtained from immunizations made with VP4 and VP6 recombinant proteins of Rotavirus A, both built in this study, and tested by flow cytometry and Western blot against the recombinant antigen and the native antigen. The region of the VP4 protein, selected for the generation of mice and rabbit anti-VP4 IgGs, was efficient to recognize native antigen in denatured form, as observed in western blot assays. The cytometry analysis demonstrated that generated anti-VP4 antibodies were not specific enough to be used in techniques where the VP4 protein is in its native form. Selected regions for production of VP6 protein have been efficient for the generation of anti-VP6 antibodies, able to recognize the native protein in its denatured and non-denatured form. Future studies will aim to increase the specificity of the antibodies obtained to allow their use in a greater number of immunoassays.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

A Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) tem sido causa frequente de muitos casos de diarreia no Brasil e no mundo, além de ser um dos principais agentes responsáveis pelas taxas de mortalidade entre as crianças de 0 a 5 anos de idade. A EPEC causa uma lesão histológica nas microvilosidades dos enterócitos caracterizada pela formação de uma ultraestrutura em forma de pedestal. Um dos fatores de patogenicidade responsável é o complexo BfpA (bundle forming pili). A BfpA promove a adesão das cepas de EPEC denominadas como típicas. Diferentemente, algumas cepas de EPEC são desprovidas do Fator de Aderência de Escherichia coli -EAF (EPECBfpA-) e tendem a provocar as lesões típicas de pedestal com mais lentidão e por isso são denominadas EPEC atípicas. Como a BfpA é uma proteína imunogênica e recentemente a incidência de EPECBfpA- atípicas vem aumentando, acredita-se que a lesão por estas bactérias ocorra por outras vias tornando importante o desenvolvimento de estratégias para sua identificação. Neste estudo várias sequências antigenicamente preditas foram usadas para sintetizar peptídeos a fim de produzir anticorpos policlonais anti-BfpA em camundongos BALB/c visando a identificação específica da EPEC típica. Para alcançar os objetivos, inicialmente ferramentas de bioinformática de proteínas e de predição de epítopos B foram utilizadas para mapeamento de regiões antigênicas específicas para EPEC. Peptídeos sintéticos foram adquiridos para a imunização de camundongos Balb/c, afim de que antissoros fossem avaliados quanto a especificidade à EPEC. Como resultados foi possível a construção e síntese de seis peptídeos lineares de BfpA (P1-P6). O peptídeo P6 foi selecionado como produto deste estudo devido a habilidade de induzir a produção de anticorpos contra esta proteína e este soro reconhecer a proteína nativa em cepas de EPEC típica. Acredita-se que a caracterização funcional destes anticorpos permita o desenvolvimento de ferramentas para o diagnóstico específico das duas linhagens de EPEC visando a contribuição para estudos futuros sobre o controle do processo fisiopatológico no intestino.

Escherichia coli (EPEC) was frequent cause of many cases of diarrhea in Brazil and around the world, and one of the main agents responsible for high mortality rates among children aged 0-5 years. EPEC is known to cause histological damage to the microvilli of enterocytes, characterized by the formation of a shaped support ultrastructure. One of the factors responsible for pathogenicity is complex BFP (bundle forming pili). The presence of genes BfpA promotes adhesion and consequently the injury of EPEC strains characterized as typical. Differently, some EPEC strains lack EAF (EPECBfpA-) causing lesions shaped as pedestal, but more slowly, called atypical EPEC. BfpA is known as immunogenic and recently the incidence of atypical (EPECBfpA-) is increasing, it is believed that these bacteria injury occurs through other means making it important to develop strategies for identifying. In this study several predicted peptide…

