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CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

Lutzomyia longipalpis é um díptero hematófago que atua como principal vetor de protozoários do gênero Leishmania nas Américas. Considerando que, no inseto vetor, o desenvolvimento de Leishmania é exclusivamente no tubo digestivo, estudos sobre a fisiologia intestinal destes insetos, especialmente do controle do pH intestinal, tornam-se indispensáveis. Os mecanismos que ativam a alcalinização do intestino médio, quando as fêmeas deixam de se alimentar de açúcares e fazem repasto sanguíneo, ainda não foram plenamente elucidados. Sabe-se que o transporte diferencial de íons, evento comum às células do tubo digestivo e associado à energização das membranas, com o transporte de nutrientes e com o controle do pH no meio, pode ser ativado a partir da sinalização conduzida por segundos mensageiros intracelulares. Sistemas de transporte de aminoácidos são cruciais na fisiologia de dípteros hematófagos, e alguns transportadores funcionam fazendo simporte de íons H+ com aminoácidos. Propõe-se, então, que estes transportadores podem estar envolvidos na regulação do pH intestinal. Além disso, o sistema TOR, uma via de sinalização intracelular altamente conservada entre os organismos eucariotos, é especialmente ativado pela presença de aminoácidos; uma vez que a digestão do sangue é um processo essencialmente enzimático e gera aumento da concentração de aminoácidos, é possível que esse sistema seja ativado mediante o repasto sanguíneo e participe da alcalinização intestinal. Contudo, não há estudos abordando tais aspectos em L. longipalpis. Desta forma, este trabalho objetivou estudar os mecanismos que atuam no controle da alcalinização intestinal em fêmeas de L. longipalpis. A partir de preparações ex-vivo, intestinos de fêmeas de L. longipalpis corados com azul de bromotimol, e, sabidamente em pH≤ 6, foram tratados com diferentes concentrações de uma solução de aminoácidos. Verificou-se que a presença de aminoácidos estimulava a alcalinização, mas a intensidade do processo variava com a concentração utilizada. Mediante a elaboração de uma…

Advisors/Committee Members: Nelder de Figueiredo Gontijo.

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Made available in DSpace on 2019-08-14T08:10:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_jamila_27.09.2016.pdf: 2100686 bytes, checksum: 2366bec1c0342adbd5a476b8b1280463 (MD5) Previous issue date: 9

A destruição de hemácias não infectadas tem sido associada à anemia na malária, porém, os mecanismos imunológicos envolvidos na destruição dessas células permanecem desconhecidos, principalmente nos casos de infecção por P. vivax. Um dos fatores que poderiam contribuir para a destruição dessas hemácias são os auto-anticorpos produzidos durante a infecção. Entretanto, nota-se, na literatura, uma escassez de estudos no que se refere à relação entre autoimunidade e anemia em infecções por P. vivax. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar as associações entre a resposta de anticorpos, IgG e IgM, contra moléculas de hemácias de diferentes grupos sanguíneos (A, B e O) e a anemia em pacientes infectados por P. vivax. Para isso, ensaios de Cell-ELISA foram realizados, utilizando-se eritrócitos de indivíduos saudáveis nunca expostos à malária e pertencentes a três grupos sanguíneos (A, B e O). Foram incluídos, ainda, pacientes com malária vivax não grave residentes em áreas de baixa transmissão na Amazônia brasileira (n = 75) e pacientes com malária vivax grave residentes em área de transmissão intensa no Peru (n = 18). Verificou-se que, para pacientes com malária não grave, o reconhecimento, por anticorpos IgG, contra moléculas de hemácias do grupo sanguíneo A, foi inferior ao observado para hemácias dos grupos B e O. Por outro lado, no que se refere à resposta de IgM, observou-se que as hemácias do grupo B foram menos reconhecidas que os eritrócitos dos demais grupos sanguíneos. Ainda no que se refere aos pacientes não graves, não foi encontrada nenhuma associação significativa entre a exposição ou a parasitemia e a resposta de anticorpos contra moléculas de hemácias dos diferentes grupos sanguíneos. Além disso, associações negativas entre os níveis de hemoglobina e os de anticorpos IgG, bem como os de IgM, foram observadas. Quando comparamos a resposta de anticorpos IgG ou IgM entre pacientes anêmicos e não anêmicos, observou-se que ambas as respostas foram maiores para pacientes anêmicos. Resultados contrários foram encontrados para pacientes com malária grave residentes no Peru, já que nesse caso, os pacientes anêmicos apresentaram níveis de IgG e IgM inferiores aos observados para os não anêmicos. Todos esses achados ampliam a nossa compreensão sobre a relação entre a resposta de anticorpos direcionada contra hemácias dos diferentes grupos sanguíneos e a anemia na malária vivax.

The destruction of uninfected RBCs has been associated with anemia in malaria but the mechanisms involved in this clearance remain unknown, particularly in regard to P. vivax. One of the factors that could contribute to this destruction is self-antibodies produced during the infection. However, few studies have concerned the relationship between autoimmunity and anemia in P. vivax infections. The aim of this…

Advisors/Committee Members: Erika Martins Braga, Luiza Carvalho Mourão, Ricardo Wagner de Almeida Vitor, Nelder de Figueiredo Gontijo.

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Made available in DSpace on 2019-08-09T21:47:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_camila_maia_pdf.pdf: 2222111 bytes, checksum: d048a91751ba66835b84be4cfd78147c (MD5) Previous issue date: 25

A remoção de eritrócitos não parasitados é uma das principais causas da anemia em infecções por Plasmodium vivax, mas os principais mecanismos patofisiológicos envolvidos nesta destruição ainda são desconhecidos. Estudos realizados com Plasmodium falciparum têm sugerido que a fagocitose de eritrócitos não infectados por macrófagos do baço é um dos principais mecanismos que pode explicar tal remoção, porém, pouco se sabe no que se refere a infecções por P. vivax. Já foi demonstrado que a eritrofagocitose de eritrócitos parasitados, bem como a de eritrócitos senescentes é dependente de modificações na membrana dessas células provocadas por uma série de fatores, dentre os quais pode se citar, a deposição de imunoglobulinas. Uma vez que, durante a malária, ocorre um aumento na produção de anticorpos, principalmente de IgGs, o objetivo deste estudo foi investigar o papel dessas imunoglobulinas, purificadas dos soros de indivíduos com diferentes status clínicos, na indução da fagocitose de eritrócitos não infectados, bem como estabelecer possíveis associações entre os diferentes fenótipos do sistema sanguíneo ABO e a anemia na malária vivax. Para isso, ensaios de eritrofagocitose foram realizados in vitro, utilizando-se células THP-1 e eritrócitos obtidos de indivíduos sadios de diferentes grupos sanguíneos. Essas células foram sensibilizadas com IgGs purificadas provenientes de soros de pacientes infectados por P. vivax anêmicos e sem anemia além de IgGs como controles positivo e negativo (IgG comercial policlonal anti-eritrócito e IgGs de indivíduos saudáveis, respectivamente). Verificou-se uma maior taxa de eritrofagocitose para os eritrócitos opsonizados com as IgGs purificadas de pacientes anêmicos em relação aos eritrócitos sensibilizados com IgGs de pacientes não anêmicos e, também, em relação ao controle negativo. Por meio das análises multivariadas (NMDS e GLM) foi possível constatar que os eritrócitos do grupo sanguíneo O são mais suscetíveis à eritrofagocitose in vitro quando comparados aos dos grupos A ou B. Investigou-se, também em nosso trabalho, a relação entre a eritrofagocitose e a gravidade da doença. Para isto, utilizaram-se soros inativados de pacientes internados com quadro grave e, também, soros de pacientes sem manifestações clínicas graves. Verificou-se uma correlação inversa entre as taxas de eritrofagocitose e os níveis de hemoglobina e hematócrito dos pacientes, resultados estes que indicam ser a eritrofagocitose um fator importante na gênese da anemia. Por fim, o efeito da eritrofagocitose na gravidade da infecção foi analisado por meio de uma análise de componentes principais corroborando a importância da eritrofagocitose como um biomarcador de morbidade na malária vivax. Nossos achados ampliam a compreensão sobre os mecanismos envolvidos na anemia e poderão direcionar as…

Advisors/Committee Members: Erika Martins Braga, Flora Satiko Kano, Nelder de Figueiredo Gontijo.

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Made available in DSpace on 2019-08-14T13:14:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_05.01.16___versa_o_final___antonio_mendes.pdf: 6404263 bytes, checksum: dec572d34d7992511d3efa412700e8d0 (MD5) Previous issue date: 1

Mosquitos pertencentes ao genero Anopheles sao os transmissoresnaturais de malaria no mundo. A transmissao ocorre durante a hematofagia, quando esses insetos inoculam na pele do hospedeiro formas infectantes do Plasmodium sp. juntamente com o conteudo de suas glandulas salivares. A saliva desses mosquitos contem moleculas importantes para o sucesso da hematofagia, como vasodilatadores e anticoagulantes. Entretanto, ha pouca informacao existente sobre a interacao de componentes salivares de anofelinos com o sistema imune do hospedeiro vertebrado. Este trabalho teve como objetivodemonstrar e caracterizar a atividade inibidora do sistema complemento na saliva de anofelinos, principalmente A. albimanus e A. aquasalis, importantes vetores de malaria na America Latina. Para isso, ensaios hemoliticos, ensaios de deposicao e Western blots para detectar ativacao de componentes do complemento foram realizados na presenca de extrato de glandulas salivares dos mosquitos. Os resultados desses experimentos mostraram inibicao significativa edose-dependente da via alternativa do sistema complemento pelo extrato de glandulas salivares das duas especies citadas. O inibidor salivar de A. albimanus foi purificado em HPLC e identificado por espectrometria de massa como sendo a proteina gSG7. O gene dessa proteina foi entao clonado e expresso em bacterias. A proteina recombinante apresentou atividade tao potente quanto o extrato deglandula salivar de A. albimanus. Anticorpos produzidos contra a recombinante foram capazes de reconhecer tanto a recombinante como a proteina nativa presente no extrato de glandulas, alem de bloquear a atividade das duas formas da proteina. Atraves de ensaio de ELISA e de ressonancia plasmonica de superficie, demonstramos que a gSG7 liga-se em properdina, um regulador positivo da via alternativa do complemento, bloqueando a acao estabilizadora dessa via. Esta e a primeira descricao de um inibidor do complemento na salivade mosquitos, e apresenta potencial importancia no processo hematofagico e na transmissao do Plasmodium sp.

Anopheles mosquitoes are the natural vectors of malaria throughout theworld. The transmission occurs during bloodmeal, when the insects inject infective forms of Plasmodium together with the contents of their salivary glands. Their saliva presents active molecules important for hematophagy, such as vasodilators, anticoagulant and platelet inhibitors. However, little is known about the interactions of Anopheles salivary components with the hosts immune system. The aim of this work was to demonstrate and to characterize anticomplement activity in the saliva of neotropical anophelines, specially A. albimanus and A. aquasalis, important malaria vectors in Latin America. Hemolytic assays, ELISA assays and Western blots for detecting activation of…

Advisors/Committee Members: Nelder de Figueiredo Gontijo, Nagila Francinete Costa Secundino, Sydnei Magno da Silva, Alvaro Cantini Nunes, Erika Martins Braga.

