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Made available in DSpace on 2019-08-09T22:43:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_vb_corre__o_final_p_s_defesa.pdf: 4762430 bytes, checksum: 04fb2b78cc4f934cdf30d02b7d295e1a (MD5) Previous issue date: 28

O uso de bactérias não patogênicas, como as bactérias lácticas (BL), constitui uma alternativa atrativa e segura para a entrega de vacinas de DNA pela via oral. Lactococcus lactis, uma BL modelo, é considerada GRAS (Generally Recognized As Safe) e, portanto, tem sido amplamente utilizada para a produção e entrega de antígenos e citocinas ao nível de mucosas. Desta forma, L. lactis surge como uma alternativa atrativa para a veiculação de vacinas de DNA. Assim, acredita-se que o uso da linhagem invasiva de L. lactis, expressando o gene FnBPA (Fibronectin binding protein A) de Staphyloccocus aureus, contendo o vector pValac, para a expressão eucariótica do antigénio ESAT-6 (6-kDa early secreted antigenic target) de Mycobacterium tuberculosis, pode representar uma nova estratégia para o controle da tuberculose; uma doença infecciosa que afeta, na sua forma latente, 1/3 da população mundial. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo a utilização de L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6) para a imunização de camundongos e avaliação da resposta imunológica gerada por esta nova estratégia vacinal. Para isto, a linhagem L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6) foi utilizada para a realização de experimentos de imunização oral em camundongos BALB/c, a fim de caracterizar o perfil da resposta imune gerada. Após a imunização, os níveis de citocinas e imunoglobulinas foram medidos por Ensaio Imunoenzimático (ELISA), onde foi verificado uma elevada produção de IFN- pelos esplenócitos murinos imunizados com a linhagem L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6), demonstrando uma resposta imune do tipo Th1, necessária na imunização contra a infecção por M. tuberculosis. Além disto, foi possível detectar a presença de sIgA anti- ESAT-6 no extrato das fezes e cólon dos animais, evidenciando uma resposta imune de mucosas após imunização com a linhagem L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6). Sendo assim, este trabalho constitui o primeiro passo rumo à validação desta nova vacina de DNA baseada em BL geneticamente modificadas.

ABSTRACT The use of non-pathogenic bacteria, such as lactic acid bacteria (LAB), constitutes an attractive and safer alternative for plasmid DNA vaccine deliver by oral route. Lactococcus lactis, the model BL, is considered GRAS (Generally Recognized As Safe) and, therefore, has been extensively used for the production and delivery of antigens and cytokines at the mucosal level. Now, L. lactis arises as an attractive alternative for the delivery of plasmid DNA vaccines. Thus, it is believed that the use of the invasive L. lactis FnBPA (Fibronectin Binding Protein A) strain, containing the pValac vector, for eukaryotic expression of the ESAT-6 antigen (6-kDa Early Secreted Antigenic Target) of Mycobacterium tuberculosis, could represent a new strategy for controlling Tuberculosis; an infectious disease that affects, in…

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Made available in DSpace on 2019-08-13T18:32:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_final_060814_pdf.pdf: 2523945 bytes, checksum: 412a64ce78884b17d17eca22843d6084 (MD5) Previous issue date: 14

O uso de bactérias como veículos para a entrega de plasmídeos vacinais por via das mucosas constitui uma estratégia de vacinação promissora. Neste contexto, bactérias patogênicas atenuadas como Shigella, Yersinia, Listeria e Salmonella vêm sendo utilizadas para a entrega de plasmídeos vacinais às células mamíferas, embora apresentem risco de reversão ao seu fenótipo patogênico. Visando contornar este problema, a utilização de bactérias não patogênicas, tais como as Bactérias Lácticas (BL), vem sendo proposta. Dentro do grupo das BL, Lactococcus lactis vem sendo extensivamente utilizado para a produção e entrega de antígenos e citocinas em nível de mucosas. Estudos envolvendo esta bactéria têm também focado em sua utiilização como veículo para entrega de vacinas gênicas, sendo desenvolvidas linhagens invasivas de L. lactis para aumentar a eficiência de entrega das referidas vacinas às células do hospedeiro. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um plasmídeo replicativo em L. lactis, contendo um cassete de expressão eucariótica, o pValac (Vaccination usig lactic acid bacteria). Assim, o uso de linhagens invasivas de L. lactis para a entrega do vetor pValac expressando o antígeno Ag85A de M. tuberculosis, poderia representar uma nova estratégia para o controle da tuberculose. Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi a construção do plasmídeo vacinal pValac:Ag85A e a verificação de sua funcionalidade in vitro, utilizando células eucarióticas da linhagem CHO (Chinese Hamster Ovary), bem como sua clonagem na linhagem invasiva L. lactis FnBPA+, gerando assim, a linhagem L. lactis FnBPA+ (pValac:Ag85A). Esta linhagem, por sua vez, foi utilizada em experimentos de imunização de camundongos C57BL/6 e as respostas imunes humoral e celular, geradas pela mesma, foram avaliadas. Como um todo, observou-se uma polarização da resposta imune para o padrão Th1, nos animais imunizados com a referida linhagem em relação aos animais dos grupos controles. Além disso, observou-se a produção das imunoglobulinas IgG e sIgA nas mucosas, especificamente na mucosa respiratória. Em suma, este projeto constitui um primeiro passo rumo à validação da eficácia e efetividade de novas vacinas gênicas baseadas em bactérias lácticas geneticamente modificadas, por via de administração em mucosas.