As doen?as infecciosas continuam sendo um grande problema de sa?de no mundo, fazendo parte de maneira significativa dos dados de morbimortalidade. O reconhecimento precoce destas enfermidades, atrav?s do uso de testes para diagn?stico r?pidos e precisos, agilizam o tratamento do paciente, permitindo assim um melhor atendimento cl?nico. A mal?ria e a febre do v?rus Zika (ZIKV) s?o doen?as infecciosas t?picas das regi?es tropicais do mundo, como a Amaz?nia brasileira. As ferramentas tradicionais para identifica??o dessas doen?as possuem desvantagens que limitam a detec??o, como baixa especificidade e sensibilidade. Logo, a busca de novos m?todos capazes de superar estas dificuldades vem sendo almejada por muitos grupos de pesquisa p?blicos e privados. Neste campo, o sistema CRISPR-Cas vem ganhando destaque nos ?ltimos 5 anos, contribuindo para importantes avan?os no desenvolvimento de t?cnicas para detec??o precisa de alvos moleculares. O objetivo geral deste trabalho foi realizar a express?o e purifica??o da prote?na do sistema CRISPR-Cas13a, chamada LwCas13a, assim como validar sua atividade enzim?tica aplicando ferramentas para o diagn?stico de mal?ria causada por Plasmodium vivax e para Zika v?rus. Como resultados, obtivemos com sucesso a express?o e purifica??o da prote?na recombinante LwCas13a, produ??o de CRISPR RNA (crRNA) e de RNA alvo sint?tico (ssRNA) espec?ficos para Plasmodium vivax e ZIKV. Quais observamos reatividade da enzima LwCas31a com uma eleva??o da intensidade de fluoresc?ncia ? medida que se aumentava as concentra??es de ssRNA no sistema. Uma rela??o inversamente proporcional foi observada quando dsDNA foi utilizado. As amostras cl?nicas de pacientes infectados com ZIKV apresentaram reatividade positiva utilizando o m?todo descrito. N?o foram obtidos resultados satisfat?rios para o diagn?stico de mal?ria por P. vivax utilizando as ferramentas produzidas. Trabalhos futuros ser?o aplicadas as ferramentas produzidas a um N amostral maior de pacientes infectados por ZIKV e novos alvos moleculares que permitam a detec??o eficiente Plasmodium vivax utilizando o sistema CRISPR-Cas13a.

Infectious diseases remain a major health problem in the world, making a significant part of the morbidity and mortality data. The early recognition of these diseases, through the use of rapid and accurate diagnostic tests, speeds up the treatment of the patient, thus allowing for better clinical care. Malaria and Zika virus fever (ZIKV) are infectious diseases typical of tropical regions of the world, such as the Brazilian Amazon. Traditional tools for identifying these diseases have disadvantages that limit detection, such as low specificity and sensitivity. Therefore, the search for new methods capable of overcoming these difficulties has been pursued by many public and private research groups. In this field, the CRISPR-Cas system has been gaining prominence in the last 5 years, contributing to important advances in the development of techniques for the accurate detection of molecular targets. The general objective…

Shigella é o patógeno Gram-negativo que causa a disenteria aguda, acometendo principalmente crianças menores de cinco anos de idade em países de baixa e média renda, ocasionando milhares de óbitos por ano. Em decorrência disso, diversos estudioso tem se empenhado com a busca por uma alternativa eficaz e segura, principalmente pela falta de uma vacina eficaz e a disseminação de cepas multirresistentes. O peptídeo P9 (FimH) de Shigella flexneri foi utilizado neste estudo, para imunizar galiformes Gallus galus Dekalb White afim de produzir e avaliar IgY (Imunoglobulina Y). A IgY anti-P9 obtida e isolada por métodos de precipitação com polietilenoglicol e cromatografia de afinidade, foi avaliada quanto a sua reatividade pelas técnicas imunológicas Dot blot, Western blot e Citometria de fluxo. IgY anti-P9 foi capaz de reconhecer o antígeno-alvo na forma sintética, denatura e nativa de Shigella flexneri 5a M90T. O anticorpo obtido apresentou reatividade cruzada contra outras cepas de bactérias diarreiogênicas, não podendo este ser utilizado para utilização em métodos de imunodiagnóstico. Por outro lado, estes anticorpos possuem grande potencial para utilização em métodos de imunidade passiva contra Shigella spp., e possivelmente servir de base para ampliação na aplicação contra outras doenças.