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Made available in DSpace on 2019-08-13T08:53:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o.pdf: 1189383 bytes, checksum: e51b734679dfa73fb55c78b4edb6e77b (MD5) Previous issue date: 23

Aedes (Stegomyia) aegypti é importante vetor de patógenos como os vírus da febre amarela, da dengue e, mais recentemente, da febre chikungunya. Apesar da importância da fisiologia do tubo digestivo e do pH intestinal para a digestão e provavelmente para o desenvolvimento de patógenos, pesquisas sobre a regulação do pH em mosquitos adultos são escassas. Flebotomíneos pertencem à mesma subordem dos mosquitos: a subordem Nematocera. Estudos já realizados com fêmeas de Lutzomyia longipalpis mostraram que seu intestino é ligeiramente ácido (pH 6) antes da ingestão de sangue e que o intestino médio abdominal sofre um processo de alcalinização até pH 8,1 logo após o repasto sanguíneo. Desta forma, esse trabalho visou estudar a hipótese de que dípteros nematóceros hematófagos das subfamílias Culicinae e Phlebotominae compartilham os mesmos mecanismos de regulação do pH, já que apresentam o mesmo padrão anatômico e alimentar. Assim, Aedes aegypti foi escolhido como modelo experimental. O pH foi medido com microeletrodos sensíveis a concentração de H+ ou com o uso de corantes vitais indicadores de pH. A enzima alfa-glicosidase, responsável pela digestão de açucares, foi ensaiada com o substrato sintético p-Nitrofenil-alfa-D-glucopiranosídeo. Os resultados mostram que o intestino médio das fêmeas que se alimentaram somente com açúcar tinha o pH próximo ao pH 6. O pH 6 era mantido mesmo que o mosquito ingerisse soluções tampão com pH diferente. O pH do divertículo mantinha-se semelhante ao da solução ingerida. Quando alimentadas com sangue, o pH do intestino médio abdominal subiu para pH 7,8, enquanto a porção torácica manteve-se ácida (pH~6,0). Na medida em que a digestão avançava o pH do intestino médio abdominal foi caindo lentamente até voltar a pH6. A atividade da enzima alfa-glicosidase mostrou-se proporcionalmente maior no intestino médio torácico, local cujo pH sempre se manteve igual a pH 6, o pH ótimo de ação desta enzima. O mecanismo responsável pelo desligamento do mecanismo de manutenção do pH 6 e pelo disparo do mecanismo de alcalinização, após a ingestão de sangue, parece depender do reconhecimento da presença de uma serpina plasmática no interior do intestino médio abdominal. Em Aedes a digestão de sangue e açúcares é compartimentalizada de modo a ocorrerem simultaneamente em pHs diferentes. Nossos resultados estão de acordo com a hipótese de que os Nematocera hematófagos possuem fisiologia digestiva semelhante.

Aedes (Stegomyia) aegypti is an important vector of several pathogens, such as yellow fever virus, dengue virus and more recently, chikungunya fever. Despite guts physiology and intestinal pH importance in digestion and probably for pathogens transmission, there are only a few studies about pH regulation in adult mosquitoes. Studies of digestive physiology in Lutzomyia longipalpis females showed…

Advisors/Committee Members: Nelder de Figueiredo Gontijo, Vania Cristina dos Santos, Marcelo Gustavo Lorenzo, Theo Rolla Paula Mota, Vania Cristina dos Santos.

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Made available in DSpace on 2019-08-09T19:22:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacaofinaltati.pdf: 2193488 bytes, checksum: b6a8686c661d14b13753c0d0d328b72c (MD5) Previous issue date: 25

As leishmanioses, consideradas antropozoonoses, são um complexo de doenças causadas por espécies de protozoários parasitos pertencentes ao gênero Leishmania, sendo transmitidos aos seus hospedeiros vertebrados por insetos pequenos denominados flebotomíneos. O agente etiológico da leishmaniose visceral, Leishmania infantum, é transmitido no Brasil aos hospedeiros principalmente pela espécie Lutzomyia longipalpis (Diptera, Psychodidae). As fêmeas de flebotomíneos devem realizar a hematofagia para maturação dos ovários e realização da oviposição. Leishmania se desenvolve exclusivamente no interior do intestino das fêmeas, o que significa que o parasito será exposto a microorganismos residentes ou não. Devido ao hábito hematofágico das fêmeas e ao fato de que flebotomíneos também se alimentam de soluções açucaradas de plantas, é provável que estes insetos adquiram bactérias e leveduras que colonizam plantas e pele de animais. Os microrganismos adquiridos juntamente com a flora microbiana residente pode interferir na capacidade vetorial do inseto. A tripsina é uma das principais enzimas presentes no intestino desses vetores, tendo a função de digerir o sangue. Durante seu ciclo evolutivo no inseto vetor, Leishmania é mais susceptível à atividade de tripsina na transição da forma amastigota presente nos macrófagos recém-digeridos para as formas promastigotas, que são as formas responsáveis pelo desenvolvimento do parasito dentro do inseto vetor. O presente trabalho teve como objetivo manipular a fisiologia digestiva da espécie de flebotomíneo L. longipalpis no sentido de aumentar sua susceptibilidade à infecção por Leishmania, além de tentar entender alguns dos mecanismos envolvidos no controle da atividade tripsinolítica no tudo digestivo de L. longipalpis. Os resultados mostraram que é possível reduzir a flora bacteriana com uma solução de antibióticos de largo espectro. A administração de 15 mM de Galactosamina foi suficiente para reduzir a atividade tripsinolítica intestinal no inseto. A administração de 30 mM de uma mistura de todos os aminoácidos foi capaz de reverter em parte este efeito produzido pela Galactosamina. A ingestão de 15 mM de Galactose e Glicosamina não exerceram efeito semelhante à Galactosamina, contudo, a Galactose aumentou a atividade tripsinolítica 48 horas após a alimentação. A presente dissertação gerou resultados que nos permitirão manipular a fisiologia digestiva de L. longipalpis no sentido de se obter flebotomíneos maciçamente infectados com Leishmania. O novo protocolo de infecção que pretendemos desenvolver envolve a manipulação da digestão e do sistema imune dos flebotomíneos ao mesmo tempo em que eles serão protegidos de infecções bacterianas e fúngicas com uso de antibióticos. Assim, acreditamos que seria possível obter insetos homogeneamente infectados com bloqueio do…

Advisors/Committee Members: Mauricio Roberto Viana Sant Anna, Nelder de Figueiredo Gontijo, Erich Loza Telleria, Theo Rolla Paula Mota, Nelder de Figueiredo Gontijo.

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Made available in DSpace on 2019-08-09T20:23:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_vers_o_final.pdf: 3644419 bytes, checksum: be5f8698e98026a81915e8b3a5441c56 (MD5) Previous issue date: 25

No Brasil, encontram-se duas formas clínicas das leishmanioses: Leishmaniose Visceral (LV) e a Leishmaniose Tegumentar (LT). A LV tem como agente etiológico Leishmania (L.) infantum (=L. (L.) chagasi) atingindo principalmente órgãos como o baço e fígado, e a LT apresenta diversas manifestações clínicas e tem como agentes etiológicos várias espécies, incluindo L. (L.) amazonensis, causando lesões cutâneas. Sabe-se que no país existem áreas de sobreposição dessas duas espécies, o que pode possibilitar a ocorrência de coinfecção. Embora seja mais comum o relato de LV causada por L. infantum e de LT causada por L. amazonensis, no Brasil há relatos de casos de visceralização causada por L. amazonensis em humanos e cães de área urbana. Por serem considerados bons modelos experimentais em infecções por Leishmania spp, hamsters foram utilizados nesse estudo para um melhor entendimento desse tipo de infecção. Assim, as espécies L. (L.) infantum (MCAN/BR/2002/BH401) e L. (L.) amazonensis (IFLA/BR/1967/PH8) foram inoculadas separadamente e simultaneamente nesses animais, pelas vias intraperitoneal e subcutânea, e estes foram acompanhados durante 90 dias. A via de inoculação não teve influência nas alterações clínicas das infecções por L. infantum ou L. amazonesis, porém, L. infantum tem estabelecimento mais típico por via IP enquanto L. amazonensis por via SC. L. amazonensis possui capacidade de invadir baço e fígado mais precocemente que L. infantum em todas as situações avaliadas, mas L. infantum pode prevalecer com o passar do tempo. A coinfecção foi mais grave, com L. amazonensis provocando esplenomegalia precoce e lesões de pele no local do inóculo e disseminadas.

In Brazil, there are two clinical forms of leishmaniasis: Visceral Leishmaniasis (VL) and Tegumentary Leishmaniasis (LT). The VL has the etiologic agent Leishmania (L.) infantum (= L. (L.) chagasi) affecting mainly organs such as the spleen and liver, and TL has several clinical manifestations and has as etiological agents several species, including L. (L.) amazonensis, causing skin lesions. It is known that in country there are overlapping areas of these two species, which may facilitate the occurrence of coinfection. Although it is more common VL caused by L. infantum and TL caused by L. amazonensis, in Brazil there are reports of visceralization caused by L. amazonensis in humans and dogs from urban areas. Hamsters are considered good experimental models in Leishmania spp infections and were used in this study to a better understanding of this type of infection. Thus, the species L. (L.) infantum (MCAN/BR/2002/BH401) and L. (L.) amazonensis (IFLA/BR/1967/PH8) were inoculated separately and simultaneously in these animals by intraperitoneal and subcutaneous routes, and they were followed for 90 days. The route of inoculation had no influence…

Advisors/Committee Members: Helida Monteiro de Andrade, Nelder de Figueiredo Gontijo, Wagner Luiz Tafuri.

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Made available in DSpace on 2019-08-09T20:02:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_laila_heringer_costa_2014.pdf: 5444577 bytes, checksum: b83959fafe37ccd49a9fa6819e3fd24e (MD5) Previous issue date: 30

O presente trabalho consistiu na avaliação do comportamento de oviposição em saltos de Aedes aegypti, avaliação das armadilhas Gravid Aedes Trap (GAT) e BG-Sentinel (BGS) na supressão de fêmeas e na distribuição de ovos no ambiente e aprimoramento da GAT. Ao comparar aspectos da biologia e do comportamento de oviposição de indivíduos de uma colônia recém estabelecida (F1) com uma colônia antiga (F125) de Ae. aegypti, notou-se que a razão sexual, o número de ovos depositados, o número de criadouros colonizados e o tamanho dos machos foram iguais entre insetos de F1 e F125. Entretanto, a viabilidade dos ovos, a duração da fase larval e o tamanho das fêmeas foram menores na colônia antiga. O efeito da dieta das fêmeas e as dimensões dos criadouros nos comportamentos de oviposição em saltos foram avaliados em semicampo através da observação de grávidas individualizadas. Notou-se que ambos os comportamentos não dependeram da dieta a que as fêmeas foram submetidas. Grávidas de Ae. aegypti espalharam seus ovos em todos os recipientes disponíveis, independente de suas dimensões (MLG, p<0,05), porém evitaram depositar grande quantidade de ovos em criadouros pequenos. Comparou-se também as recapturas na BG-Sentinel (BGS) e na Gravid Aedes Trap (GAT) em simulações de peridomicílio contendo diferentes densidades (0, 4, 8 e 16) de criadouros de distintas dimensões. Nos ambientes com 4, 8 e 16 criadouros verificou-se a tendência de maior colonização de criadouros maiores em relação aos menores (MLG, p < 0,05). Não houve redução no número de ovos depositados em decorrência da presença de GAT (MLG, p < 0,05), embora a BGS tenha reduzido significativamente o número de ovos em ambientes com 8 e 16 recipientes de oviposição (MLG, p < 0,05). A BGS recapturou entre 60 e 80% das fêmeas liberadas, enquanto a GAT recapturou entre 50 e 60 % dos indivíduos avaliados, sendo que as recapturas não foram influenciadas pelo número de criadouros disponíveis. A armadilha GAT foi aprimorada, substituindo spray de superfície (piretróide) por mosquiteiro impregnado com inseticida de alta durabilidade (até 2 anos) e praticidade de uso, para ser utilizada na produção em grande escala da GAT.