Using bacteria as a vehicle for orally delivering vaccines plasmids is considered a promissing vaccination strategy. Thus, attenuated pathogenic bacteria, such as Shigella, Yersinia, Listeria and Salmonella are being used for delivering plasmids of vaccine type to mammal cells. However, there is a risk of reversing to its wild phenotype. In order to counteract this problem, we propose the use of non pathogenic bacteria, as lactic bacteria (BL). Within the group of lactic bacteria, the Lactococcus lactis is deemed as a model microorganism, which is…

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Made available in DSpace on 2019-08-12T10:34:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 manuscrito_de_disserta__o_pg_gen_tica_fernanda_alvarenga_lima.pdf: 4403808 bytes, checksum: 519a5ead20b0f712117d851296e91465 (MD5) Previous issue date: 6

As superfícies de mucosa são os principais sítios de interação entre o corpo e o meio externo constituindo uma das primeiras linhas de defesa do organismo, sendo consideradas um alvo atraente para a entrega de drogas biológicas. Por isso, nas últimas décadas o desenvolvimento de estratégias mais eficientes para entrega de plasmídeos vacinais e/outerapêuticos às mucosas tem recebido considerável atenção. Assim, o uso de bactérias carreadoras desses plasmídeos, pela rota oral, constitui uma estratégia promissora. Para tanto, a utilização de bactérias não patogênicas como as Bactérias Lácticas (BL), constitui uma opção segura para este propósito. Lactococcus lactis é a BL modelo e vem sendo muito utilizada para a produção e entrega de antígenos e citocinas ao nível de mucosas. Neste contexto, com o objetivo de otimizar a entrega de plasmídeos para células epiteliais humanas, foram construídas linhagens de L. lactis invasivas e também um plasmídeo replicativo em L. lactis, contendo um cassete de expressão eucariótica denominado pValac. Assim, a utilização da linhagem invasiva de L. lactis capaz de entregar o vetor pValac codificando a Interleucina 10 (IL-10) de Mus musculus, uma potente citocina antiinflamatória, poderia representar uma nova estratégia para o tratamento de doenças inflamatórias como as doenças inflamatórias intestinais (IBDs). Assim, este trabalho teve como objetivo construir o plasmídeo terapêutico pValac::IL-10 e verificar a sua funcionalidade, in vitro, assim como a clonagem deste plasmídeo em uma linhagem invasiva de L. lactis, visando o desenvolvimento de uma terapêutica alternativa e mais eficaz contra as IBDs. A sequência codificadora da IL-10 foi obtida a partir de um plasmídeo sintético contendo a ORF da IL-10 de M. musculus e clonada no vetor Zero Blunt® TOPO® e subclonada no vetor pValac. Para avaliação da funcionalidade do plasmídeo pValac::IL-10, células da linhagem CHO (Chinese Hamster Ovary) foram transfectadas com o plasmídeo construído e a expressão da IL-10 por essas células foi avaliada por ELISA, Western Blot, Microscopia Confocal e FACS. Por fim, o plasmídeo pValac::IL-10 foi transformado na linhagem invasiva de L. lactis e a mesma foi então utilizada em um ensaio piloto, in vivo,para avaliar a capacidade terapêutica e imunomoduladora em camundongos com IBD experimental. Enfim, este trabalho constitui um primeiro passo rumo ao desenvolvimento de uma nova estratégia para o controle de doenças inflamatórias além da validação da eficáciae efetividade da linhagem invasiva de L. lactis como veículo para novas terapias e vacinas de DNA.

Mucosal surfaces are the principal sites of interaction between the body and the external environment, constituting one of the first lines of defense of an organism, and as such, are considered to be…

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Made available in DSpace on 2019-08-12T05:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_priscila_f._rodrigues.pdf: 4023298 bytes, checksum: 235f1765ba3a2e0b3821f68cab5bc87d (MD5) Previous issue date: 14

Pentraxina 3 (PTX3) é uma importante proteína inflamatória, componente essencial da resposta imune inata, com função também na deposição de matriz e fertilidade feminina. Além disso, ela também é capaz de se ligar ao fator de crescimento de fibroblasto 2 (FGF2) e inibir as atividades biológicas de indução da proliferação celular e angiogênese promovidas por esse fator. PTX3 se liga a FGF2 no sítio de interação com o seu receptor (FGFR) e impede que a ligação FGF2/FGFR ocorra e, consequentemente, vias de sinalização que ativam genes ligados à proliferação celular, migração, diferenciação, sobrevivência e angiogênese não são ativadas. As neoplasias figuram entre as principais causas de morte mundiais e as estimativas apontam para um aumento de sua incidência no mundo todo. A via de sinalização de FGF é importante na biologia dos tumores por regular a proliferação celular e a angiogênese, processos essenciais para o crescimento e desenvolvimento tumoral. A identificação de inibidores desta via é importante para o entendimento da biologia do câncer e para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas visando controlar o crescimento e a progressão tumoral. PTX3 é um antagonista natural de FGF2 que, além de inibir a proliferação celular e a angiogênese induzidas por esse fator, também é capaz de diminuir o crescimento e volume tumoral in vivo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito biológico de Ptx3 em linhagens de células tumorais murinas derivadas de melanoma melanocítico (B16F10 e B16F1), melanoma amelanocítico (K1735 e K1735 M2) e fibrosarcoma (MC-TGS17-51 e Sal/N). A morfologia das células foi avaliada por microscopia óptica de contraste de fase e a estrutura do citoesqueleto de actina por imunofluorescência. A proliferação celular foi analisada pelo método MTT e o padrão de expressão de genes por RT-PCR. Nas condições dos nossos ensaios, o tratamento com Ptx3 não promoveu mudanças morfológicas nas células ou no padrão de organização da actina nas linhagens K1735 M2 e B16F1. Um maior número de células viáveis em comparação com o controle foi observado nas células tratadas com Ptx3. Foi verificado que todas as linhagens expressam os receptores Fgfr1, 3 e 4. Já a expressão do receptor Fgfr2 foi observada apenas na linhagem de fibrosarcoma Sal/N. Somente a linhagem de melanoma K1735 não apresentou expressão basal de Ptx3 e a linhagem B16F1 a expressão de Fgf2. Nossos dados corroboram os achados de ausência de expressão de Fgfr2 nos tumores, especialmente nos melanomas, e mostram de forma inédita a expressão de Ptx3 em linhagens murinas de fibrosarcomas e melanomas. Os resultados aqui apresentados contribuem para a caracterização funcional de PTX3, e apontam a necessidade de estudos buscando avaliar o seu papel no microambiente tumoral e a possibilidade do seu uso como biomarcador no…