Shigella is the Gram-negative pathogen that causes acute dysentery, affecting mainly children under five years of age in low- and middle-income countries, causing thousands of deaths per year. As a result, several scholars have been working to search for an effective and safe alternative, mainly due to the lack of an effective vaccine and the spread of multiresistant strains. The peptide P9 (FimH) from Shigella flexneri was used in this study to immunize Gallus galus Dekalb White galiform to produce and evaluate IgY (Immunoglobulin Y). Anti-P9 IgY obtained and isolated by polyethyleneglycol precipitation methods and affinity chromatography was evaluated for its reactivity by the immunological techniques Dot blot, Western blot and Flow cytometry. IgY antiP9 was able to recognize the target antigen in the synthetic, denatured and native form of Shigella flexneri 5a M90T. The antibody obtained showed cross-reactivity against other strains of diarrheogenic bacteria, which can not be used for immunodiagnostic methods. On the other hand, these antibodies have great potential for use in passive immunity methods against Shigella spp.,And possibly serve as a basis for application enhancement against other diseases.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Bacillus subtilis é uma bactéria Gram-positiva, não patogênica, que recebeu o status GRAS (Generally Regarded As Safe) pelo FDA Americano. Quando exposta à situação adversa o B. subtilis produz um tipo de célula morfologicamente distinta, denominada de esporo. Pesquisas têm destacado o potencial do uso de esporos como delivery vacinal, sendo estes capazes de estimular respostas imunes sistêmicas e localizadas, promovendo ainda elevação da resposta humoral quando coadministrado com antígenos acoplados ou integrados à superfície dos esporos. Atualmente, ainda não há uma vacina eficaz para o combate à malária e dentre os antígenos estudados, a proteína Pf-MSP1-19 de Plasmodium falciparum se mostra um dos mais promissores e elucidados candidatos vacinais. Diante do exposto, este trabalho teve como objetivo principal avaliar a resposta imune frente ao antígeno rPf-MSP1-19 de Plasmodium falciparum, presente na superfície dos esporos de Bacillus subtillis. Materiais e métodos: Para isso, foram realizados separação por renografina e quantificação por citometria de fluxo dos esporos de Bacillus subtillis recombinados com rPf-MSP1-19 e esporos Wild Type (WT), seguido pelo acoplamento químico da rPf-MSP1-19 à superfície dos esporos WT autoclavados. Com as ferramentas produzidas, camundongos Balb/c foram imunizados via oral e intraperitoneal e os soros obtidos avaliados por ELISA indireto. Resultados: Neste trabalho o acoplamento químico utilizando EDC e NHS se mostrou o melhor método para adsorção da proteína rPf-MSP1-19 à superfície de esporos. Uma nova abordagem para quantificação de esporos foi aplicada usando Citometria de Fluxo e Beads Trucount™ demonstrando maior potencial de eficiência e sensibilidade. Foi observado que houve a degradação da proteína rPfMSP1-19 quando expressa diretamente na superfície do esporo, pelo método recombinante. Quanto as imunizações orais, não foi possível obter resposta imune frente ao antígeno acoplados aos esporos quimicamente e nem a Bacillus subtillis recombinante. Entretanto as imunizações intraperitoneais induziram níveis elevados de IgG anti- rPf-MSP1-19 no grupo imunizado com rPf-MSP1-19 acoplada à superfície dos esporos WT autoclavados semelhante ao controle positivo. Sugerindo o uso de esporos de B. subtilis Wild Type autoclavados como alternativa de delivery e de adjuvante de antígenos para imunizações com fins experimentais, podendo no futuro ser aplicado em imunizações em humanos.

Bacillus subtilis is a Gram-positive, non-pathogenic bacterium that receive the status GRAS (Generally Regarded As Safe) by the American FDA. When exposed to the adverse situation B. subtilis produces a morphologically distinct cell type, called the spore. Research has highlighted the potential of use spores as vaccines delivery, which are capable of stimulate systemic and localized immune responses, promoting the elevation of humoral response when coadministered with antigens coupled or integrated to the surface of spores. Currently, there is still no effective vaccine to combat malaria and among…