This research consisted of the evaluation of the "skip oviposition" behavior of Aedes aegypti, the evaluation of the BG-Sentinel (BGS) and the Gravid Aedes Trap (GAT) suppressing females and influencing egg distribution under semi-field conditions, with improvements of the GAT. We compared biological parameters and the oviposition behavior of Ae. aegypti from an old colony (F125) and from a newly established colony (F1). It was observed that the sex ratio, the number of laid eggs, the number of colonized breeding sites, and the size of the males, were equal between insects coming from F1 and F125 colonies. Meanwhile, the hatchability of the…

Advisors/Committee Members: Alvaro Eduardo Eiras, Luciane Gomes Batista Pereira, Luciane Gomes Batista Pereira, francisco chiaravalloti neto, José Eduardo Marques Pessanha, Nelder de Figueiredo Gontijo.

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Made available in DSpace on 2019-08-10T23:06:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_de_mestrado_da_larissa_ferreira_paranaiba.pdf: 1661329 bytes, checksum: 02a65c516742665f31700538af1054b5 (MD5) Previous issue date: 20

A Leishmania enriettii é uma espécie não infectante ao homem que tem como hospedeiro vertebrado a cobaia Cavia porcellus. Alguns aspectos da interação parasito-hospedeiro neste modelo ainda são desconhecidos principalmente envolvendo moléculas de superfície do parasito. Vários Lipofosfoglicanos (LPGs) e glicoinositolfosfolípides (GIPLs) de espécies de Leishmania do Novo e Velho Mundo já foram descritas, porém aspectos da glicobiologia de L. enriettii ainda são desconhecidos. Neste estudo, caracterizou-se preliminarmente os LPGs e GIPLs de duas cepas de L. enriettii (L88 e Cobaia) isoladas de seus hospedeiros vertebrados em 1945 e 1985, respectivamente. Além disso, foi avaliado o papel destas moléculas in vitro na interação com macrófagos murinos e sua infectividade in vivo em Cavia porcellus. Os LPGs foram extraídos, purificados e analizados por western-blot mostrando que o LPG da cepa L88 apresentou maior peso molecular. Os LPGs e GIPLs foram despolimerizados e seus açúcares foram analizados através da eletroforese de carboidratos. A região de unidades repetitivas dos LPGs das duas cepas não apresentou cadeias laterais, sendo representado pelo dissacarídeo Gal(1,4)Man(1)-PO4. O GIPL da cepa L88 apresentou galactose em sua estrutura, similar ao GIPL do tipo II. O GIPL da cepa Cobaia apresentou uma abundância de glicose, uma característica ainda não observada. Os polimorfismos observados nos LPGs e GIPLs foram avaliados in vitro em macrófagos murinos. Para se avaliar que tipo de receptor estava sendo reconhecido por LPGs e GIPLs das duas cepas, macrófagos peritoneais de camundongos C57BL/6 e knock-out (TLR2 -/- e TLR4 -/-), foram primados com IFN- e estimulados com os glicoconjugados e seus respectivos parasitos vivos (MOI 10:1). Nenhuma ativação de NO ou citocinas foi observada com os parasitos vivos. Por outro lado, os LPGs e GIPLs foram capazes de ativar a produção de NO e citocinas (IL-6, IL-12 e TNF ), sendo que os LPGs foram agonistas mais potentes que os GIPLs, preferencialmente via TLR2 e secundariamente via TLR4. Para se avaliar isoladamente o papel de cada TLR, foram utilizadas células de ovário de hamster chinês (CHO). Neste modelo, foi observado que os LPGs e os GIPLs não foram capazes de ativar TLR2 e TLR4, sugerindo uma co-participação dos dois receptores. Para se avaliar a infectividade das duas cepas, foram utilizados cobaias machos da espécie Cavia porcellus. Estes animais foram inoculados com parasitos das duas cepas na presença ou não de extrato de glândula salivar do flebotomíneo (GSF) Lutzomyia longipalpis e avaliados semanalmente por 91 dias. Os animais infectados começaram a desenvolver protuberância e/ou lesão a partir da 4ª e 5ª semana de infecção, mas apenas a cepa L88 foi capaz de causar lesões ulceradas. O tamanho, o tempo de desenvolvimento e…

Advisors/Committee Members: Rodrigo Pedro Pinto Soares, Nelder de Figueiredo Gontijo, Alexandre Ferreira Marques, Helida Monteiro de Andrade.

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Made available in DSpace on 2019-08-13T00:26:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_de_mestrado_kleber_fortes.pdf: 1475050 bytes, checksum: 0d4be0f63f64b12a3ee2c590b49ae5a8 (MD5) Previous issue date: 28

A Leishmaniose Visceral é uma doença de grande impacto à saúde pública. No Novo Mundo é causada por Leishmania infantum e transmitida principalmente por Lutzomyia longipalpis. Em flebotomíneos adultos, as tripsinas desempenham um importante papel durante o processo de digestão sanguínea, entretanto, pouco se sabe a respeito da ação destas proteases nas formas imaturas. Neste trabalho foi realizado um processo de purificação e caracterização de uma enzima semelhante à tripsina de intestino médio de L. longipalpis. Ensaios enzimáticos na presença de benzamidina (inibidor de tripsina) demonstraram que a atividade tripsinolítica é responsável por maior parte da digestão de proteínas totais (58%) quando comparadas com a atividade quimotripsinolítica (42%). O processo de purificação por cromatografia de afinidade (coluna de p-aminobenzamidina) permitiu a obtenção de frações com atividade tripsinolítica (substrato: L-BApNA), que revelou por SDS-PAGE uma única banda de massa molecular de 20,6 kDa. A análise com benzamidina em SDS-PAGE co-polimerizado com gelatina, bem como ensaios enzimáticos na presença de diversos inibidores indicou que a enzima é uma protease semelhante à tripsina. Ensaios realizados em diferentes faixas de pH demonstraram que a atividade proteolítica máxima ocorre em pH 9,5. A atividade específica encontrada foi de 2511,5 U.mg-1 e o fator de purificação 46,1 vezes. Na determinação cinética, o valor de Km utilizando L-BApNA foi de 0,49 mM. Em análise por espectrometria de massa do material purificado, foi detectada a massa de 23311,88 Da (MALDI-TOF). Com relação ao efeito da concentração de íons metálicos (Ca2+ e Mg2+) e EDTA, verificou-se uma diminuição da atividade tripsinolítica apenas quando EDTA era adicionado aos ensaios em concentrações iguais ou maiores a 18,75 mM, não havendo interferência por parte dos íons metálicos. Este é o primeiro trabalho que relata a purificação e caracterização de uma tripsina digestiva em larvas de L. longipalpis.

Visceral Leishmaniasis is a disease of major public health impact. In the New World the diasease is caused by Leishmania infantum chagasi and transmitted mainly by Lutzomyia longipalpis. In adult sandflies, trypsins play an important role during of blood digestion. However, little is known about the action of these proteases in immature forms. In this work we purified and characterized a trypsin-like enzyme from the midgut of L. longipalpis. Enzyme assays performed with benzamidine (a trypsin inhibitor) demonstrated that trypsin is responsible for most of total protein digestion (58%) compared with chymotrypsins (42%). The process of purification by affinity chromatography (p-aminobenzamidine column) produced fractions with tryptic activity (substrate: L-BAPNA), which by SDS-PAGE gel analysis revealed a single band of molecular…

Advisors/Committee Members: Nelder de Figueiredo Gontijo, Marcelo Matos Santoro, Mauricio Roberto Viana Sant Anna, Vladimir Fazito do Vale.

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Made available in DSpace on 2019-08-14T02:11:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_j_nior_final.pdf: 3320124 bytes, checksum: 5067fea3d3e9a579edcd0d5e8f134a2d (MD5) Previous issue date: 19

Leishmania infantum, sinonímia com L. chagasi, é o protozoário responsável pela Leishmaniose Visceral nas Américas e na Europa, uma doença grave, podendo ser fatal se não tratada. Os casos humanos variam desde infecção sub-clínica, com um número indeterminado de assintomáticos em áreas endêmicas, até um quadro crescente de co-infecção com HIV e alta letalidade em crianças. Em cães, a doença é severa, caracterizada por crônica e progressiva caquexia, hepatoesplenomegalia, linfadenopatia, onicogrifose e pancitopenia. Porém, menos de 60% dos cães infectados apresentam sinais clínicos da doença, sugerindo que tanto fatores do hospedeiro quanto do parasito podem estar envolvidos na variabilidade clínica da doença. Assim, devido a sua importância e diversidade clínico-epidemiológica em nosso país, o estudo de fatores de virulência em L. infantum mostra-se bastante promissor para um melhor entendimento da relação parasito-hospedeiro. Neste estudo, inicialmente foi caracterizada a virulência entre duas cepas de L. infantum (BH46 e BH400) e em seguida foi comparada a expressão diferencial de proteínas entre as cepas. Dessa forma, através de eletroforese bidimensional e Differential Gel Electrophoresis (DIGE), foram avaliados os perfis proteômicos das formas promastigota entre as diferentes cepas. Posteriormente, as proteínas foram identificadas por Espectrometria de Massas. Essas análises nos permitiram selecionar e identificar proteínas possivelmente associadas à diferença de virulência entre as cepas BH46 e BH400, entre elas estão a Triparredoxina, S-Adenosil Homocisteina Hidrolase, HSP- 70, Metalo-Peptidase, Clan MA(E), Família M3, Enolase, Fosfomanomutase, Peroxirredoxina, proteína 14-3-3 like, proteína Rab 1 ligante à GTP e KMP-11. Através da predição da rede de interações entre as proteínas, foi observado que muitas vezes as proteínas descritas como envolvidas na virulência interagem entre si, tornando importante o estudo de todos os complexos proteicos globais do organismo, e não apenas uma proteína individualmente. Assim, a caracterização de fatores envolvidos com a diferença de virulência entre BH46 e BH400 permitirá um melhor entendimento sobre a relação parasito-hospedeiro.