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Made available in DSpace on 2019-08-14T17:39:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_fabricio_fernandes_de_souza___vers_o_final_2013.pdf: 1709213 bytes, checksum: 740b777cf9145ab3d6d0d4ec31460eaa (MD5) Previous issue date: 27

Introdução. O Streptococcus pneumoniae, mais conhecido como pneumococo, é uma bactéria gram-positiva e encapsulada, possuindo mais de 90 sorotipos conhecidos. O pneumococo causa doenças como: pneumonia, meningite, sepse e otite média aguda. Embora existam vacinas disponíveis, todas são baseadas em antígenos polissacarídicos (conjugadas ou não), tornando-as de alto custo e baixa cobertura. Objetivo. O presente trabalho tem como objetivo avaliar o potencial imunogênico e a capacidade protetora da proteína ribossomal L31 recombinante em modelo murino, visando à produção de uma vacina a base de antígenos protéicos conservados. Metodologia. A escolha da proteína ribossomal L31, se deu a partir de um estudo in silico realizado pelo Serviço de Biologia Molecular e Bioinformática da FUNED, onde foi feita a predição de possíveis antígenos protéicos candidatos a vacina, tendo como principais características, a exposição na superfície celular, a conservação entre os vários sorotipos e a possível ação como fator de virulência. Assim, o gene que codifica a proteína ribossomal L31 foi amplificado do genoma de S. pneumoniae, clonado no vetor de expressão pET-21a e conferido por sequenciamentode DNA. A proteína expressa em Escherichia coli foi purificada por cromatografia de afinidade e sua imunogenicidade foi avaliada por Western blot, utilizando-se soros de pacientes com diagnóstico de meningite e soro de coelho imunizado com a proteína L31. Quatro experimentos distintos foram realizados envolvendo a imunização de camundongos com a proteína ribossomal L31 recombinante, a fim de avaliar: (1) a resposta humoral, comparando as vias de administração; (2) a resposta humoral comparando adjuvantes; (3) a produção de citocinas; e (4) bacteremia e a sobrevida após o desafio com S. Pneumoniae. Resultados. O gene foi amplificado e clonado com sucesso, sendo confirmado pelo sequenciamento. A expressão e purificação da proteína L31 foram realizadas com êxito, apresentando um bom rendimento após a purificação. A proteína L31 purificada mostrou-se imunogênica e foi capaz de conferir altos títulos de IgG1 em camundongos, mas não foi o suficiente para reduzir a bacteremia e induzir proteção em camundongos desafiados com S. pneumoniae. Conclusões. Apesar da proteína ribossomal L31 recombinante ser imunogênica e gerar a produção de altos níveis de IgG1, não foi capaz de induzir a proteção. Sendo assim, a continuidade dos estudos será realizada em busca de novos antígenos protéicos, com a finalidade de avaliar sua imunogenicidade e capacidade protetora.

Introduction. The Streptococcus pneumoniae, known as pneumococcus, is an encapsulated gram-positive bacterium, possessing more than 90 known serotypes. Pneumococcus causes diseases such as pneumonia, meningitis, sepsis and acute otitis media. While…

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Made available in DSpace on 2019-08-13T21:08:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o___vanessa_pecini_da_cunha.pdf: 1878762 bytes, checksum: a601f25bd7dc607531e357ae6c83facf (MD5) Previous issue date: 6

A mucosa intestinal possui um complexo sistema imune que está em homeostase com a microbiota. Entretanto, a quebra desse equilíbrio pode contribuir para o desenvolvimento de doenças inflamatórias intestinais (IBDs), como a Doença de Crohn (CD). A CD é uma doença multifatorial, caracterizada por uma inflamação crônica e descontrolada da mucosa intestinal, e sua ocorrência vem crescendo no mundo todo, principalmente em países desenvolvidos. O tratamento é realizado com esteróides, imunomoduladores e cirurgia, contudo, estão atrelados a sérios efeitos colaterais. Assim, diante dessa problemática, há necessidade de desenvolvimento de tratamentos mais eficazes aos portadores dessa enfermidade. Neste contexto, as proteínas do choque térmico, também conhecidas como HSPs, poderiam ser uma interessante alternativa. As HSPs são chaperonas importantes para a sobrevivência das células e são encontradas em todas as formas de vida. Além disso, as HSP60 são consideradas antígenos imunodominantes importantes na regulação das células T efetoras, com grande potencial na diminuição das respostas Th1 e aumento das respostas Th2 e Treg, respostas essas necessárias para o controle da CD. Sendo assim, a utilização de bactérias lácticas, como Lactococcus lactis, para a produção e a entrega de proteínas terapêuticas, como Hsp65, diretamente no interior das células da mucosa intestinal do hospedeiro, pode representar uma nova estratégia para o tratamento da CD. No presente trabalho, foi construída a linhagem invasiva (L. lactis NCDO2118 FnBPA+) e a linhagem invasiva e produtora de Hp65 de Mycobacterium leprae [L. lactis NCDO2118 FnBPA+ (pXYCYT:Hsp65)]. Ambas as linhagens foram capazes de invadir células eucarióticas mais eficientemente que a linhagem selvagem (L. lactis NCDO2118), e, além disso, a linhagem produtora de Hsp65 foi capaz de produzir a proteína citoplasmática recombinante. Com relação à segurança, após a administração intragástrica das linhagens invasivas em camundongos Balb/C imunossuprimidos, essas não foram capazes de translocar através do lúmem intestinal para outros órgãos. Dessa forma, L. lactis NCDO2118 FnBPA+ (pXYCYT:Hsp65) apresenta um grande potencial para a realização de ensaios terapêuticos para a CD experimental.

