A malária é um dos mais sérios problemas de saúde pública do mundo, sendo responsável por elevada morbidade e mortalidade. O diagnóstico mais utilizado continua sendo a microscopia, contudo esta metodologia exige infraestrutura adequada e profissionais altamente qualificados para a realização dos exames, tornando-se inviável em áreas de difícil acesso. Testes para o diagnóstico rápido e simples de malária estão disponíveis no mercado, porém nenhum de origem nacional, dificultando a implantação pelo Sistema Único de Saúde (SUS). Diante desta problemática, o presente estudo tem como principal objetivo a produção de Lactato Desidrogenase de Plasmodium vivax (pvLDH), visando o desenvolvimento de anticorpo os policlonais anti-LDH capazes de detectar o antígeno nativo em amostras sanguíneas de pacientes infectados com a pretensão de oferecer perspectivas para a elaboração de um teste diagnóstico rápido para a Malária. Para isto, a proteína pvLDH foi produzida pela tecnologia do DNA recombinante em células hospedeiras quimicamente competentes. Logo, a proteína foi purificada para a imunização de coelho e camundongos Balb/c. A resposta dos animais as inoculações assim como o desempenho dos anticorpos policlonais anti-LDH no reconhecimento do antígeno nativo foram avaliados por ensaios imunoenzimáticos ELISA indireto e em sistema sanduíche, respectivamente. Os animais demonstraram boa resposta de anticorpos anti-pvLDH após a terceira imunização de proteína recombinante, sendo a resposta de anticorpos do coelho superior a resposta dos camundongos, com valores de absorbância de até 2.600 e 2.100, respectivamente. Os anticorpos policlonais anti-pvLDH foram capazes de reconhecer a proteína LDH nativa em 131 amostras de 154 amostras positivas para malária e incapazes de reconhecer isoformas de LDH humana quando avaliados em relação a amostras negativas para malária, uma vez que das 24 amostras negativas avaliadas, todas se mantiveram também negativas nos ensaios. A proposta idealizada neste trabalho se mostrou extremamente viável e promissora. Os resultados obtidos neste estudo corresponderam às expectativas e forneceram perspectivas futuras no que diz respeito à utilização da pvLDH recombinante para a produção de anticorpos policlonais e monoclonais funcionais, em modelo murino, para a utilização em teste diagnóstico rápido (TDR) para a malária, na tentativa de oferecer alternativas ao diagnóstico no Brasil, ou para a utilização em imunoensaio visando o monitoramento do curso da doença.

Malaria is one of the most serious public health problems in the world, accounting for high morbidity and mortality. The diagnosis remains the most widely used microscopy, however this approach requires adequate infrastructure and highly skilled professionals for the exams, making it unfeasible in areas of difficult access. Tests for the rapid and simple diagnosis of malaria are commercially available, but none of national origin, complicating the deployment by the Unified Health System (SUS). Faced with this problem, this study has as main…

Introdução: A malária é um problema de saúde pública amplamente distribuída nas regiões tropicais e subtropicais no mundo. No Brasil, a doença ainda apresenta elevados números de casos, no qual o Plasmodium vivax (P. vivax) é responsável pela maior parte de diagnóstico. Nos últimos anos, esses casos vêm se apresentando de forma complicada, tornando-se este um motivo de preocupação, pois está espécie apresenta ampla distribuição geográfica, dessa maneira torna-se necessário o controle da infecção. Uma das alternativas para controle da infecção seria o desenvolvimento de uma vacina. No entanto, um dos grandes problemas para seu desenvolvimento é a incompreensão das respostas imunológicas contra os antígenos candidatos. Dentre os antígenos candidatos, a “proteína 1” de superfície do merozoíto (MSP-1) de Plasmodium tem se destacado, pois estudos demonstram que anticorpos contra as diferentes regiões de MSP-1 conferem proteção clínica em indivíduos que residem em áreas endêmicas. O objetivo desta trabalho foi caracterizar a resposta imune humoral contra antígenos recombinantes de regiões variavéis e conservada da PvMSP-1 em indivíduos que residem em áreas endemicas no estado do Amazonas. Material e métodos: Para tanto, foram produzidas três proteínas recombinantes, duas correspondente a região variável (bloco 2) e uma da conservada (bloco do ICB1) da PvMSP-1 (utilizando sequencias identificadas em trabalhadores anteriores, e selecionadas por bioinformática como os epítopos de células B). Tais proteínas foram expressas e purificadas utilizando genes sintéticos otimizados para expressão em Escherichia coli. A reatividade de soros de pacientes sintomáticos e assintomáticos contra estas proteínas, juntamente com a proteína ICB2-5 de PvMSP-1 (obtida em trabalhos anteriores), foi avaliada por ELISA indireto. Resultados e Conclusão: A expressão e purificação das proteínas recombinantes foram realizadas com êxito. A análise sorológica contra os antígenos recombinantes demonstrou maior nível de anticorpos contra a proteína ICB2-5 para ambas as aéreas (Rio Pardo e Manaus). Em relação à resposta de anticorpos IgG contra às três proteínas (P1, P2 e P3), foi observado que a proteína P2 foi a mais reconhecida nos soros de pacientes sintomáticos de Manaus e Rio Pardo, enquanto que a P3 foi a mais reconhecida nos assintomáticos. Em análise a resposta de subclasses observou-se que o IgG3 foi o mais prevalente contra ICB2-5. Em relação às três proteínas o nível de reatividade foi baixo para as subclasses, porém quando as frequências de soros respondedores IgG3 e IgG2 foram reunidas in silico(ICB2- 5+P1+P2+P3). Estas superaram os resultados nos níveis de reconhecimento da ICB2-5 sozinha, sugerindo que o desenvolvimento de um repertório de proteínas recombinantes correspondentes ao Bloco 2 é capaz de expandir o espectro de soros reagentes.