Leishmania infantum, synonymy with L. chagasi, is the protozoan responsible for Visceral Leishmaniasis in the Americas and Europe, a serious disease that can be fatal if untreated. Human cases range from subclinical infection, with an undetermined number of asymptomatic patients in endemic areas, a growing cadre of co-infection with HIV and high mortality in children. In dogs, the disease is severe, characterized by chronic and progressive cachexia, hepatosplenomegaly, lymphadenopathy, and pancytopenia onychogryphosis. However, less than 60% of the infected dogs present clinical signs of the disease, suggesting that host and…

Advisors/Committee Members: Helida Monteiro de Andrade, Simone da Fonseca Pires, Nelder de Figueiredo Gontijo, Simone Goncalves dos Santos, Simone da Fonseca Pires.

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Made available in DSpace on 2019-08-14T10:28:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 grasielle_caldas_davila_pessoa___tese_vers_o_final.pdf: 2786336 bytes, checksum: ba339a5359dac5a32d123c60450949e1 (MD5) Previous issue date: 30

Os relatos cada vez mais frequentes de populações triatomínicas com razões de resistência elevadas tem causado grande impacto, desafiando cientistas e sanitaristas na busca de novas alternativas para o controle vetorial. Considerando os casos de resistência de triatomíneos já reportados, é possível que o uso intensivo de inseticidas no Brasil por mais de 30 anos tenha favorecido o aparecimento de novos focos em regiões ainda mais amplas. Deste modo, justifica-se a importância de se investigar este fenômeno levando-se em consideração as condições ambientais nas quais ele se encontra inserido bem como variabilidade genética destes insetos e sua capacidade de alteração na linha do tempo na presença do ativo químico. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o perfil de suscetibilidade/resistência de populações de T. sordida de áreas com infestação persistente da região do Triângulo Mineiro e do Norte de Minas Gerais ao piretróide deltametrina. A População utilizada como linhagem referência de suscetibilidade é proveniente de Uberaba. Os ensaios biológicos quali e quantitativos foram conduzidos de acordo com PESSOA (2008) e os bioquímicos de acordo com VALLE et al., (2006) com modificações. A caracterização da estrutura genética das populações foi desenvolvida por meio do estudo de microssatélites por técnica de transposição. As características ambientais e operacionais foram avaliadas por meio de questionário próprio. As variáveis climatológicas (umidade relativa, pluviosidade, temperatura e insolação) foram obtidas por meio de dados disponíveis no Banco de Dados Metereológicos para Ensino e Pesquisa - BDMEP. As análises dos bioensaios quantitativos revelaram RR50 que variaram de 0,44 a 6,5. De acordo com critério de categorização do status da suscetibilidade/resistência proposto pela OPAS (2005), apenas 1% das populações foi classificada como resistente a deltametrina (TsCJB; RR50: 6,50), enquanto que de acordo com critério de ZERBA & PICOLLO (2002), este valor sobe para 55,5%. Os bioensaios qualitativos revelaram um percentual de mortalidade à Dose Diagnóstica que variou de 43,3% a 100%, sendo 61,2% das populações classificadas como resistentes à deltametrina. Os resultados obtidos nos bioensaios qualitativos e quantitativos não se mostraram correspondentes, reforçando a necessidade de ensaios de campo. A padronização dos ensaios bioquímicos revelou que estes devem ser realizados com insetos de mesma geração e idade, com n amostral de 135 espécimes. A análise dos ensaios bioquímicos utilizando somente o percentil 99 se mostrou deficiente, justificando a necessidade de um teste estatístico em paralelo, a ser escolhido de acordo com o tipo de distribuição dos resultados obtidos. A análise das populações de interesse revelou alteração na maioria das populações para todas as…

Advisors/Committee Members: Lileia Diotaiuti, Alvaro Eduardo Eiras, Denise Valle, Marcos Takashi Obara, Nelder de Figueiredo Gontijo, Paulo Roberto de Oliveira.

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Made available in DSpace on 2019-08-10T09:27:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_240412juliana.pdf: 2740229 bytes, checksum: 65087d9051962a58864fcf1329d27777 (MD5) Previous issue date: 30

Adjuvantes vacinais são substâncias que aumentam a imunogenicidade de antígenos que são co-administrados, sendo importantes para a formação de uma intensa, durável e rápida resposta imune. Neste contexto, a utilização de adjuvantes vacinais capazes de gerar uma resposta imune celular eficaz torna-se essencial para o desenho/desenvolvimento de vacinas contra a leishmaniose visceral. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar a resposta imune frente aos adjuvantes vacinais: Saponina (SAP), Adjuvante Incompleto de Freund (AIF) e Monofosforil Lípido A (MPL) após uma única dose do adjuvante aplicada na pele de camundongos. O antígeno total de L. (V.) braziliensis (LB) foi utilizado como antígeno vacinal nestas formulações. Em adição, foi avaliada a resposta imune específica aos adjuvantes isoladamente e nas respectivas composições vacinais: LBSAP (LB+SAP), LBAIF (LB+AIF) e LBMPL (LB+MPL). Como controle, animais foram sensibilizados com salina estéril. Em relação aos dados obtidos sobre o microambiente imunológico induzido pelos adjuvantes vacinais exclusive, nossos principais resultados demonstraram que os três adjuvantes vacinais são capazes de promover o recrutamento de células para o local, sem danos no local do inóculo. Além disso, foram capazes de induzir migração seletiva de neutrófilos, macrófagos e linfócitos. A migração de neutrófilos foi elevada em 12 horas em todos os grupos. Contudo a presença desta população foi mais evidente após a sensibilização com o adjuvante SAP em todos os tempos. No que diz respeito à produção de citocinas, observou-se aumento da produção de IL-2, IL-6 e IL-4, sugerindo um perfil misto de resposta nos animais sensibilizados com saponina. O adjuvante AIF promoveu aumento da produção de TNF-, IFN-, IL-6 e IL-17, nos tempos mais tardios e de IL-4 e IL-10, mais precocemente. Observamos, também, que o adjuvante MPL induziu elevada produção de IL-2, TNF- e IFN-, além de IL-6, IL-17 e IL-10. As alterações do fluxo leucocitário refletiram em modificações induzidas pelos adjuvantes vacinais na pele e nos linfonodos drenantes. Em relação à resposta imune específica frente às diferentes composições vacinais quando associadas ao antígeno total de L. (V.) braziliensis, nós observamos que as diferentes formulações mostraram-se imunogênicas, com aumento do infiltrado celular na pele, o que não foi observado quando o antígeno LB foi inoculado isoladamente. Nos linfonodos drenantes, importantes resultados foram observados no contexto in vitro após estímulo de antígeno de L. (L.) infantum. As formulações vacinais LBAIF e LBMPL apresentaram habilidade de aumentar a capacidade de APCs apresentarem antígenos a linfócitos T, visto pelo aumento do fenótipo de células CD11c+CD86+. Tanto os adjuvantes SAP e MPL isoladamente, quanto às formulações vacinais LBSAP, LBAIF e LBMPL foram capazes de…

Advisors/Committee Members: Alexandre Barbosa Reis, Maria Norma Melo, Paulo Lee Ho, Sergio Coutinho Furtado de Mendonça, Deborah Aparecida Negrao Correa, Nelder de Figueiredo Gontijo, Maria Norma Melo.

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Made available in DSpace on 2019-08-12T02:09:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_luciana__2_.pdf: 1139710 bytes, checksum: 29a6b14b6c7b718e7a4554a9ef0094ac (MD5) Previous issue date: 16

Os triatomíneos são insetos hematófagos e importantes vetores do Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas nas Américas. Um dos principais procedimentos preconizados pelo Programa de Controle da Doença de Chagas (PCDCh) consiste na identificação de residências infestadas e eliminação dos triatomíneos vetores. Os métodos atuais utilizados nos inquéritos entomológicos são considerados caros, precisam de mão de obra treinada e são sujeitos a erros. Sendo assim, é interessante desenvolver novos métodos que auxiliem ou substituem os atuais. Como a saliva dos triatomíneos entra em contato direto com o sistema imune do hospedeiro, uma alternativa atraente é o monitoramento do nível de anticorpos anti-saliva presentes no soro de indivíduos de regiões endêmicas. Sendo assim, os objetivos deste trabalho forma identificar antígenos salivares imunogênicos de triatomíneos e avaliar sua utilização como marcador de contato por Rhodnius prolixus. Para isto, grupos de camundongos foram expostos a altas e baixas infestações por diferentes espécies de triatomíneos e seu soro foi utilizado em ensaios imunoenzimáticos e western-blot para identificação dos antígenos salivares mais imunogênicos. Os antígenos identificados foram purificados e avaliados por ELISA quanto ao reconhecimento cruzado entre as espécies e espécie específico. Os ensaios imunoenzimáticos mostraram que camundongos expostos a altos e baixos níveis de infestação pelo R. prolixus e Triatoma infestans desenvolvem uma resposta espécie específica anti-saliva mediada por IgG. Não foi observada diferença significativa no soro de camundongos expostos a altos e baixos níveis de infestação pelo R. prolixus. O western-blot mostrou que os antígenos mais imunogênicos da saliva de R. prolixus são duas são proteínas 48,5 e 18,2 kDa. A proteína de 48,5 kDa foi purificada e identificada como a apirase salivar do R. prolixus. Resultados do ELISA mostraram que a apirase salivar é reconhecida por anticorpos IgG presentes no soro de camundongos expostos a infestação por R. prolixus, mas não é reconhecida por anticorpos IgG presentes no soro de camundongos expostos a infestação por T. infestans e Triatoma brasiliensis. Buscas realizadas nos bancos de dados (NCBI) identificaram duas apirases expressas na glândula salivar do R. prolixus, sendo uma endógena e uma secretada (provavelmente o antígeno de 48,5 kDa). De forma geral, os resultados indicam que apirase salivar possui potencial para ser utilizada como marcador de contato para R. prolixus, mas novos ensaios devem ser realizados para avaliar a reação cruzada com outras espécies de triatomíneos e com outros artrópodes.

Triatomines bugs are important haematophagous insects and vectors of Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease in America. Identification of triatomine infestations and…

Advisors/Committee Members: Ricardo Nascimento Araujo, Nelder de Figueiredo Gontijo, Silvia Ermelinda Barbosa, Ricardo Wagner de Almeida Vitor, Nelder de Figueiredo Gontijo.