The intestinal mucosa has a complex immune system that is in homeostasis with the microbiota. However, the breaking of this balance may contribute to the development of inflammatory bowel diseases (IBDs), such as Crohn's disease (CD). CD is a multifactorial disease characterized by chronic, uncontrolled inflammation of the intestinal mucosa, and its occurrence is increasing worldwide, especially in developed countries. Its treatment is performed with steroids, immunomodulators and surgery, however, these are linked to serious side effects. Thus, there is a need to develop more…

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Made available in DSpace on 2019-08-11T13:40:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 manuscrito_igor.pdf: 4470103 bytes, checksum: d171302d35fe64ae8a643534e649eed0 (MD5) Previous issue date: 26

Os grãos de Kefir são caracterizados por uma matrizexopolissacarídica que abriga uma complexa comunidade simbiótica de bactérias e leveduras. A bebida é obtida a partir da fermentação dos microrganismos, constituintes do grão, nos mais variados tipos de meio em que estes podem ser cultivados, destacando o leite bovino e soluções aquosas de sacarose. Os exopolissacarídeospodem apresentar um ou mais tipos de resíduos de monossacarídeos, de modo que a síntese dos homopolissacarídeos envolve apenas um gene enquantoa dos heteropolissacarídeos envolve vários genes. Estas moléculas apresentam inúmeras aplicações biotecnológicas tanto na indústria quanto na área biomédica. No presente trabalho foi realizada a identificação de cepas de lactobacilos produtores de exopolissacarídeos, a caracterização molecular dos genes das enzimas envolvidas na polimerização dos resíduos glicídicos, bem como a caracterização estrutural e avaliação da capacidade imunomodulatória destes biopolímeros. Dentre os 53 lactobacilos isolados de grãos de kefir que foram utilizados, 16 foram considerados produtores de exopolissacarídeo quando cultivados em meio MRS contendo sacarose. As sequências de nucleotídeo das glicosiltransferases de L. kefiranofaciens1P3, L. satsumensis10P e 10P2 e L. parafarraginis12P apresentaram alta identidade entre si e identidade de 74-75% com uma sequência do GenBank referente à mesma enzima de uma cepa de L. hilgardiique também foi isolada de grãos de kefir. Os cinco exopolissacarídeos que foram caracterizados estruturalmente apresentaram apenas glicose na sua cadeia polimérica e ligações (1,6) e (1,4) nas proporções de 92 e 8% respectivamente, sendo identificados como dextranos (1P3, 10P, 10P2, 12P e 19U) e a massa molecular dos mesmos foi superior a 500 KDa. Para avaliar a capacidade imunomodulatória dos exopolissacarídeos, camundongos tratados com os dextranos 1P3, 10P e 10P2 foram comparados com camundongos tratados com salina. Seus efeitos imunomoduladores no intestino delgado dos animais foram avaliados pela produção de IgA e pela expressão das citocinas IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-17, IFN-, TGF- e TNF-. Todos os dextranos estimularam um aumento significativo na produção de IgA. Os animais que receberam dextrano 1P3 apresentaram produção reduzida de IL-10 e TGF-, enquanto os que receberam dextrano 10P2 tiveram aexpressão de TNF-aumentada.

Kefir grains are characterized as an exopolysaccharide matrix, where a symbiotic community of bacteria and yeast are firmly embedded. The beverage is obtained by fermentation of the microorganisms, which compose the grains, in several possible types of growth medium, highlighting cow milk and aqueous solutions of sucrose. Exopolysaccharide can present one or more types of monosaccharide residues, so that homopolysaccharide synthesis involves only onegene while…

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Made available in DSpace on 2019-08-09T22:26:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 camila_prosperi_de_castro_disserta__o_2012.pdf: 1785321 bytes, checksum: f14f3bfee4e7472b77dbe8a3180dad36 (MD5) Previous issue date: 29

Lactococcus lactis, a bactéria láctica modelo, é considerada segura e vem sendo há muito utilizada para produção e entrega de antígenos e citocinas às superfícies de mucosas. Mais recentemente, os estudos envolvendo este microorganismo têm também focado em sua utiilização como veículo para entrega de vacinas de DNA, plataforma vacinal inovadora que envolve a administração de um vetor plasmideano de expressão eucariótica capaz de codificar proteínas imunogênicas ou imunomoduladoras e que apresenta grande potencial como agente profilático e terapêutico. Todavia, a despeito das metodologias de entrega de vacinas de DNA até o momento desenvolvidas apresentarem relativa eficiência na entrega dos plasmídeos vacinais às células hospedeiras, estas são falhas em direcioná-los para o núcleo celular, evento crucial para que a ORF de interesse seja expressa e a vacina de DNA desempenhe sua função. Considerando que o envelope nuclear constitui o maior obstáculo à entrada dos plasmídeos vacinais no núcleo das células alvo, a otimização do direcionamento destes para o núcleo, bem como a transposição desta barreira é de fundamental importância para a eficácia de uma vacina gênica. Com o objetivo de melhorar os níveis de importação nuclear e de expressão gênica a partir de um plasmídeo vacinal desenvolvido por nosso grupo de pesquisa (pValac; Vaccination using lactic acid bacteria), a ser entregue especificamente por uma linhagem invasiva de L. lactis, este trabalho procurou otimizá-lo através da inserção de uma sequência nucleotídica do vírus símio 40 (SV40, do inglês Simian Virus 40), descrita como sendo capaz de direcionar DNA exógeno ao núcleo de células eucarióticas e aumentar a expressão gênica a partir dos plasmídeos que a contenham. Esta sequência, denominada Sequência de Endereçamento Nuclear (DTS, do inglês DNA nuclear Targeting Sequence), foi clonada no vetor pValac e para avaliação da funcionalidade desta construção, a ORF da proteína verde fluorescente (GFP, do inglês Green Fluorescent Protein) foi utilizada como repórter. A avaliação da funcionalidade da construção final pValac::DTS::gfp se deu por meio de sua transfecção em células mamíferas e análises através de microscopia de fluorescência e RT-PCR. Para efeito de comparação entre a expressão de GFP a partir do plasmídeo pValac::DTS::gfp e do plasmídeo controle pValac::gfp, foram realizados ensaios de Citometria de Fluxo. Os resultados mostraram que a presença da DTS no plasmídeo pValac::gfp não foi capaz de aumentar a expressão da proteína GFP, resultados estes que estão em desacordo com a maioria daqueles reportados pela literatura.