A malária continua sendo um sério problema de saúde pública amplamente distribuída nas regiões tropicais e subtropicais no mundo. No Brasil, a doença ainda apresenta elevado número de ocorrências, no qual o Plasmodium vivax (P. vivax) é responsável pela maioria dos casos. Uma das principais maneiras de controle desta enfermidade está ligada ao seu diagnóstico correto logo nos estágios iniciais, o que o método diagnóstico por microscopia, ainda considerado “padrão ouro”, muitas vezes não é capaz de proporcionar. Isso demonstra a necessidade de produção e distribuição de testes de diagnóstico que não dependam de muitos equipamentos e profissionais qualificados, e que sejam capazes de fornecer resultados rápidos e acurados, mesmo em regiões remotas. Portanto, o presente trabalho promoveu o desenho de peptídeos sintéticos contra regiões específicas da proteína Lactato Desidrogenase de Plasmodium (pLDH) e a imunização de camundongos para obtenção de anticorpos policlonais contra estes, dos quais apenas dois deles tiveram resposta de anticorpos específicos satisfatória. O reconhecimento destes anticorpos à proteína nativa de LDH de Plasmodium vivax foram confirmados através de imunofluorescência. Estudos futuros são necessários para confirmar a especificidade dos anticorpos, para serem avaliados com marcadores de infecções de malária que possam compor um kit de diagnóstico nacional de malária.

Malaria remains a serious public health problem widely distributed in the tropical and subtropical regions of the world. In Brazil, the disease still presents high numbers of cases, in which Plasmodium vivax (P. vivax) is responsible for most cases. One of the main ways of controlling this disease is linked to its correct diagnosis in the early stages, which the diagnostic method still considered "gold standard" is often not able to provide. This demonstrates the need to produce and distribute diagnostic tests which are not dependent on equipments and/or skilled professionals and are capable of delivering fast and accurate results even in remote regions. Therefore, the present study promoted the design and synthesis of peptides against specific regions of Plasmodium Lactate Dehydrogenase (pLDH) protein to obtain polyclonal antibodies through immunization of mice to obtain polyclonal antibodies against them, which only two of them have satisfactory specific antibody responses. The recognition of these antibodies to the native LDH protein of Plasmodium vivax have been confirmed by immunofluorescence. More studies are needed to confirm the specificity of the antibodies to be evaluated with markers of malaria infections that may constitute a national malaria diagnostic kit.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

A leishmaniose é uma doença tropical infecto-parasitária negligenciada mundialmente, acometendo quase 110 mil indivíduos no Brasil nos últimos 5 anos. Na região do município de Manaus-AM, são registrados a maioria dos casos de Leishmaniose Cutânea (LC) tendo como principal agente etiológico a Leishmania guyanensis. O Transcrito 1 Associado ao HLA-B (BAT1) regula a inflamação modulando a expressão de citocinas pró-inflamatórias desempenhando um papel protetor em várias desordens imunopatológicas. Dessa forma o objetivo deste estudo foi determinar a influência de polimorfismos existentes na região promotora do gene BAT1 na clínica de pacientes com LC com um modelo de estudo caso-controle. Além disso, concentrações séricas da citocina Fator de Necrose Tumoral (TNF) - alfa, em cada população, foram correlacionadas com os polimorfismos encontrados na tentativa de identificar sub-fenótipos em pacientes com LC com base no estudo de marcadores moleculares no gene BAT1. Para o estudo molecular, foram realizadas amplificações pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) convencional na região promotora do gene BAT1 e estes purificados pela metodologia ExoSAP-IT™ PCR Product Cleanup Reagent-Thermofisher, com posterior sequenciamento pelo método de terminação descrita por Sanger. Nossos resultados se basearam numa população de 516 indivíduos divididos em 267 casos e 249 controles, dos quais 79,7% e 68,7%, respectivamente, eram do gênero masculino. A faixa etária mais frequente foi de 19 a 39 anos. Os SNPs -22 (rs2239527) e -348 (rs2239528) foram os mais frequentes na população de estudo, incluindo pela primeira vez na literatura, o SNP -277. As frequências encontradas dos SNPs -22 e -348 foram bem semelhantes entre casos (31,15% / 4,28%) e controles (25,78% / 6,91%), respectivamente, não havendo associação destes entre as duas populações. Os níveis séricos de TNF-alfa foram mais elevados nos casos e independente do gênero (p<0,001). Além disso, níveis elevados significativos envolveram os portadores dos SNPs -22 e -348 apenas quando eram casos e não entre pessoas saudáveis. Níveis séricos de TNF foram elevados proporcionalmente na presença dos polimorfismos, e quase duas vezes mais elevados naqueles homozigotos casos (52,19 ± 18,43) do que homozigotos controles (32,15 ± 29,74) (p<0,001). Importante destacar níveis séricos de TNF mais elevados estiveram associados ao SNP -348 (72,89 ± 49,33) em casos do que em -22 (41,13 ± 22,16) no mesmo grupo. Além do mais, quando concomitantemente encontrados na mesma amostra, os SNPs -22 e -348 elevaram ainda mais a expressão dos níveis séricos de TNF. Nossos resultados reforçam o papel do BAT1 a partir de evidencias de que a presença do polimorfismo afeta indiretamente a expressão de TNF. Dessa forma acreditamos que isto pode influenciar no desfecho e manifestação clínica do paciente com Leishmaniose, principalmente na apresentação das lesões cutâneas, uma vez que existe uma correlação entre diâmetro da lesão na LC e frequência de produção de citocinas inflamatórias.