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Made available in DSpace on 2019-08-14T13:04:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mendes_sousa__af_2012.pdf: 1206174 bytes, checksum: b23480d1f995c9d4263372308b274c27 (MD5) Previous issue date: 27

A inibição do sistema complemento humano é uma das atividades presentes na saliva e/ou conteúdo intestinal de artrópodes hematófagos e está envolvida na proteção do epitélio do tubo digestivo desses vetores contra a ação deletéria do complemento presente no sangue ingerido. O objetivo deste trabalho foi investigar a ação da saliva de Lutzomyia longipalpis, o principal vetor de Leishmania infantum nas Américas, sobre as vias clássica e alternativa do sistema complemento de cães, galinhas e cobaias. Para isso, foram realizados para as três espécies ensaios hemolíticos e ensaios do tipo ELISA para detecção de C3b na presença de diferentes concentrações de extrato de glândula salivar. Ambos os testes foram realizados em pH 7,4 e em pH 8,15 (pH do lúmen intestinal do inseto logo após a ingestão de sangue). Com soro de cães, foram realizados os experimentos supracitados apenas em pH 7,4 na presença da proteína salivar recombinante LJM19, descrita como inibidora da via clássica humana. Os resultados mostram que a saliva é capaz de inibir fortemente a hemólise pela via clássica de cães e cobaias em ambos os pHs, mas com fraca intensidade a das aves. Em pH 7,4, a saliva não inibiu a atividade hemolítica da via alternativa de nenhuma das espécies estudadas, mas observou-se forte inibição nos testes com soros de cães, ao aumentarmos o pH para 8,15. Os resultados dos testes de deposição de C3b corroboram aqueles encontrados nos ensaios de hemólise. A proteína LJM19 inibiu significativamente tanto a hemólise quanto a deposição de C3b da via clássica de cães. Pode-se concluir que os inibidores salivares de L. longipalpis atuam de maneira espécie-específica, atuando sobre o sistema complemento de mamíferos, mas não sobre o das aves.

Inhibitors of the complement system (CS) are commonly present in the saliva of haematophagous insects. Experimental evidence suggests that these inhibitors are involved in the protection of the midgut against injury by CS present in the ingested blood. Previous studies have shown that the saliva of the Phlebotomine sandfly Lutzomyia longipalpis (the main vector of American Visceral Leishmaniasis) inhibited the human CS. Our aim was to investigate whether L. longipalpis` saliva inhibit the classical and alternative pathways of the complement system from other animals such as dogs, chickens and Guinea pigs. Erythrocyte lysis assays and ELISA for C3b detection assays were performed with dogs, chickens and Guinea pigs sera in the presence of different concentrations of salivary gland extract at pH 7,4 and 8,15 (the vector´s intestinal pH right after the blood meal). Only with dog sera, these assays were also done in the presence of the recombinant protein LJM19, a salivary inhibitor of the human classical pathway. Our results show that sandfly saliva is capable of strongly inhibiting the…

Advisors/Committee Members: Nelder de Figueiredo Gontijo, Rodrigo Pedro Pinto Soares, Ricardo Toshio Fujiwara.

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Made available in DSpace on 2019-08-14T06:10:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_vladimir_fazito_do_vale.pdf: 1643124 bytes, checksum: 001c47615d17ff134f21e671d87cfe9a (MD5) Previous issue date: 22

O sistema do complemento desempenha um importante papel na imunidade inata e adaptativa, principalmente através da opsonização de organismos invasores, produção de anafilotoxinas e formação de poros na superfície de patógenos. A saliva de Lutzomyia longipalpis, o principal vetor de Leishmania infantum nas Américas, é capaz de inibir tanto a via clássica como a via alternativa do sistema do complemento humano. Este estudo teve o objetivo de ampliar o conhecimento sobre a inibição do complemento por L. longipalpis. Em relação à via clássica, a saliva de L. longipalpis não inibiu a deposição do primeiro componente do complemento, o C1q. Porém, uma expressiva inibição dos componentes seguintes C4b, C3b, C5b e C9 ocorreu quando a saliva estava presente. A formação do complexo de ataque à membrana não foi influenciada pela presença da saliva, indicando um ponto de inibição nas etapas iniciais da cascata. O extrato de glândula salivar foi capaz de inibir a clivagem do C4, mas não atuou inibindo a atividade enzimática do C1s. O modo de atuação da saliva de L. longipalpis parece estar relacionado com o fato do extrato de glândula salivar ser capaz de se ligar ao C1q humano. A proteína salivar responsável pela inibição da via clássica foi identificada como sendo a LJM19, uma proteína recombinante de aproximadamente 11 kDa que é encontrada na saliva como um dímero de 22,3 kDa. A inibição da via alternativa também foi relacionada às etapas iniciais da cascata do complemento. O extrato de glândula salivar foi capaz de inibir a deposição de C3b, fator Bb, C5b e C9. A inibição da deposição do fator Bb, e provavelmente de todos os outros componentes da via alternativa, foi relacionada à capacidade da saliva em impedir a clivagem do fator B. Porém, a saliva de L. longipalpis não foi capaz de inibir diretamente a atividade enzimática do fator D. Além da inibição do complemento pela saliva de L. longipalpis, o conteúdo intestinal também foi testado. Nesse caso, os ensaios de deposição não constataram inibição do C5b para a via alternativa. Para a via clássica, o conteúdo intestinal de L. longipalpis inibiu a deposição de C3b e C5b, sem inibir a deposição de C4b. A presença de inibidores do complemento na saliva e intestino de flebotomíneos deve estar relacionada com a proteção do epitélio intestinal contra os efeitos líticos presentes no sangue ingerido. Além disso, considerando que a opsonização de moléculas (mesmo moléculas solúveis como as proteínas salivares) por C3b aumenta consideravelmente sua imunogenicidade, a inibição do complemento acabaria por proteger essas moléculas salivares de uma resposta imunológica dirigida contra elas

The complement system plays an important role in both innate and adaptive immunity, mainly by the opsonization of invading organisms, anaphylatoxin production and pore formation…

Advisors/Committee Members: Nelder de Figueiredo Gontijo, Aparecida Sadae Tanaka, Marcelo Gustavo Lorenzo, Alvaro Cantini Nunes, Ricardo Toshio Fujiwara.

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Made available in DSpace on 2019-08-12T05:46:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_ajandrade_dpto_parasito_ufmg.pdf: 3679291 bytes, checksum: 25103a911b75a1253c46416523f16d8a (MD5) Previous issue date: 11

Os flebotomíneos apresentam um importante papel na transmissão de espécies de Leishmania, agentes das leishmanioses. Algumas espécies como, Lutzomyia longipalpis sensu lato (s.l.) estão incluídas em um complexo de espécies crípticas, porém para outras como Lutzomyia whitmani pouco se conhece sobre seu status toxonômico. A primeira está envolvida na transmissão de Leishmania infantum chagasi e a segunda de Leishmania braziliensis e Leishmania shawi, responsáveis pelas formas de leishmaniose visceral e cutânea, respectivamente. A biologia e ecologia dessas espécies vetoras, e consequentemente a epidemiologia das leishmanioses, variam de acordo com a região e com a interação destes flebotomíneos com o ambiente e os hospedeiros vertebrados em uma determinada área. Estudos de ecologia química procuram entender o comportamento de flebotomíneos para identificar feromônios sexuais através de análises químicas de hidrocarbonetos, os quais podem ser usados como iscas em armadilhas, sendo utilizadas para o monitoramento das espécies que apresentam importância médico-veterinária. O presente estudo está dividido em duas partes. A primeira objetivou oferecer uma revisão sobre L. whitmani, desde sua descrição original, a fim de elucidar a existência de um possível complexo de espécies crípticas. A Cromatografia Gasosa (CG) foi utilizada para analisar os perfis cromatográficos de populações de flebotomíneos de diferentes regiões do Brasil. A técnica foi padronizada usando L. longipalpis s.l. como modelo. Na segunda parte, a armadilha BG-Sentinela® (BGS) e o cairomônio BG-Lure® (BGL), utilizados no monitoramento de culicídeos, foram avaliados em diferentes condições (altura de instalação, posição do funil de sucção, fonte luminosa) para captura de L. longipalpis s.l. Baseado nesses dados, uma armadilha de baixo custo e de eficiência semelhante a da armadilha luminosa CDC (denominada Leishtrap) foi desenvolvida para captura de L. longipalpis s.l. e L. whitmani. A detecção dos picos cromatográficos e a extração dos Hidrocarbonetos Cuticulares (HCCs) foi padronizada usando um tempo de 50 minutos de corrida no cromatógrafo a gás, sendo utilizados 100 flebotomíneos no tempo de extração de 20 minutos em 1 ml de hexano. Uma menor diferença entre os possíveis HCCs foi identificada entre machos de L. whitmani. O hidrocarboneto C21 não foi encontrado na população do Pará e o C33 foi encontrado somente nas populações de Minas Gerais e do Paraná. Nenhuma grande diferença foi observada entre os HCCs de machos e fêmeas das mesmas populações de L. whitmani exceto para Minas Gerais, onde todos os compostos diferiram entre os sexos. A armadilha BGS não foi eficiente na captura de flebotomíneos quando testada sem fonte luminosa e a luz incandescente tornou a armadilha mais atrativa quando comparada a luz UV, sendo que a…

Advisors/Committee Members: Alvaro Eduardo Eiras, Elizabeth Ferreira Rangel, Eunice Aparecida Bianchi Galati, Mara Cristina Pinto, Adao Aparecido Sabino, Nelder de Figueiredo Gontijo.

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Made available in DSpace on 2019-08-14T10:03:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_doutorado___carlos_henryque_de_souza_e_silva.pdf: 5121081 bytes, checksum: 87a37348e425dce2150dafccf6777f47 (MD5) Previous issue date: 26

Toxoplasma gondii possui importância médica e veterinária, sendo um patógeno oportunista em pacientes imunocomprometidos e fetos de mães recentemente infectadas. Entre novembro/2006 e maio/2007, foram identificados 220 recém-nascidos positivos para IgM anti-T. gondii e suas respectivas mães entre 146.307 crianças estudadas, participantes do Programa Estadual de Triagem Neonatal em Minas Gerais. A toxoplasmose foi confirmada em 190 crianças apresentando anticorpos IgG persistentes até o 12º mês de vida, enquanto 45 tiveram o diagnóstico de toxoplasmose congênita descartado. O objetivo do presente trabalho foi estabelecer uma comparação entre os resultados do teste de ELISA destes recém-nascidos com toxoplasmose congênita, quando utilizados antígenos solúveis (STAg) e recombinantes (rSAG1 erMIC3) de T. gondii, associando as subclasses de IgG aos sinais clínicos encontrados nos mesmos, além de comparar a sorologia das mães e dos recém-nascidos. Foram avaliadas 175 crianças dentre as 190 com toxoplasmose congênita confirmada e 42 dentre as 45 com diagnóstico negativo. As proporções de amostras reativas de recémnascidos infectados e aqueles não-infectados foram distintas ao realizar ELISA utilizando antígenos recombinantes. Todos os antígenos testados apresentaram alta sensibilidade e baixa especificidade para detectar IgG total e IgG1 anti-T. gondii em crianças com toxoplasmose congênita e baixa sensibilidade e alta especificidade para detectar IgG3 e IgG4. Diferença na proporção entre recém-nascidos infectados com mães não-infectadas e recém-nascidos não-infectados com mães infectadas foi observada, demonstrando a produção de anticorpos anti-T. gondii pelo feto infectado durante a gestação. Maior chance de se detectar IgG total anti-T. gondii pelo teste de ELISA em crianças sem lesões oculares quando comparadas com crianças com lesões ativas e cicatrizadas foi observada, enquanto a detecção de IgG2 e IgG4 anti-T. gondii relacionou-se com lesão ocular, quando comparada com crianças sem lesões. Relação entre o ELISA e casos de alterações neurológicas foi observada para IgG2 e IgG4 anti- T. gondii, enquanto IgG3 foi relacionada com crianças sem alterações neurológicas. A partir desses resultados, pode-se afirmar que antígenos recombinantes, em conjunto com a pesquisa de subclasses de anticorpos IgG são importantes ferramentas diagnósticas indiretas capazes de predizer as possíveis alterações encontradas em recém-nascidos com toxoplasmose congênita

Toxoplasma gondii has medical and veterinary importance, being an opportunistic pathogen in immunocompromised patients and fetuses of mothers recently infected. From November/2006 to May/2007 220 newborns positive for IgM anti-T. gondii and their mothers were identified from 146,307 screened babies, participants of the Newborn Screening…

Advisors/Committee Members: Ricardo Wagner de Almeida Vitor, Glaucia Manzan Queiroz de Andrade, Deborah Aparecida Negrao Correa, Nelder de Figueiredo Gontijo, Heitor Franco de Andrade Junior, Neide Maria da Silva.