Lactococcus lactis, the Lactic Acid Bacteria model, is considered to be safe and has been widely used for the production and delivery of antigens and cytokines to the mucosal level. More recently…

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Made available in DSpace on 2019-08-12T08:45:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_raphael_final_pdfbiblio.pdf: 9451110 bytes, checksum: 0f0d97f3bdeeae07a4ff25117a4605ec (MD5) Previous issue date: 9

Países desenvolvidos têm imposto fortes restrições ao uso de antibióticos como promotores de crescimento na pecuária bovina. Neste cenário, os probióticos se destacam como potenciais substitutos para esses tradicionais promotores de crescimento. Probióticos são micro-organismos vivos que, quando são administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios à saúde do hospedeiro. Seus mecanismos de ação são: antagonismo direto contra patógenos,aumento da eficiência de barreira intestinal e imunomodulação, tendo importantes efeitos protetores contra diferentes doenças, como a salmonelose que representa uma das principais causas de perdas econômicas na pecuária. Vários são os gêneros bacterianos com capacidade probiótica, com destaque para os lactobacilos. Como a maior parte das preparações probióticas para nutrição animal possuilinhagens probióticas humanas não se sabe o efeito de bactérias potencialmente probióticas de origem bovina sobre a saúde do hospedeiro. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de colonização e o efeito imunomodulador dos isolados L36 (L. acidophilus) e L38 (L. salivarius), obtidos de fezes de bezerros.Para avaliar a capacidade de colonização e efeito imunomodulador, foram obtidos camundongos gnotobióticos pela monoassociação dos isolados L36 ou L38 em animais germ-free e acompanhados os níveis populacionais nas fezes ao longo de dez dias. O efeito protetor e imunomodulador dos isolados foram também avaliados em animais convencionais tratados com L36 ou L38 e desafiados com Salmonellaenterica subsp. enterica sorovar Typhimurium. Foram avaliados parâmetros gerais de saúde (variação de peso, índice hepático e esplênico), produção de IgA na mucosa intestinal, aspectos da histologia geral do intestino e fígado e perfil de expressão das citocinas (IL5, IL6, IL10, IL12b, IL17a, Ifng, Tgfb1 e Tnfa) ao longo do intestino, por RT-qPCR. Os isolados L36 e L38 foram capazes de colonizar a mucosa intestinal de animais isentos de germes, apresentados altos níveis populacionais nas fezes (8,87±0,38 Log UFC/g de fezes para L38 e 8,39 ±0,83 Log UFC/g de fezes para L36). Além disso, em animais gnotobióticos, L36 parece estimular a resposta, na mucosa intestinal, do tipo TH17, pois leva a aumentos significativos (p<0,05) dos níveis de expressão de IL6, IL17a, Tgfb1 e Tnfa. Os isolados L36 e L38 apresentaram-se seguros, pois não causaram mudanças nosparâmetros avaliados que são indicativos de infecção local ou sistêmica. Ambos os isolados não foram capazes de estimular a produção de IgA na mucosa, tanto em animais gnotobióticos quanto convencionais, mas reduziram a produção de IgA em animais desafiados com Salmonella. Porém, L38 produziu um perfil de citocinas(aumento de IL5, IL10, IL12b, IL17a, Ifng e Tgfb1) no intestino indicativo de um balanço entre respostas TH…

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Made available in DSpace on 2019-08-12T10:49:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_thayse_batista_moreira.pdf: 2563067 bytes, checksum: 55b623b4386530aac8839fd7637df004 (MD5) Previous issue date: 4

A ancilostomose é uma doença tropical negligenciada que acomete cerca de 740 milhões de pessoas no mundo, sendo a principal causa de anemia em crianças e gestantes. Organismos probióticos atuam no trato gastrointestinal modulando a resposta imune de forma direta ou induzindo a tolerância oral a antígenos. A Hsp65 é uma proteína muito presente em ambientes inflamados, sendo inibida por células TREG específicas. Essa molécula vem sendo utilizada para induzir a expansão deste tipo celular e conferir um ambiente menos propenso a inflamação em doenças com a colite ulcerativa e a doença de Crohn. Neste trabalho, foi avaliado o efeito do uso de duas linhagens de Lactococcus lactis subsp lactis NCDO2118 na ancilostomose experimental, por duas abordagens distintas, usando protocolo para avaliar o feito da tolerância oral à Hsp65 (experimento I) e a modulação direta pelo L. lactis lactis NCDO2118 (experimento II) ambos em hamster (Mesocricetus auratus) infectados com Ancylostoma ceylanicum. No experimento I, os animais foram divididos em seis grupos: não tratado e não infectado (NT + NI), não tratado e infectado (NT + I), tratado com meio M17 e infectado (T + I), tratado com L. lactis lactis NCDO2118 selvagem e infectado (NCDO + I), tratado com L. lactis lactis NCDO2118 contendo o plasmídeo vazio (pXylT:SEC:nuc) e infectado (NCDO R + I), tratado com L. lactis lactis NCDO2118 expressando Hsp65 (pXylT:SEC:hsp65) e infectado (Hsp65 + I). O tratamento foi realizado durante quatros dias, com administração da cultura ad libitum e após intervalo de sete dias, infecção com 50 larvas por via oral (gavagem). Esta infecção foi acompanhada durante 30 dias através da aferição de peso, hemograma, proteínas totais no soro e ovos por grama de fezes (O.P.G.). No dia da eutanásia foi realizada a recuperação de vermes adultos do intestino delgado e linfonodo mesentérico. Neste experimento não foi observado diferença entre os tratamentos nos parâmetros avaliados, não permitindo inferir que foi estabelecida a tolerância oral e que ela interferiu no curso da infecção. No experimento II, os animais foram divididos em grupos: não tratado e infectado (NT + I), tratado com L. lactis lactis NCDO2118 selvagem iniciado com zero dia de infecção (NCDO 0), tratado com L. lactis lactis NCDO2118 expressando Hsp65 (pXylT:SEC:hsp65) iniciado com zero dia de infecção (HSP65 0), tratado com L. lactis lactis NCDO2118 selvagem iniciado aos oito dias de infecção (NCDO 8) e tratado com L. lactis lactis NCDO2118 expressando Hsp65 (pXylT:SEC:hsp65) iniciado aos oito dias de infecção (HSP65 8). Os tratamentos foram administrados durante quatro dias ad libitum. A infecção com 50 larvas infectantes ocorreu no dia zero em todos os grupos. A Infecção foi acompanhada por 30 dias e foram avaliados os parâmetros descritos anteriormente. Os grupos…