Leishmaniasis…

Introdução: Mesmo a diarreia sendo considerada uma das principais causas de mortalidade em pacientes com HIV, nosso estudo demonstrou um perfil diferente, apresentando altas incidências de constipação intestinal. A alta frequência de bactérias entéricas com potencial patogênico e a presença do marcador inflamatório sCD14 nestes individuos, demonstrou um possível processo de translocação microbiana e disbiose, sendo este cenário responsável por promover um estado de inflamação constante, o que induz a rápida progressão clinica da AIDS. Portanto, neste estudo procuramos verificar a ocorrência de co-infecções bacterianas, com potencial patogênico, e avaliar marcadores imunológicos de inflamação como preditores de translocação microbiana e ativação crônica, em pacientes com HIV/AIDS em Manaus. Metodologia e Resultados: Foram avaliados 52 pacientes com HIV, cadastrados na Fundação de Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado, distribuídos quanto sua carga viral (</ou> 500 cópias de RNA e </ou> 200 CD4+ mm3). Para a identificação dos agentes etiológicos associados à diarreia foi realizado o isolamento por metodologia clássica, onde constatamos uma frequência de (38,46%) de Escherichia coli, seguido de Klebsiella spp. e Pseudomonas spp. (15,38%) respectivamente e em menor frequência Salmonella (3,84%) e Shigella (1,92%). Os isolados de Escherihia coli e Klebsiella, foram submetidos a técnica de PCR para verificação dos genes de virulência e resistência sendo obtidas amplificações para os genes eae, uidA, ast1 e dAAe (E.coli) e Kvar, blaCTX-M, blaKPC, blaVIM e blaIMP (Klebsiella spp). A avaliação de resistência a antimicrobianos foi realizada por teste de difusão em disco, onde foi observado que a maioria dos isolados testados foram resistentes ao antimicrobianos da classe das Cefalosporinas, o ensaio celular para a verificação dos fenótipos de adesão em Eschrichia coli detectou maior frequência de adesão difusa (55%) seguido de um fenótipo de adesão atípica (20%), para os isolado de Klebsiella spp. verificouse maior frequência de adesão agregativa (12,5%), ensaio de biofilme constatou que os isolados de Klebsiella spp e Pseudomonas spp. apresentavam potencial alto para produção do mesmo. A inflamação crônica foi avaliada pela dosagem de citocinas por citometria de fluxo onde foram observadas diferenças significativas entre os níveis de TNFα quando comparados os grupos entre si, com destaque para o grupo 1 e 3 (p= 0.001). A avaliação da translocação de produtos microbianos pela busca do marcador CD14 solúvel plasmáticos de ELISA demonstrou diferenças significativas em todos os grupos avaliados quando comparados aos contoles Grupo 1: 4953±4570; Grupo2: 582±1983; Grupo 3: 3396±4240; Grupo 4: 3769±4752. Conclusão: Por fim, a presença de patógenos bacterianos na flora de pessoas com HIV bem como a presença de marcadores de inflamação plasmáticos, podem indicar fatores de piora do quadro geral de saúde, bem como a cronicidade de estados inflamatórios.