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Made available in DSpace on 2019-08-13T15:37:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o___alexandre.pdf: 1004904 bytes, checksum: a4585e73440cb22e16874fc5b1e2fa75 (MD5) Previous issue date: 18

Desde os primeiros relatos de leishmaniose visceral no Brasil, o flebotomíneo Lutzomyia longipalpis tem sido incriminado como o principal vetor de Leishmania infantum, agente causador da leishmaniose visceral nas Américas. A saliva do vetor modula a resposta imune do hospedeiro em diferentes níveis, incluindo a inibição da ativação do complemento, tornando-se um componente de grande importância no processo de transmissão desta parasitose. O presente trabalho teve como objetivo mostrar a importância dos inibidores do complemento salivares de L. longipalpis para a sobrevivência de promastigotas de L. infantum quando expostas ao soro humano ou de cães. A quantidade de saliva liberada pelas fêmeas durante o repasto sanguíneo também foi estimada. Considerando que a opsonização com C3b parece ser importante para a fagocitose de Leishmania de uma maneira que evite a ativação de macrófagos, investigamos a deposição de C3b na superfície do parasita na presença ou ausência de saliva por imunofluorescência indireta. Promastigotas em fase estacionária foram parcialmente sensíveis ao soro humano normal (5% de soro matou quase 50% das promastigotas). Observamos uma redução significativa na morte celular quando as promastigotas foram expostas ao soro humano normal na presença de saliva. Este efeito foi dependente da concentração de saliva. Embora apresentem relativa sensibilidade ao complemento humano, as promastigotas apresentaram grande resistência à lise pelo complemento de cães infectados e não infectados. Para todos os hospedeiros, a deposição de C3b foi eficiente na presença e ausência de saliva, mostrando que, embora diminuindo a ação lítica pelo soro humano normal, a saliva não impede a opsonização das promastigotas pelo complemento. Como a saliva favorece a sobrevivência das promastigotas de L. infantum quando expostas ao soro humano, ela poderia ser fundamental no processo de transmissão do parasita ao homem. De modo geral, nossos resultados poderiam explicar por que os cães são mais suscetíveis a serem infectados por L. infantum que os humanos

Since the first reports about visceral leishmaniasis in Brazil, the sand fly Lutzomyia longipalpis has been incriminated as the main vector of Leishmania infantum, the causative agent of visceral leishmaniasis in the Americas. The saliva of the vector modulates the host immune response at different levels, including inhibition of the complement activation, making it a critically important component in the process of disease transmission. This study aimed to show the importance of salivary inhibitors of the complement of L. longipalpis for the survival of L. infantum promastigotes when exposed to both, human and dog serum. The amount of saliva released by females in the byte site during blood feeding was also estimated. Considering that opsonization with C3b seems…

Advisors/Committee Members: Nelder de Figueiredo Gontijo, Ricardo Toshio Fujiwara, Rodolfo Cordeiro Giunchetti, Maria Norma Melo.

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Made available in DSpace on 2019-08-13T09:56:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_corrigida_v_nia_santos.pdf: 1194712 bytes, checksum: 39c9ce61e405c6dc865a9348f7e2514b (MD5) Previous issue date: 10

O controle do pH intestinal em Lutzomyia longipalpis é primordial para o inseto lidar com os diferentes itens de sua dieta. Os flebotomíneos necessitam mudar repentinamente de um pH 6,0, adequado a digestão de açúcares, para um pH próximo de pH 8,0, que aumenta a eficiência da digestão do repasto sanguíneo. Antes da ingestão de sangue, o pH no intestino médio de L. longipalpis é rigorosamente mantido em pH 6,0 por um eficiente mecanismo regulador. Aparentemente, a alcalinização observada seria viabilizada pela volatilização do CO2 presente no sangue ingerido, e também por outro mecanismo ainda não caracterizado até então. Assim, o presente trabalho teve como primeiro objetivo, caracterizar o estímulo inicial, presente no sangue ingerido, responsável pela desativação da manutenção do pH 6,0, e pelo disparo do mecanismo de alcalinização do pH no intestino médio abdominal. De acordo com os nossos resultados, a ingestão de diferentes proteínas (não só aquelas presentes no sangue), induziu o processo de alcalinização do pH intestinal. Aminoácidos livres, na concentração normalmente encontrada no sangue não foram capazes de promover o aumento de pH no intestino médio, mas quando ingeridos em alta concentração, dispararam o mecanismo de alcalinização do pH. Umextrato preparado com o conteúdo de células intestinais foi capaz de promover uma suave alcalinização do pH intestinal quando aplicado diretamente em intestinos dissecados, e previamente acidificados. A serotonina, um hormônio provavelmente liberado na hemolinfa logo após o início do repasto sanguíneo, também foi aplicada em tubos digestivos dissecados, mas se mostrou ineficiente em promover a alcalinização do pH intestinal. A anidrase carbônica parece estar envolvida no processo de aumento do pH intestinal, uma vez que a acetazolamida (inibidor da anidrase carbônica) diminuiu a eficiência de alcalinização do intestino médio abdominal promovida pela ingestão de proteína. Um modelo geral para explicar o mecanismo de alcalinização é sugerido no presente trabalho. Utilizando-se microeletrodos íons sensíveis, foram medidas as concentrações de sódio e potássio no conteúdo intestinal ao longo da digestão do repasto sanguíneo. Foi observado que o sódio diminui, ao passo que o potássio aumenta àmedida que o sangue é digerido. Estes resultados indicam que a manutenção do pH alcalino durante o processo digestivo pode ter relação com o transporte de sódio e potássio entre o lúmen e o citoplasma das células intestinais. Levando-se em consideração a importância do pH intestinal no desenvolvimento de Leishmania intantum em seu vetor, o pH do intestino médio de L. longipalpis infectados foi medido através de microeletrodos H+ sensíveis. Foi observado que, 30h após o repasto sanguíneo, ocorre uma acidificação precoce do pH nos insetos infectados (pH ~7,0), quando…

Advisors/Committee Members: Nelder de Figueiredo Gontijo, Marcos Horacio Pereira, Rodrigo Pedro Pinto Soares, Simon Luke Elliot, Adriano Monteiro de Castro Pimenta, Miguel Jose Lopes.

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Made available in DSpace on 2019-08-11T18:58:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_fernanda_f._rocha_ufmg__vers_o_final_2010_.pdf: 3685777 bytes, checksum: ad772a276a84e3b243a8287a7f0d445c (MD5) Previous issue date: 29

Triatomíneos são insetos hematófagos vetores do Trypanosoma rangeli e do T. cruzi. A capacidade vetorial dos triatomíneos em hospedeiro humano está diretamente relacionada à sua performance alimentar. O objetivo deste trabalho foi obter e padronizar cultivo primário de glândula salivar, canal salivar e intestino médio anterior de triatomíneos para o estudo de moléculas bioativas relacionadas com a hematofagia. As células de glândula salivar de Rhodnius prolixus permaneceram viáveis em cultura por 30 dias. Três tipos de células foram identificados nas culturas de glândula salivar ao MO: o tipo I com células alongadas e fusiformes, o tipo II globosas e com dois núcleos evidentes e o tipo III globosas e uninucleadas. As células do tipo II foram as mais abundantes independentemente da idade do cultivo. O material secretado (MS) das culturas de glândula salivar apresentou as atividades anticoagulante e apirásica e uma maior concentração de bandas na faixa de 15-25 kDa. No cultivo de canal salivar de R. prolixus foram observadas apenas células uninucleares que se apresentaram aderidas ao ducto salivar, formando uma camada única de células justapostas. A partir do terceiro dia de cultivo foram observados grânulos de secreção se formando ao redor das células do canal, indicando que as células estavam metabolicamente ativas e sugerem que o canal salivar possui outras funções além de simplesmente conduzir a saliva em direção as peças bucais do inseto. Entretanto, não foi evidenciada atividade anticoagulante e apirásica no MS do cultivo de canal salivar. Já os cultivos de intestino médio anterior de Triatoma brasiliensis e de T. infestans, ao MO, apresentaram células globosas, geralmente agrupadas. No interior destas células verificou-se a presença de vesículas, sugerindo produção de biomoléculas. No MS dos cultivos intestinais detectou-se as atividades anticoagulante e lisozímica. A adição de ecdisona nos cultivos intestinais de T. infestans alterou o perfil protéico e de atividade anticoagulante em relação ao controle (sem adição de hormônio), sugerindo uma ação inibidora sobre a produção de biomoléculas intestinais. Já a adição de serotonina aparentemente não alterou o perfil protéico e nem das atividades anticoagulante e lisozímica. Entretanto, o teste de viabilidade detectou que a maioria das células intestinais de T. brasiliensis e T. infestans encontraram-se mortas no oitavo dia de cultivo. A curta sobrevida do intestino médio anterior nas condições de cultivo utilizadas no presente trabalho provavelmente dificultou o estudo da influência hormonal sobre a atividade das células intestinais. Nossos resultados demonstraram que é possível obter cultura primária de glândula salivar, canal salivar e intestino médio anterior de triatomíneos para o estudo de biomoléculas in vitro.

Advisors/Committee Members: Marcos Horacio Pereira, Nelder de Figueiredo Gontijo, Alan Lane de Melo, Mauricio Roberto Viana Sant'anna.