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Made available in DSpace on 2019-08-10T05:07:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gen_tica_pablomatiasromoraes_disserta__o.pdf: 2031418 bytes, checksum: f0dc4e045d4f0ea9034d4c1c2d201b00 (MD5) Previous issue date: 16

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva, parasita intracelular facultativa, causadora da linfadenite caseosa (LC), uma doença infecto-contagiosa crônica que acomete pequenos ruminantes e acarreta sérias perdas econômicas para as atividades de ovinocaprinocultura. A ampla ocorrência e importância econômica da enfermidade estimulam estudos sobre as bases moleculares da virulência deste patógeno, cujas informações ainda são escassas. Dentre os fatores moleculares associados à virulência de bactérias patogênicas, têm-se destacado os internalizadores de peptídos (Opp), que são complexos protéicos multi-subunitários, pertencentes à família dos ABC transportadores. Esses internalizadores ficam localizados na membrana plasmática e tem como principal função a captação de peptídeos do meio extracelular para que sirvam como fonte de carbono e nitrogênio. Além do papel nutricional os peptídeos podem ser utilizados, por bactérias Gram-positivas, como moléculas sinalizadoras em um processo de comunicação intercelular, o qual permite às bactérias coordenarem a expressão de determinados genes em uma escala populacional. O controle de diversos processos celulares já foi relacionado ao mecanismo de comunicação via peptídeos sinalizadores dentre os quais incluem: esporulação, conjugação e virulência. Com o objetivo de se estudar o papel do transportador de peptídeos (Opp) na bactéria C. pseudotuberculosis foi construída uma linhagem mutante para o transportador Opp utilizando um plasmídeo suicida. Essa linhagem foi crescida na presença do peptídeo tóxico glutationa (GSH) nas concentrações de 5mM e 10 mM, como forma de se obter uma confirmação fenotípica da perda da capacidade da linhagem mutante em internalizar peptídeos. Porém, a linhagem mutante se mostrou sensível aos efeitos tóxicos do GSH, demonstrando que esse peptídeo pode estar sendo internalizado pela bactéria por uma via diferente do Opp ou que não exista a necessidade dele ser internalizado para ser tóxico à bactéria. Posteriormente, através de uma análise proteômica comparativa entre as proteínas extracelulares das linhagens selvagem e oppD mutante, utilizando 2-DE, foi gerado mapas protéicos que demonstraram a presença de 11 spots exclusivos na linhagem selvagem e 17 spots exclusivos na linhagem mutante. Esse resultado indica que o transportador Opp pode estar relacionado a algum processo de controle da expressão gênica em C. pseudotuberculosis. Por fim, para verificar se o transportador de peptídeos de C. pseudotuberculosis possui alguma relação com a virulência e patogenicidade dessa bactéria foram realizados ensaios in-vitro, de adesão e colonização de macrófagos, e in vivo, de infecção de camundongos BALB/c. Os resultados desses ensaios demonstraram que apesar da linhagem mutante possuir uma capacidade reduzida de…

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Made available in DSpace on 2019-08-09T18:17:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_de_mestrado_egidio_paulo_francisco_nhavene.pdf: 1780906 bytes, checksum: 0acf7a868c399a484bf2a11b5c1afe05 (MD5) Previous issue date: 31

O Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei são protozoários parasitas causadores da Tripanossomíase Americana e Africana. Ambos são caracterizados pela presença de um flagelo simples e um cinetoplasto que é uma mitocôndria única e alongada que ocupa grande parte do volume celular, concatenados em uma rede de DNA. Apresentam também características morfológicas muito homogêneas, definidas em função da posição do cinetoplasto em relação ao núcleo e da presença ou não de flagelo livre e membrana ondulante. No interior dos hospedeiros invertebrados insetos ocorrem sob a forma tripomastigotas metacíclicos e epimastigotas; e nos hospedeiros vertebrados mamiferos ocorre sob a forma amastigota e tripomastigota sanguíneo. O sequenciamento do genoma desses parasitos revelou a existência de genes relacionados à manutenção do DNA tais como: a reversão direta das modificações de base por processos de dimetilação e por ação das fotoliases ou dioxigenases ou ainda por retirada de bases incorporadas erradamente no DNA recém-replicado pelo MMR, retirada de danos volumosos por NER e retirada de bases incorporadas erradamente pelo BER, reparo de DSB e SSB por HR. Dentre as vias de reparo acima descritas, a Fotorreativação é um mecanismo de reparo direto que utiliza fotoliases para catalisar a reversão de dímeros de pirimidina em monômeros. Existem vários tipos de fotoliases de acordo com a sua especificidade de substrato. Outro mecanismo que repara as lesões induzidas por UV é o NER, que se subdivide em duas subvias: Reparo do Genoma Global e Reparo Acoplado a Transcrição. O T. brucei possui dois genes da fotoliase, um nuclear codificador da fotoliase criptcromo DASH e outro mitocondrial codificador da CPD fotoliase I. No entanto, o T. cruzi possui apenas o gene da fotoliase mitocondrial criptcromo DASH. No presente trabalho estudamos o efeito da irradiação, por luz UV, em T. cruzi selvagens, T. cruzi superexpressor do gene da fotoliase nuclear de T. brucei, T. cruzi deficientes no gene CSB (heminocaute) e T. cruzi heminocaute no gene CSB que superexpressa o gene da fotoliase nuclear de T. brucei. Os resultados obtidos mostraram que o T. cruzi que superexpressa o gene fotoliase nuclear de T. brucei são mais resistentes à radiação UV do que o tipo selvagem. Outro dado importante é que as células selvagens, quando colocadas por 60 minutos sob a luz branca, após tratamento com luz UV, não retornam o crescimento. Não se verificou a mesma atividade em células deficientes no gene CSB. Esses dados sugerem que a fotoliase de T. brucei é funcional e a sua atividade é dependente da ação do gene CSB.

The Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei are the protozoa parasites that cause African and American trypanosomiasis. Both are characterized by the presence of a single flagellum, a kinetoplast, which…

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Made available in DSpace on 2019-08-11T01:27:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_j_ssica_vers_o_final.pdf: 4849839 bytes, checksum: f275e2af1c06fd42baaa66ca3f7d4654 (MD5) Previous issue date: 17

Streptococcus pneumoniae é uma bactéria Gram-positiva de ampla dispersão mundial. É o principal agente etiológico de infecções pulmonares, meningite e sepse, sendo classificados mais de 90 sorotipos. Embora as vacinas existentes, baseadas em antígenos polissacarídeos, sejam eficientes, elas não conferem proteção contra vários sorotipos, e têm-se observado surgimento de doenças causadas por sorotipos não inclusos nas vacinas. Com o intuito de superar essas desvantagens e conferir uma proteção mais ampla, busca-se o desenvolvimento de uma vacina baseada em antígenos proteicos conservados entre os diferentes sorotipos de S. pneumoniae. Neste trabalho, selecionamos a proteína Sortase A (SrtA) que está ancorada a membrana do S. pneumoniae e possui um importante papel no processamento de proteínas de superfície. O objetivo foi avaliar as características imunogênicas da SrtA e o nível de conservação de sua sequência entre diferentes linhagens de S. pneumoniae através de análises in silico, além de avaliar seu potencial protetor em modelo animal. A partir das análises in silico foi possível determinar que a SrtA apresenta um peptídeo sinal compreendendo os resíduos Met1 até Asp10 e uma hélice transmembrana entre Lis13 a Tre35. Sequências SrtA de diferentes linhagens de S. pneumoniae foram alinhadas e as análises demonstraram 99% de identidade. Além disso, foram feitas predições de epítopos que demonstraram que a proteína SrtA possui três potenciais regiões antigênicas para ativação de linfócitos B. Já com relação aos epítopos de linfócitos T foram preditos epítopos na região entre os aminoácidos 33 e 137. Para confirmar a funcionalidade da SrtA como potencialmente imunogênica, o gene srtA foi clonado no vetor de expressão heteróloga pET-21a. A proteína foi expressa em Escherichia coli e após a sua purificação, sua imunogenicidade foi avaliada por Western blot utilizando soro de coelho imunizado com SrtA. Camundongos Swiss Webster foram imunizados com SrtA recombinante por via intraperitoneal e a resposta humoral foi analisada indicando que a proteína induziu a produção de IgG específica, caracterizada por uma alta taxa de IgG1 e IgG2a. Os camundongos foram desafiados e a resposta inflamatória foi avaliada. Os resultados indicaram que a SrtA é capaz de controlar o infiltrado celular no pulmão, mas não é capaz de modular o perfil de células inflamatórias. O potencial protetor da SrtA também foi avaliado utilizando como rotas de desafio as vias intranasal ou intraperitoneal. Observou-se que a SrtA é capaz de conferir proteção aos camundongos vacinados. Em conclusão, foi possível mostrar que a proteína SrtA é altamente conservada, entre diferentes linhagens de S. pneumoniae, e que é altamente imunogênica, gerando efeito protetor, in vivo. Estes resultados demonstram o potencial multivalente da SrtA para o…

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Made available in DSpace on 2019-08-14T20:21:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_completa_2011.pdf: 5508692 bytes, checksum: 05a09899a66ecb14396adaeda2e067ee (MD5) Previous issue date: 31

Uma nova tecnologia de sequenciamento de cDNA tem permitido uma análise detalhada e aprofundada dos transcritos em procariotos. Corynebacterium pseudotuberculosis, uma bactéria causadora de doenças, como a linfadenite caseosa, que trazem grandes prejuízos econômicos para o agronegócio mundial, foi o alvo de nossos estudos. Neste contexto, caracterizamos o perfil transcricional diferencial deste microrganismo em algumas condições que simulam o ambiente encontrado pela bactéria no hospedeiro no processo de infecção como, estresse osmótico (2M), térmico (50°C) e acidez (pH=5). No presente estudo escolhemos a plataforma SOLiDTM para tentar compreender o desenvolvimento da doença e a modulação da resposta a partir dos genes envolvidos no processo da infecção. Conseguimos detectar todas as regiões transcricionalmente ativas preditas no genoma (2057 genes), sendo que na condição controle (condição fisiológica normal), foi possível observar que 97,58% dos genes são transcritos, apresentando 2,42% de região não transcrita com valor de RPKM (Reads Per Kilobase of coding sequence per Million mapped) igual a zero. Nas condições de estresse osmótico, estresse térmico e acidez, 98,05%, 97,34%, 97,81% dos genes são transcritos, respectivamente. Dos 2064 transcritos do estresse osmótico, 48,01% foram considerados diferencialmente expressos em relação ao controle, 45,68% genes considerados diferencialmente expressos no térmico e no estresse ácido, 48,08%. Grande parte dos genes em todas as condições, induzidos ou reprimidos foi composta por proteínas de funções desconhecidas (hipotéticas) confirmando quão pouco este microrganismo é caracterizado. As análises revelaram uma forte correlação entre resposta ao estresse ácido e expressão de genes relacionados à virulência. O processo de regulação da transcrição e adesão celular estão entre os principais resultados do Blast2GO. No estresse osmótico processo de reparo e transporte transmembrana foram destaques, além do processo de adesão. No estresse térmico, menor número de genes diferencialmente expressos fizeram parte da análise e entre os principais processos estão o de oxidoredução e catabólico de ATP, gerando energia para célula sobreviver no ambiente hostil. Dentro do core estimulon (genes compartilhados entre os estresses), genes de virulência se destacaram, demonstrando que já no inicio da fase exponencial a bactéria regula a transcrição para uma resposta específica e adaptativa. Entre os reprimidos, os genes envolvidos no processo metabólico e biossintéticos foram os mais representados, demonstrando redução no crescimento, que é uma importante estratégia de ajuste da fisiologia celular para uma nova condição. O presente estudo permitiu criar um catálogo gênico que é utilizado como recurso para sobrevivência dentro de ambientes prejudiciais e conseguir escapar da resposta…