Even though diarrhea was considered a major…

A dengue é considerada uma das mais importantes arboviroses que atingem o homem. No Brasil, em 2017, foram notificados 252.054 casos prováveis de dengue, dos quais somente no Amazonas foram registrados quase 4 mil casos da doença. A detecção do antígeno NS1 é hoje uma importante ferramenta no diagnóstico rápido da dengue, no entanto, estudos mostram que fatores como sorotipo circulante, região geográfica dos pacientes e infecções secundárias podem estar relacionados com a diminuição da sensibilidade do teste quando comparado com os métodos moleculares. Portanto, com o intuito de avaliar possíveis mutações que possam estar associadas à dispersão da dengue no Amazonas, bem como a falha na detecção do antígeno NS1, realizamos este estudo de evolução do sorotipo/genótipo do vírus do dengue predominante no período de 2011 a 2016 nos municípios do interior e na capital do estado. Ao todo foram analisadas 608 amostras de soro de pacientes com suspeita de dengue coletados em 26 municípios do Amazonas. As amostras foram submetidas à extração de RNA viral e posteriormente ao método de PCR em tempo real, no qual 181 (29,7%) amostras tiveram resultado positivo. Posteriormente utilizando um protocolo de semi-nested PCR, observamos o predomínio de DENV-4 (N=80), seguido de DENV-2 (N=9) e DENV-1 (N=7). Para os sorotipos de DENV-1 e 2 foram conduzidas reações de PCR convencional e sequenciamento somente para a região do ENV, enquanto que para DENV-4 foi realizado também o sequenciamento da região codificadora para NS1. As análises filogenéticas seguiram de acordo com o método de máxima verossimilhança (ML) no programa PhyML, utilizando o modelo escolhido com a ajuda do programa jModeltest v2.1.7 e por Inferência Bayesiana utilizando o programa BEAST v1.8.4. Foram obtidas 27 sequências completas de ENV e 25 de NS1 de DENV-4, provenientes de sete municípios do Amazonas, todas pertencentes ao genótipo II. As sequências de DENV-1 (2016) e DENV-2 (2011) coletadas em Manaus pertenciam ao genótipo V e Asiático/Americano, respectivamente. Durante a análise das sequências de ENV de DENV-4 foram encontrados 140 sítios variáveis e oito trocas de aminoácido, já nas sequências NS1 foram observados 91 sítios variáveis e sete trocas de aminoácidos. De acordo com a análise filogeográfica ocorreram pelo menos duas introduções independentes do DENV-4 no estado do Amazonas. Além disso, nossos dados também mostraram a propagação do DENV-4 a partir de Manaus para os outros municípios dentro do estado do Amazonas. Nos testes de soroprevalência, 45% (164/360) das amostras foram reagentes para detecção de IgG, não sendo observado diferença significativa entre as amostras NS1-Positivas (43,9%) e NS1-Negativas (47,2%). Acreditamos que este estudo tenha importante papel na vigilância arboviral no estado do Amazonas, relatando não apenas os sorotipos e genótipos de DENV de diferentes municípios, mas também como se deu a disseminação do DENV-4 GII no Estado.

Dengue is considered one of the most important arboviruses that affects man. In Brazil, in 2017,…

A anaplasmose bovina é uma enfermidade causada por uma rickettsia denominada Anaplasma marginale (A. marginale) transmitida por carrapatos e a doença se caracteriza por anemias, febre, perda de peso, diminuição da produção de leite, aborto e morte nos animais. A doença causa perdas econômicas na produção de gado e por isso estratégias para o desenvolvimento de vacinas é imprescindível para minimizar seu impacto. Neste estudo uma proteína recombinante de A.marginale foi produzida a partir de uma estratégia inovadora de utilizar DNA sintetico para codificar os epítopos dos principais antígenos de A.marginale. Após a clonagem em pGEM e subclonagem em pHT43, a proteína quimérica foi expressa em Escherichia coli contendo epítopos dos antigenos OMP7/9 (outer membrane protein 7/9) e MSP1a (major surface protein 1a). A antigenicidade foi comprovada pela reatividade da proteina recombinante com soro de bezerro com anaplasmose, e a imunogenicidade e proteção vacinal foi comprovada em camundongos Balb/c. Com uma fórmula composta com adjuvante oleoso (MSP1a/OMP7/9+ISA), animais receberam três (3) doses vacinais e desafiados com 3x105cel/mL de A. marginale UFMG2. Os animais imunizados não apresentaram variação de peso corporal nem sinais clínicos da doença, porém houve redução significativa da carga bacterêmica nos vacinados (p<0,0008) comparados com grupos placebos. Além disso, não houve alterações hematológicas como aumento no número de monócitos (p<0,005), neutrófilos (p<0,05) e leucocitose (p<0,05), verificadas nos controles infectados. As avaliações deste trabalho demonstraram a importância da proteína recombinante MSP1a/OMP7/9 na melhoria da resposta imunológica de Balb/c e sua potencial aplicabilidade na produção de vacinas recombinantes.