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Made available in DSpace on 2019-08-12T23:07:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_veruska_parasitologia_2009.pdf: 1638146 bytes, checksum: fa73e8f8ab07bd724b0d4b6537685bf8 (MD5) Previous issue date: 11

A saliva de artrópodes hematófagos contém biomoléculas envolvidas diretamente ou indiretamente no processo de hematofagia, entre as quais estão moléculas inibidoras do sistema complemento. A função mais óbvia para estes inibidores seria a proteção do intestino médio contra danos causados pelo complemento. Para investigar esta hipótese, ninfas de Triatoma brasiliensis foram forçadas a ingerir soro humano em condições nas quais os inibidores salivares eram incapazes de proteger o intestino. Nestas condições, o epitélio do intestino médio anterior foi marcado e danificado pelo complemento, causando morte celular. Uma vez que a saliva de Aedes aegypti não contém inibidores do complemento, foi formulada a hipótese da possível existência destes inibidores no intestino médio. Assim, a atividade inibitória foi investigada no intestino de A. aegypti, na saliva e no intestino de três espécies de triatomíneos (T. brasiliensis, T. infestans e Rhodnius prolixus) por meio de um método imunológico capaz de determinar o nível de deposição de alguns fatores do complemento (C1q, C3b, ou C4b) na superfície de moléculas ativadoras em microplacas. Esta metodologia permitiu identificar em quais pontos da cascata do complemento as moléculas presentes na saliva ou no conteúdo intestinal de triatomíneos podem inibir o complemento. Foi verificado que tanto a saliva quanto o conteúdo intestinal solúvel das espécies de triatomíneos estudadas não inibiram a deposição de C1q pela via clássica. O conteúdo intestinal solúvel das três espécies de triatomíneos foi capaz de inibir a deposição de C4b pela via clássica. Somente a saliva de T. brasiliensis foi capaz de inibir a deposição de C4b. Ambos, saliva e conteúdo intestinal das três espécies de triatomíneos puderam inibir a deposição de C3b nas vias clássica e alternativa. Nenhum dos materiais extraídos das membranas de células intestinais dos triatomíneos inibiu a deposição de C3b na via clássica. Como esperado, o conteúdo intestinal solúvel de A. aegypti foi capaz de inibir a deposição de C3b pelas vias clássica e alternativa. A existência de inibidores de complemento pode apresentar consequências biológicas importantes tanto para o sucesso na hematofagia dos insetos quanto para o seu papel na interação com seus parasitos.

Advisors/Committee Members: Nelder de Figueiredo Gontijo, Marcos Horacio Pereira, Alessandra Aparecida Guarneri, Alvaro Cantini Nunes, Ricardo Toshio Fujiwara, Marcos Henrique Ferreira Sorgine.

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Made available in DSpace on 2019-08-13T03:47:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ultima_vers_o_disserta__o.pdf: 2105787 bytes, checksum: 2df5820a6b682ad23ea0c5b4600a16a2 (MD5) Previous issue date: 26

A esquistossomose é uma doença que afeta 200 milhões de pessoas em todo o mundo. Apesar dos esforços para controlar esta doença através do desenvolvimento de novos medicamentos ou vacinas, até o momento o número de pessoas afetadas permanece quase inalterado. A fim de melhorar o conhecimento sobre a biologia e aspectos relacionados com o desenvolvimento do parasito, ciclo de vida e de reprodução, o que poderia conduzir à concepção de novas drogas e / ou vacinas, projetos genoma têm sido desenvolvidos para este parasito. Um grande número de genes têm sido descobertos e na era pós-genômica, alguns genes têm sido escolhidos para ser melhor caracterizado. Um gene de S. mansoni envolvido no ciclo celular e apresentando homologia com genes de outras espécies, incluíndo seres humanos, foi selecionado para ser melhor caracterizado. Este gene em Saccharomyces cerevisiae está envolvido no processo de interação com o complexo do spliceosoma. A técnica de complementação fenotípica foi escolhida para determinar se o gene de S. mansoni apresenta a mesma função que o gene de S. cerevisiae. Já foi demonstrado que a supressão deste gene é letal na levedura, por isso, decidiu-se utilizar leveduras diplóides neste trabalho. A supressão do gene nas leveduras foi realizada pela ruptura de um dos alelos através de um evento de recombinação homóloga do gene Dib1, utilizando gene marcador autoxotópico HIS3. Os mutantes foram selecionados em placas contendo os nutrientes necessários exceto histidina. Para identificar o nocaute, os clones obtidos foram analisados por PCR de colônia usando iniciadores específicos. Leveduras nocauteadas para o Dib1 e transfectadas com os plasmídeos contendo o gene Dib1 da levedura (controles positivos), e o Dimp do S. mansoni, foram utilizados para ensaios de esporulação, para verificar se o gene de S. mansoni complementa a função gênica do seu ortólogo em S. cerevisiae. Após experimento de nocaute, 111 clones de leveduras foram obtidas, 45 destas colônias foram testadas por PCR, e destas 6 foram identificados como nocauteadas. Uma destas colônias, então, foi usada para ser transfectada com os plasmídeos construídos. Nenhuma esporulação foi observada em qualquer um dos plasmídeos recombinantes (Dib1 de levedura e Dimp de S. mansoni), sugerindo que a super expressão dos genes bloqueou a esporulação da levedura. O fato das levedura não esporularem quando se utiliza ambos os genes, SmDimp e Dib1 da levedura, pode indicar que eles exerçam função semelhante, nos respectivos organismos. No entanto, novos experimentos precisam ser realizados para esclarecer definitivamente esta questão. Assim, os genes devem ser clonados em plasmídeos com promotores de expressão basal. Desta forma, Espera-se que a esporulação ocorra em níveis basais tornando possível confirmar se o gene SmDimp de S. mansoni pode…

Advisors/Committee Members: Elida Mara Leite Rabelo, Monica Bucciarelli Rodriguez, Nelder de Figueiredo Gontijo.

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Made available in DSpace on 2019-08-12T10:29:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 maria_marta_figueiredo.pdf: 12626487 bytes, checksum: 0de7fb9b1c66751332c9a9b62d9833f3 (MD5) Previous issue date: 19

As leishmanioses constituem um grave problema de saúde pública, sendo a forma visceral (LV) a mais grave. A LV é uma zoonose e o cão representa o principal reservatório doméstico do parasito. Embora 90% dos casos de leishmaniose visceral americana ocorram na região nordeste do Brasil, nos últimos anos, a prevalência e incidência dessa têm aumentado nos estados da região sudeste, dentre os quais Minas Gerais, onde a doença tem sido relatada em várias cidades incluindo Belo Horizonte. Dessa forma, considerando o papel do cão na epidemiologia da LV, a busca por novos parâmetros diagnósticos, característicos dessa infecção nos cães, tem sido proposta.Portanto, o objetivo desse trabalho foi avaliar o padrão e intensidadeinflamatórios, relacionando-os ao parasitismo tecidual, na pele de orelha de cães infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi. Para isso, foi realizado um estudo em 133 cães, sendo 25 não infectados e 108 naturalmente infectados com L. chagasi, diagnosticados pela imuno-histoquímica em pele sã de orelha, sendo 55 procedentes da área metropolitana de Belo Horizonte município de Santa Luzia-MG e 53 da área central. Em paralelo, a pele de dez cães da raça Beagle,experimentalmente infectados com formas promastigotas de L. chagasi, foi avaliada. Após exame clínico dos cães naturalmente infectados, constatou-se maior frequência de animais sintomáticos (75,5%) em relação aos assintomáticos (24,5%), sendo esse quadro verificado especialmente nos cães da área metropolitana. A linfoadenopatia e problemas dermatológicos constituíram os sinais clínicos mais presentes. Perfil inflamatório do tipo crônico foi observado na pele de 51 (92,7%) e 45 (84,9%) cães das áreas metropolitana e central,respectivamente, sendo que correlação positiva, porém fraca, foi observada entre a carga parasitária e a inflamação, uma vez que a presença de formas amastigotas de Leishmania e reação inflamatória não estavam necessariamente relacionadas. A carga parasitária dos cães avaliados diferiu em relação à área geográfica estudada, uma vez que os animais assintomáticos oriundos da área central apresentaram maior parasitismo tecidual. Considerando os animais experimentalmente infectados, diferença estatisticamente inferior foi observada quanto à intensidade da inflamação e ao parasitismo tecidual quando comparados aos dos cães naturalmente infectados. Dessa forma, o padrão inflamatório não deve ser utilizado como característica patognomônica da infecção por L. chagasi e contrariamente à sua intensidade, não parece ser um parâmetro ideal para diferenciar modelos de infecção distintos.

Although 90% of clinical cases of American visceral leishmaniasis (AVL) occur in the northeastern region of Brazil, the incidence of cases in recent years has increased in southeastern states such as Minas Gerais (MG), where the disease has…

Advisors/Committee Members: Wagner Luiz Tafuri, Renato de Lima Santos, Nelder de Figueiredo Gontijo.

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Made available in DSpace on 2019-08-10T20:28:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o___vladimir_fazito_do_vale.pdf: 1358590 bytes, checksum: 4fe12eb32616b43d09db8211b0e4dac9 (MD5) Previous issue date: 18

O flebotomíneo Lutzomyia longipalpis é o principal vetor de Leishmania infantum, o agente etiológico da Leishmaniose Visceral Americana. Apesar da importância desta espécie em saúde pública, não existem na literatura descrições sobre a anatomia interna do tubo digestivo e pouco se sabe sobre os processos digestivos em larvas de flebotomíneos. Sendo assim, este trabalho teve o objetivo de descrever a anatomia do tubo digestivo, determinar o pH na luz intestinal e ainda investigar a digestão de proteínas em larvas de Lutzomyia longipalpis. O intestino médio constitui a maior parte do tubo digestivo e os cecos gástricos estão ausentes. Com o uso de corantes vitais indicadores de pH, foi observado um gradiente de pH, variando de > 9 no interior do intestino médio anterior a 6,5-7 no interior do intestino médio posterior. As endoproteases são secretadas no intestino médio anterior e são capazes de digerir azocaseína em diversos valores de pH, especialmente no pH 11. O uso de vários inibidores mostrou que as endoproteases digestivas são enzimas semelhantes à tripsina e à quimotripsina. Esse resultado foi confirmado com o uso dos substratos L-BApNA e N-CBZ-L-PpNA, específicos para tripsinas e quimotripsinas, respectivamente. Foram observadas 11 bandas (102 a 33 kDa) de atividade de endoproteases no gel de poliacrilamida contendo gelatina como substrato. As tripsinas encontradas no trato digestivo de larvas de L. longipalpis estão solúveis na luz intestinal. Aminopeptidases também foram estudadas com o uso de substratos sintéticos. Essas enzimas estão localizadas na porção posterior do intestino médio, ligadas ao epitélio e com pH ótimo entre 6,5 e 8. Estes resultados estão de acordo com a proposta de que as proteínas são digeridas até pequenos peptídeos dentro do espaço endoperitrófico no intestino médio anterior e estes peptídeos são digeridos em aminoácidos no espaço ectoperitrófico no intestino médio posterior.

Advisors/Committee Members: Nelder de Figueiredo Gontijo, Marcelo Matos Santoro, Luciano Andrade Moreira.