Introduction: Malaria is a public health issue distributed in tropical and subtropical regions worldwide. In Brazil, the disease still has a high number of cases in…

Desde que foram descobertos, os nanotubos de carbono têm despertado o interesse de muitos pesquisadores devido às suas propriedades físicas, químicas e eletrônicas que possibilitam sua aplicação nas mais diversas áreas de conhecimento, incluindo aplicações biomédicas. Os nanotubos de carbono podem ser utilizados como nanosensores e ser utilizado como sensor de detecção de patógenos. Contudo, para sua aplicação em imunoensaios é preciso que haja uma boa solubilização destes nanotubos de carbono. O problema para uma boa solubilização é a agregação de nanotubos de carbono que reduz as importantes propriedades desses materiais, propostas para um único nanotubo. Este trabalho buscou desenvolver nanotubos de carbono solúveis aplicáveis em sistemas de fluxo lateral. Para isso foram utilizadas proteínas recombinantes (“Proteína 2” rica em Histidina, HRP2) obtidos em trabalhos anteriores. Além disso, foi realizada a caracterização física dos nanotubos de carbono através das análises por espectroscopia Raman, espectroscopia de absorção na região do ultravioleta-visível (UV-Vis), espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIV). Sua capacidade de dispersão e funcionalização foi medida por citometria de fluxo. Este trabalho mostrou que esta metodologia de solubilização de nanotubos de carbono permite sua utilização em sistemas de fluxo lateral, o que o torna interessante não só pela detecção de antígenos maláricos demonstrados neste estudo, mas também por outras aplicações em métodos de detecção. Esta metodologia de solubilização de nanotubos de carbono torna estes materiais aplicáveis em imunoensaios, cromatografias e testes moleculares.

Since they were discovered, the carbon nanotubes have attracted the interest of many researchers due to their physical, chemical and electronic properties that allow its application in different areas of knowledge, including biomedical applications. Carbon nanotubes may be used as nanosensors and used as pathogens detection sensor. However, for application in immunoassays there must be a good solubilization of these carbon nanotubes. The problem for a good solubilization is aggregation of carbon nanotubes which reduces the important properties of these materials, proposals for a single nanotube. This study sought a method for solubilization of carbon nanotubes and their application in lateral flow systems. For this they used recombinant proteins ( "protein 2" rich in Histidine, HRP2) already obtained in previous work. In addition, the physical characteristics of carbon nanotubes was obtained through analysis by Raman spectroscopy, absorption spectroscopy in the ultraviolet-visible region (UV-Vis) spectroscopy in the infrared Fourier transform (FTIR) was performed. And its dispersion and functionalization was measured by flow cytometry. This work showed that methodology dispersion of carbon nanotubes allows their use in lateral flow systems. What makes it interesting not only for the detection of malarial antigens demonstrated in this study, but also for other…