The bovine anaplasmosis is a disease characterized by severe anemia, fever, weight loss, decreased milk production, abortion and death in the animals. It is caused by A. marginale and transmitted by ticks, leading severe economic losses in cattle production and hence strategies for developing vaccines are essential to minimize its impact. In this study, a chimeric protein was produced by synthetic DNA, carrying sequences of predicted epitopes from OMP7, OMP9 and MSP1a, and used as vaccine emulsified with ISA adjuvant. After three doses, Balb/c mice were challenged with 3x105cel/mL A. marginale UFMG2 to assess proctetion of compound MSP1a/OMP7/9+ISA. There were not body weight alterations neither clinical signs were observed in immunized mice. Bacteremia count showed drastic reduction and discrete alteration on erythrocyte morphology (spherocytes) in vaccined mice 56th day after challenge. No alteration was observed in hematologic data in relation to infected control mice. The evaluation obtained in this study showed the importance of the MSP1a /OMP7/9 protein in the immune response of the Balb/c and your applicability potential in the recombinant vaccine production.

Não informada

O Zika virus (ZIKV) é um arbovírus emergente da família Flaviviridae e do gênero Flavivirus, que até 2007 estava restrito a alguns casos de doença leve na África e na Ásia. No Brasil, suspeita-se que a entrada do vírus tenha se dado durante a Copa das Confederações de 2013 e no primeiro semestre de 2015, já havia casos confirmados em estados de todas as regiões do país. A epidemia brasileira revelou que a infecção geralmente leve e autolimitada poderia estar relacionada à distúrbios neurológicos. Os objetivos deste trabalho era esclarecer inúmeros questionamentos existentes em relação à infecção pelo ZIKV, visando contribuir com uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na imunopatogênese e curso da doença. Como resultados, descreveu-se o primeiro relato de fibrilação atrial em pacientes com Zika, podendo ser considerado uma manifestação atípica durante a infecção pelo vírus; observou-se elevação de citocinas pró-inflamatórias durante a infecção ZIKV; identificou-se a quimiocina CXCL10 como um biomarcador potencial de infecção; caracterizou-se a saliva como fluído de escolha para o detecção do vírus Zika na fase aguda da doença e, montouse um modelo de regressão logística para a classificação de casos de zika em relação à dengue, com base na avaliação clínica.

Zika virus (ZIKV) is an emergent arbovirus of the family Flaviviridae and the genus Flavivirus, which until 2007 was restricted to some cases of mild disease in Africa and Asia. In Brazil, it`s suspected that the entry of the virus occurred during the 2013 Confederations Cup and in the first half of 2015, there were already confirmed cases in states in all regions of the country. The Brazilian epidemic revealed that the usually mild and self-limiting infection could be related to neurological disorders. The objectives of this study were to clarify numerous questions regarding ZIKV infection, aiming to contribute to a better understanding of the mechanisms involved in the immunopathogenesis and course of the disease. As a result, the first report of atrial fibrillation in patients with Zika was described and could be considered an atypical manifestation during the virus infection; elevation of proinflammatory cytokines during ZIKV infection was observed; CXCL10 chemokine was identified as a potential biomarker for infection; saliva was characterized as the fluid of choice for the detection of Zika virus in the acute phase of the disease and a logistic regression model for the classification of cases of zika in relation to dengue was set up based on the clinical evaluation.