▼ O Triatoma brasiliensis é encontrado nos estados da Bahia e Minas Gerais e é um dos principais vetores da doença de Chagas. Para facilitar a hematofagia, os triatomíneos liberam na pele do hospedeiro vertebrado uma grande variedade de moléculas bioativas presentes na saliva. O sialotranscriptoma do T. brasiliensis apresentou cinco .contigs. com homologia à tripsina. A presença de enzima salivar semelhante à tripsina não é comum em insetos hematófagos. Além disto, a tripsina quando em contato com a pele é capaz de desencadear prurido, o que poderia ser desvantajoso para o inseto, pois aumentaria sua chance de ser percebido ou morto pelo hospedeiro. Neste contexto, o nosso objetivo central foi caracterizar a atividade proteolítica salivar do T. brasiliensis bem como investigar o seu mecanismo de ativação. Tanto o extrato de glândula salivar (EGS) como a saliva de T. brasiliensis apresentaram atividade sobre o substrato cromogênico BApNA. Nas mesmas condições experimentais, a atividade sobre BApNA obtida com o EGS de T. brasiliensis foi maior do que com o EGS de T. infestans e R. prolixus, sendo que esta ultima espécie não apresentou atividade sobre este substrato. A curva de pH (5-10) x atividade permitiu observar que a atividade do EGS de T. brasiliensis sobre o BApNA apresenta dois picos distintos (pH 7,0 e 8,5). Todos os inibidores enzimáticos testados de serino proteases em geral (3,4 DCI) e de tripsina (TLCK e SBTI) foram capazes de inibir a atividade do EGS de T. brasiliensis sobre o BApNA, sobretudo o 3,4 DCI que apresentou uma inibição de 63,9% em pH 7,0 e 75,1% em pH 8,0. Quando se adicionou pepstatina A (um inibidor de aspartil protease) antes do rompimento das estruturas salivares para o preparo do EGS, a atividade proteolítica foi fortemente inibida, sugerindo que a atividade semelhante à tripsina salivar de T. brasiliensis é ativada por uma aspartil protease. Ensaios realizados com o extrato do canal salivar (ECS) mostraram que ele é capaz de ativar a atividade tripsinolítica salivar como também é capaz de hidrolizar um substrato para aspartil proteases (Abz-AINFFSRQEDD-Pp). Os dados obtidos com a centrifugação do ECS sugerem que este componente ativador está ligado à membrana celular. Este conjunto de informações sugere que o T. brasiliensis possui pelo menos duas enzimas com atividade semelhante à tripsina na sua saliva e que estas provavelmente são ativadas quando passam pelo canal salivar antes de serem liberadas na pele do hospedeiro. Além disto, foi possível localizar a expressão de um dos .contigs. de enzima semelhante a tripsina (DQ846808) nas subunidades D1 e D2 da glândula salivar de T. brasiliensis. Também foi possível reduzir a expressão do .contig. DQ 846808 pela técnica do RNAi. Advisors/Committee Members: Marcos Horacio Pereira, Ricardo Nascimento Araujo, Marcos Horacio Pereira, Jorge Luiz Pesquero, Nelder de Figueiredo Gontijo, Ricardo Nascimento Araujo.

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Made available in DSpace on 2019-08-14T15:36:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_ceres.pdf: 990329 bytes, checksum: 2e1afb64c3cf92f892c23251853cb51b (MD5) Previous issue date: 26

Realizou-se um estudo comparativo da ação da saliva de triatomíneos (Triatoma infestans e Panstrongylus megistus) e do predador Belostoma anurum sobre o potencial de ação composto (PAC) de nervo ciático isolado Rattus novergicus e sobre a pulsação do vaso dorsal de Rhodnius prolixus. A saliva de P. megistus inibiu a amplitude do PAC do nervo isolado de rato de forma gradual e reversível. A saliva de T. infestans também inibiu de forma gradual a amplitude do PAC, porém de forma irreversível. Já a saliva de B. anurum, além de reduzir a amplitude do PAC, também interferiu nas fases de repolarização e duração. Quando a saliva das espécies T. infestans, P. megistus e B. anurum foi semipurificada houve uma ação inibitória de forma gradual e reversível sobre a amplitude do PAC, sem alterar as fases de repolarização e duração. Este fato sugere que as moléculas com atividade sobre o PAC, presentes na saliva destes heterópteros, são termo-resistentes e apresentam baixo peso molecular (< 5kDa). Caracterização complementar (extração de lipídeos) sugere que as moléculas bioativas de T. infestans e de B. anurum não são de natureza lipídica. A incubação da saliva semipurificada de B. anurum com protease inespecífica (proteinase K) não inibiu a atividade sobre o PAC, sugerindo uma natureza não protéica da molécula bioativa. Quando testadas sobre a preparação de vaso dorsal isolado de Rhodnius prolixus, a saliva bruta de P. megistus e a semipurificada de B. anurum produziram parada imediata dos batimentos, de forma reversível. Considerando estes parâmetros, é possível que a atividade paralisante presente na saliva dos heterópteros predadores e a atividade anestésica-like encontrada na saliva dos triatomíneos compartilhem as mesmas biomoléculas, que aparentemente vêm sendo mantidas na saliva desses insetos ao longo do processo de evolução. Entretanto, somente a caracterização molecular do componente responsável por estas atividades poderá confirmar definitivamente esta hipótese.

Advisors/Committee Members: Marcos Horacio Pereira, Nelder de Figueiredo Gontijo, Alan Lane de Melo, Lileia Diotaiuti.

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Made available in DSpace on 2019-08-11T03:23:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_ufmg__santos_2006_.pdf: 1161547 bytes, checksum: 8a81595fcfdffb3fe6ebe28151f51980 (MD5) Previous issue date: 6

RESUMOApesar da importância do pH no desenvolvimento de Leishmania e nos processos digestivos que ocorrem no tubo digestivo dos flebotomíneos, não há na literatura, nenhum estudo a respeito do pH e seus mecanismos de controle no intestino médio de Lutzomyia longipalpis. No presente trabalho, utilizamos corantes vitais indicadores de pH e microeletrodos para medir o pH das porções torácica e abdominal do intestino médio de fêmeas de L. longipalpis durante a digestão do repasto sanguíneo. O pH no intestino médio abdominal atinge valores iguais ou superiores a 8,0, enquanto que no intestino médio torácico, o pH é de aproximadamente 6,0. Através de espectrofotometria, foi observado que a atividade da enzima digestiva -glicosidase (que digere sacarose) é cerca de 14 vezes maior no intestino médio torácico do que no intestino médio abdominal de fêmeas de L. longipalpis, durante a digestão do repasto sanguíneo. Assim, conclui-se que a digestão do repasto sanguíneo e dos açúcares ingeridos pelo flebotomíneo é compartimentalizada: açúcares são digeridos em meio ácido no intestino médio torácico, e proteínas são clivadas em meio alcalino no intestino médio abdominal. Introduzindo soluções tamponadas MES ou HEPES (pHs 5,0 e 7,5, respectivamente) no tubo digestivo de L. longipalpis, foi demonstrado que o pH 6,0 do intestino médio é mantido ativamente sem alteração na ausência do sangue. Utilizando a mesma técnica, observou-se que a acetazolamida, um inibidor da anidrase carbônica, dificulta a acidificação do intestino médio de fêmeas de L. longipalpis, quando estas são desafiadas com uma solução tampão HEPES pH 7,5, contendo o inibidor, mas parece não ter influência na alcalinização do meio intestinal, quando o desafio é feito com tampão MES pH 5,0. A anidrase carbônica provavelmente participa da regulação do pH intestinal de L. longipalpis, mas não foi possível detectar por RT-PCR, o produto de transcrição do seu gene, quando utilizamos iniciadores homólogos aos da anidrase carbônica de Anopheles gambiae. Também não foi possível detectar a atividade de anidrase carbônica no tubo digestivo de flebotomíneos com ou sem o repasto sanguíneo através de espectrofotometria. Alimentando fêmeas com tampão fosfato de potássio (alimentação forçada), foi possível demonstrar que íons fosfato não têm envolvimento direto na manutenção do pH no intestino médio de L. longipalpis, pelo menos quando o inseto está sem o repasto sanguíneo. Alimentando fêmeas (em alimentador artificial) com sangue humano degaseificado, observou-se que a retirada do CO2 do sangue pode ter alguma influência na alcalinização do pH intestinal de L. longipalpis, mas provavelmente outros mecanismos participam da alcalinização no intestino médio abdominal durante a digestão do repasto sanguíneo.

Advisors/Committee Members: Nelder de Figueiredo Gontijo, Marcos Horacio Pereira, Evanguedes Kalapothakis, Maria Norma Melo.

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Made available in DSpace on 2019-08-10T08:44:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 raquel_lopes_martins_souza_vers_o_pdf.pdf: 7201325 bytes, checksum: 07efbd57f0a6507724e8204c5e297d87 (MD5) Previous issue date: 10

ResumoMoluscos do gênero Biomphalaria, hospedeiros do Schistosoma mansoni possuem um sistema interno de defesa (SID) que compreende células circulantes denominadas hemócitos e fatores solúveis presentes na hemolinfa. Os hemócitos circulantes estão envolvidos na destruição das larvas de tremátodas, porém o mecanismo pelo qual eles destroem o parasito ainda não está totalmente esclarecido. Como em outros gastropodas, os hemócitos circulantes de Biomphalaria não são uma população homogênea e acredita-se que cada tipo celular está envolvido de maneira diferente na destruição do parasito. Um dos objetivos deste trabalho é o de caracterização morfológica do perfil da população dos hemócitos circulantes, através da citometria de fluxo, de caramujos B. tenagophila Taim (resistente ao S. mansoni), B. tenagophila Cabo Frio (parcialmente suscetível ao S. mansoni) e B. glabrata BH (altamente suscetível ao S. mansoni) durante a infecção pelo S. mansoni. Foi possível identificar duas subpopulações de hemócitos, denominadas população de hemócitos pequenos e de hemócitos grandes. Em B. tenagophila não infectado, da linhagem Taim ou Cabo Frio, os hemócitos pequenos representam cerca de 30 % do total de células circulantes, enquanto os hemócitos grandes cerca de 70 %. Entretanto, em B. glabrata os hemócitos pequenos equivalem a 56 % do total, já os grandes são 44 %. Após a infecção pelo S. mansoni, foram observadas variações no perfil da população dos hemócitos circulantes, principalmente nas primeiras horas de infecção, que correspondem a um aumento da porcentagem de hemócitos pequenos. Estas variações foram ausentes em B. glabrata e significativamente marcantes nas linhagens Taim de B. tenagophila. Durante a inoculação de silica nestes caramujos, a análise por citometria de fluxo, demonstrou uma diminuição significativa na porcentagem de hemócitos pequenos e aumento da população de hemócitos grandes. A diminuição da população de hemócitos pequenos poderia ser justificada pelo fato de a sílica destruir pequenos granulócitos que compõem parte da população de hemócitos pequenos. O tratamento com silica também aumentou a granulocidade dos hemócitos, principalmente na linhagem do Taim de B. tenagophila.Elementos solúveis da hemolinfa atuam sinergicamente com os hemócitos na destruição do parasito, dentre eles a lectina tem sido identificadas. As lectinas são encontradas na hemolinfa de moluscos como um fator que aglutina e opsonisa partícula e que pode mediar o reconhecimento de partículas estranhas e/ou parasito. Em moluscos, as lectinas são secretadas pelos hemócitos e podem estar solúveis na hemolinfa ou serem expressas na superfície destas células. Assim, lectinas e/ou lectinas ligantes podem ser importantesmarcadores de ativação de hemócitos em Biomphalaria. Além disso, a ligação lectina-carboidrato pode…

Advisors/Committee Members: Deborah Aparecida Negrao Correa, Olindo Assis Martins-Filho, Olindo Assis Martins Filho, Nelder de Figueiredo Gontijo, Marcos Pezzi Guimaraes, Naftale Katz, JOSE AUGUSTO NOGUEIRA MACHADO.