Shigelose é uma disenteria bacilar causada pela Shigella, um patógeno Gram negativo e intracelular. Um dos modelos animais mais comuns para avaliar a resposta imune da Shigella é a infecção pulmonar em camundongos devido a fácil manipulação e similaridade com as respostas intestinais. Neste estudo, nós levantamos a hipótese de como cepas clínicas isoladas de pacientes com shigelose possuem expressão de resposta imune diferencial quando comparados com cepas padrões (M90T). Nossa principal proposta foi analisar quatro cepas de Shigella clínicas com diferentes genes de virulência e a cepa padrão M90T quanto as respostas imunes após invasão murina em 24 e 48h. Métodos: Cepas clínicas de Shigella foram selecionadas pela presença de genes de virulência específicos por PCR. Primers relacionados ao sistema imune foram desenvolvidos. As cepas clínicas e a padrão foram submetidas à análise de expressão gênica pelo Fluidigm (Bioamark Platform). Os resultados foram analisados em programa estatístico R. Resultados: Nós agrupamos os mRNA em cinco grupos: Pró Inflamatórios (CXCL15, IL-1β, IL-6, IFN-β, TNF-α), Anti Inflamatórios (TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3), Resposta Inata (NOD 1, NOD 2, TLR4 e TLR9), Resposta adaptativa (Th1-like, IFN- γ, IL-17A e IL-17B) e Macrófago (NOS, H2 -Aβ1, H2-Eβ, H2-K1, MHC-like 2). Como principais resultados, todas as amostras clínicas demonstraram uma expressão mRNA em 24h de infecção que foi gradativamente aumentado após 48h, enquanto a cepa padrão M90T teve a regulação oposta com taxas de mRNA em 48h, sugerindo grandes diferenças entre as respostas a cepas clínicas e a padrões bem caracterizados. A cepa clínica5 não alterou a expressão de mRNA em 24 e 48h nos genes da resposta adaptativa, sugerindo baixas taxas de invasão e controle do hospedeiro nas etapas iniciais da infecção. A cepa clínica #11 demonstrou alta atividade macrofágica devido a maior expressão de IFN-γ e NOS. A cepa #14 e #27 demonstraram um possível potencial de proteção Th1 devido a alta expressão mRNA para MHC-like II e Th1 quando comparado a outras cepas e o controle positivo. A presença de alta expressão de IL-17 na cepa #27 relação com células Th17. O potencial imunológico da cepa #27 pode ter relação com as enterotoxinas (shET1A, shET1B e shET2). A presença do conjunto completos destas enterotoxinas foi confirmado na cepa #27 por PCR. Conclusão: As diferenças entre cepas clínicas e padrões foram evidentes neste estudo. Cepa clínica 27 parece ser uma ótima candidata para estudos futuros e pode prover novas perspectivas para as diferenças de invasão e resposta imune vista nos hospitais.

Introduction: Shigellosis is a bacillary dysentery caused by Shigella, a gramnegative intracellular human pathogen. One of most common animal models to evaluate Shigella’s immune response is mice pulmonary infection due easy manipulation and similar gut responses. At this study, we have hypothesized how clinical strains isolated from Shigellosis patients had differential immune response expression when compared…

A Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) tem sido causa frequente de muitos casos de diarreia no Brasil e no mundo, além de ser um dos principais agentes responsáveis pelas taxas de mortalidade entre as crianças de 0 a 5 anos de idade. A EPEC causa uma lesão histológica nas microvilosidades dos enterócitos caracterizada pela formação de uma ultraestrutura em forma de pedestal. Um dos fatores de patogenicidade responsável é o complexo BfpA (bundle forming pili). A BfpA promove a adesão das cepas de EPEC denominadas como típicas. Diferentemente, algumas cepas de EPEC são desprovidas do Fator de Aderência de Escherichia coli -EAF (EPECBfpA-) e tendem a provocar as lesões típicas de pedestal com mais lentidão e por isso são denominadas EPEC atípicas. Como a BfpA é uma proteína imunogênica e recentemente a incidência de EPECBfpA- atípicas vem aumentando, acredita-se que a lesão por estas bactérias ocorra por outras vias tornando importante o desenvolvimento de estratégias para sua identificação. Neste estudo várias sequências antigenicamente preditas foram usadas para sintetizar peptídeos a fim de produzir anticorpos policlonais anti-BfpA em camundongos BALB/c visando a identificação específica da EPEC típica. Para alcançar os objetivos, inicialmente ferramentas de bioinformática de proteínas e de predição de epítopos B foram utilizadas para mapeamento de regiões antigênicas específicas para EPEC. Peptídeos sintéticos foram adquiridos para a imunização de camundongos Balb/c, afim de que antissoros fossem avaliados quanto a especificidade à EPEC. Como resultados foi possível a construção e síntese de seis peptídeos lineares de BfpA (P1-P6). O peptídeo P6 foi selecionado como produto deste estudo devido a habilidade de induzir a produção de anticorpos contra esta proteína e este soro reconhecer a proteína nativa em cepas de EPEC típica. Acredita-se que a caracterização funcional destes anticorpos permita o desenvolvimento de ferramentas para o diagnóstico específico das duas linhagens de EPEC visando a contribuição para estudos futuros sobre o controle do processo fisiopatológico no intestino.

Escherichia coli (EPEC) was frequent cause of many cases of diarrhea in Brazil and around the world, and one of the main agents responsible for high mortality rates among children aged 0-5 years. EPEC is known to cause histological damage to the microvilli of enterocytes, characterized by the formation of a shaped support ultrastructure. One of the factors responsible for pathogenicity is complex BFP (bundle forming pili). The presence of genes BfpA promotes adhesion and consequently the injury of EPEC strains characterized as typical. Differently, some EPEC strains lack EAF (EPECBfpA-) causing lesions shaped as pedestal, but more slowly, called atypical EPEC. BfpA is known as immunogenic and recently the incidence of atypical (EPECBfpA-) is increasing, it is believed that these bacteria injury occurs through other means making it important to develop strategies for identifying. In this study several predicted peptide…

Bacillus subtilis é uma bactéria Gram-positiva, não patogênica, que recebeu o status GRAS (Generally Regarded As Safe) pelo FDA Americano. Quando exposta à situação adversa o B. subtilis produz um tipo de célula morfologicamente distinta, denominada de esporo. Pesquisas têm destacado o potencial do uso de esporos como delivery vacinal, sendo estes capazes de estimular respostas imunes sistêmicas e localizadas, promovendo ainda elevação da resposta humoral quando coadministrado com antígenos acoplados ou integrados à superfície dos esporos. Atualmente, ainda não há uma vacina eficaz para o combate à malária e dentre os antígenos estudados, a proteína Pf-MSP1-19 de Plasmodium falciparum se mostra um dos mais promissores e elucidados candidatos vacinais. Diante do exposto, este trabalho teve como objetivo principal avaliar a resposta imune frente ao antígeno rPf-MSP1-19 de Plasmodium falciparum, presente na superfície dos esporos de Bacillus subtillis. Materiais e métodos: Para isso, foram realizados separação por renografina e quantificação por citometria de fluxo dos esporos de Bacillus subtillis recombinados com rPf-MSP1-19 e esporos Wild Type (WT), seguido pelo acoplamento químico da rPf-MSP1-19 à superfície dos esporos WT autoclavados. Com as ferramentas produzidas, camundongos Balb/c foram imunizados via oral e intraperitoneal e os soros obtidos avaliados por ELISA indireto. Resultados: Neste trabalho o acoplamento químico utilizando EDC e NHS se mostrou o melhor método para adsorção da proteína rPf-MSP1-19 à superfície de esporos. Uma nova abordagem para quantificação de esporos foi aplicada usando Citometria de Fluxo e Beads Trucount™ demonstrando maior potencial de eficiência e sensibilidade. Foi observado que houve a degradação da proteína rPfMSP1-19 quando expressa diretamente na superfície do esporo, pelo método recombinante. Quanto as imunizações orais, não foi possível obter resposta imune frente ao antígeno acoplados aos esporos quimicamente e nem a Bacillus subtillis recombinante. Entretanto as imunizações intraperitoneais induziram níveis elevados de IgG anti- rPf-MSP1-19 no grupo imunizado com rPf-MSP1-19 acoplada à superfície dos esporos WT autoclavados semelhante ao controle positivo. Sugerindo o uso de esporos de B. subtilis Wild Type autoclavados como alternativa de delivery e de adjuvante de antígenos para imunizações com fins experimentais, podendo no futuro ser aplicado em imunizações em humanos.

Bacillus subtilis is a Gram-positive, non-pathogenic bacterium that receive the status GRAS (Generally Regarded As Safe) by the American FDA. When exposed to the adverse situation B. subtilis produces a morphologically distinct cell type, called the spore. Research has highlighted the potential of use spores as vaccines delivery, which are capable of stimulate systemic and localized immune responses, promoting the elevation of humoral response when coadministered with antigens coupled or integrated to the surface of spores. Currently, there is still no effective vaccine to combat malaria and among…

A malária continua sendo um sério problema de saúde pública amplamente distribuída nas regiões tropicais e subtropicais no mundo. No Brasil, a doença ainda apresenta elevado número de ocorrências, no qual o Plasmodium vivax (P. vivax) é responsável pela maioria dos casos. Uma das principais maneiras de controle desta enfermidade está ligada ao seu diagnóstico correto logo nos estágios iniciais, o que o método diagnóstico por microscopia, ainda considerado “padrão ouro”, muitas vezes não é capaz de proporcionar. Isso demonstra a necessidade de produção e distribuição de testes de diagnóstico que não dependam de muitos equipamentos e profissionais qualificados, e que sejam capazes de fornecer resultados rápidos e acurados, mesmo em regiões remotas. Portanto, o presente trabalho promoveu o desenho de peptídeos sintéticos contra regiões específicas da proteína Lactato Desidrogenase de Plasmodium (pLDH) e a imunização de camundongos para obtenção de anticorpos policlonais contra estes, dos quais apenas dois deles tiveram resposta de anticorpos específicos satisfatória. O reconhecimento destes anticorpos à proteína nativa de LDH de Plasmodium vivax foram confirmados através de imunofluorescência. Estudos futuros são necessários para confirmar a especificidade dos anticorpos, para serem avaliados com marcadores de infecções de malária que possam compor um kit de diagnóstico nacional de malária.

Malaria remains a serious public health problem widely distributed in the tropical and subtropical regions of the world. In Brazil, the disease still presents high numbers of cases, in which Plasmodium vivax (P. vivax) is responsible for most cases. One of the main ways of controlling this disease is linked to its correct diagnosis in the early stages, which the diagnostic method still considered "gold standard" is often not able to provide. This demonstrates the need to produce and distribute diagnostic tests which are not dependent on equipments and/or skilled professionals and are capable of delivering fast and accurate results even in remote regions. Therefore, the present study promoted the design and synthesis of peptides against specific regions of Plasmodium Lactate Dehydrogenase (pLDH) protein to obtain polyclonal antibodies through immunization of mice to obtain polyclonal antibodies against them, which only two of them have satisfactory specific antibody responses. The recognition of these antibodies to the native LDH protein of Plasmodium vivax have been confirmed by immunofluorescence. More studies are needed to confirm the specificity of the antibodies to be evaluated with markers of malaria infections that may constitute a national malaria diagnostic kit.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

A anaplasmose bovina é uma enfermidade causada por uma rickettsia denominada Anaplasma marginale (A. marginale) transmitida por carrapatos e a doença se caracteriza por anemias, febre, perda de peso, diminuição da produção de leite, aborto e morte nos animais. A doença causa perdas econômicas na produção de gado e por isso estratégias para o desenvolvimento de vacinas é imprescindível para minimizar seu impacto. Neste estudo uma proteína recombinante de A.marginale foi produzida a partir de uma estratégia inovadora de utilizar DNA sintetico para codificar os epítopos dos principais antígenos de A.marginale. Após a clonagem em pGEM e subclonagem em pHT43, a proteína quimérica foi expressa em Escherichia coli contendo epítopos dos antigenos OMP7/9 (outer membrane protein 7/9) e MSP1a (major surface protein 1a). A antigenicidade foi comprovada pela reatividade da proteina recombinante com soro de bezerro com anaplasmose, e a imunogenicidade e proteção vacinal foi comprovada em camundongos Balb/c. Com uma fórmula composta com adjuvante oleoso (MSP1a/OMP7/9+ISA), animais receberam três (3) doses vacinais e desafiados com 3x105cel/mL de A. marginale UFMG2. Os animais imunizados não apresentaram variação de peso corporal nem sinais clínicos da doença, porém houve redução significativa da carga bacterêmica nos vacinados (p<0,0008) comparados com grupos placebos. Além disso, não houve alterações hematológicas como aumento no número de monócitos (p<0,005), neutrófilos (p<0,05) e leucocitose (p<0,05), verificadas nos controles infectados. As avaliações deste trabalho demonstraram a importância da proteína recombinante MSP1a/OMP7/9 na melhoria da resposta imunológica de Balb/c e sua potencial aplicabilidade na produção de vacinas recombinantes.

The bovine anaplasmosis is a disease characterized by severe anemia, fever, weight loss, decreased milk production, abortion and death in the animals. It is caused by A. marginale and transmitted by ticks, leading severe economic losses in cattle production and hence strategies for developing vaccines are essential to minimize its impact. In this study, a chimeric protein was produced by synthetic DNA, carrying sequences of predicted epitopes from OMP7, OMP9 and MSP1a, and used as vaccine emulsified with ISA adjuvant. After three doses, Balb/c mice were challenged with 3x105cel/mL A. marginale UFMG2 to assess proctetion of compound MSP1a/OMP7/9+ISA. There were not body weight alterations neither clinical signs were observed in immunized mice. Bacteremia count showed drastic reduction and discrete alteration on erythrocyte morphology (spherocytes) in vaccined mice 56th day after challenge. No alteration was observed in hematologic data in relation to infected control mice. The evaluation obtained in this study showed the importance of the MSP1a /OMP7/9 protein in the immune response of the Balb/c and your applicability potential in the recombinant vaccine production.

Não informada