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Made available in DSpace on 2019-08-10T09:28:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_wanderson__1_.pdf: 2515675 bytes, checksum: 7278e432f1ffdb5036fcd60c0aab66c6 (MD5) Previous issue date: 18

A Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente etiológico da linfadenite caseosa, doença infecto-contagiosa crônica que acomete pequenos ruminantes. Os principais fatores de virulência desta bactéria são a exotoxina fosfolipase D e lipídios tóxicos da parede celular. Estudos demonstraram que proteínas extracelulares são importantes para: aquisição de nutrientes, interação com hospedeiro, sobrevivência da bactéria em diversos ambientes e por tanto representam alvos para a produção de vacinas de métodos de diagnóstico. Os genomas das linhagens 1002 e C231 de C. pseudotuberculosis isoladas de caprino do Brasil e de ovino da Austrália respectivamente foram seqüenciados e predições in silico geraram uma lista destas proteínas com suas prováveis funções. Neste trabalho, através de abordagens proteômicas, foi realizada uma analise comparativa entre proteínas extracelulares das duas linhagens para gerar mapas proteícos, avaliar a diferença de expressão e validar os resultados preditos in silico. As amostras protéicas foram obtidas através da técnica de fracionamento em três fases. Para estudar a diferença de expressão foi utilizada a técnica de 2D-DIGE que após a análise por espectrometria de massa resultou na caracterização de 10 proteínas, 5 na linhagem 1002 e 5 na linhagem C231, relacionadas a fatores de virulência, resposta a estresse, componentes estruturais e funções desconhecidas. Através da associação 2-DE/MALDI-TOF MS/MS foi possível gerar mapas protéicos e caracterizar 55 e 45 proteínas extracelulares das linhagens 1002 e C231 respectivamente. A união dos dados obtidos neste trabalho com os resultados obtidos Pacheco et al. (2011), possibilitou caracterizar experimentalmente 104 proteínas do exoproteoma de C. pseudotuberculosis. Este estudo demonstrou que, mesmo sendo bactérias da mesma espécie, há diferenças de expressão e a presença de proteínas específicas para cada linhagem, estando estas relacionadas a fatores de virulência e fisiologia celular que podem influenciar no mecanismo de infecção e adaptação ao hospedeiro, favorecendo a progressão e instalação da doença. Além disso, este trabalho abre perspectivas para estudos específicos com as proteínas identificadas, para possível aplicação no desenvolvimento de métodos de diagnóstico e vacinas.

Corynebacterium pseudotuberculosis is the etiological agent of caseous lymphadenitis - a chronic infectious disease that affects small ruminants. The main virulence factors of this bacterium are exotoxin phospholipase D and toxic lipid on cell wall. Studies have shown that extracellular proteins are important for: nutrient acquisition, interaction with the host, survival of bacteria in different environments and targets for vaccine production and methods for diagnosis. The genomes of strains 1002 and C231 of C. pseudotuberculosis isolated from Brazil…

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Made available in DSpace on 2019-08-13T01:32:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_sintia_silva_de_almeida.pdf: 132282 bytes, checksum: 32c2a8cfc0bf84409bbadc4779153f9c (MD5) Previous issue date: 19

A linfadenite caseosa (LC) é uma doença causada por Corynebacterium pseudotuberculosis, que acomete principalmente caprinos e ovinos. Esta enfermidade é responsável por perdas econômicas significativas relacionadas à produtividade dos animais infectados. E, apesar de sua importância, atualmente não existem vacinas, diagnóstico e tratamentos satisfatórios para LC. No presente trabalho, foi utilizada a ferramenta Phage Display a qual seleciona peptídeos através de bacteriófagos geneticamente modificados para expressar aleatoriamente sequências de peptídeos na sua superfície. Estas bibliotecas têm demonstrado sucesso em numerosas aplicações, como mapeamento e mimetismo de antígenos reconhecidos por anticorpos, desenvolvimento de vacinas, e em testes de imunogenicidade. Sendo assim, este trabalho teve como objetivos selecionar e identificar pela técnica de Phage Display peptídeos ligantes específicos para proteínas secretadas e/ou excretadas e totais de C. pseudotuberculosis linhagem 1002. Para isso foi utilizada uma biblioteca comercial de 12 peptídeos lineares (Ph.D.-12 mer - New England Biolabs - NEB) e após três ciclos de seleção foram obtidos 366 peptídeos, sendo que 116 são seqüências distintas. Foram realizadas análises in silico desses peptídeos com o proteoma predito de C. pseudotuberculosis, onde apresentaram similaridade com proteínas envolvidas na sinalização, nutrição, metabolismo, patogênese bacteriana e fatores de transcrição entre outras. A reatividade e especificidade dos clones isolados foram testadas por ELISA e Spot síntese. Através de imunoensaios para ambas as metodologias foi possível selecionar 12 peptídeos (dos 116 identificados por Phage Display), entre os quais três foram sintetizados, agregados a duas formulações distintas de lipossomas, uma com fosfatidilcolina hidrogenada (HPC) e a outra com fosfatidilcolina de soja (SPC), e utilizados em ensaios de imunização de camundongos BALB/c. A imunização com os peptídeos sintetizados foi capaz de induzir uma elevada resposta imune do tipo Th1 antes da infecção. Após o desafio, foi observada uma produção elevada de IFN- nos animais imunizados tanto com peptídeo/SPC quanto com peptídeo/HPC, e os níveis de IL-10 foram mais elevados nos animais imunizados com peptídeo/SPC. Em contraste, camundongos dos grupos controle exibiram baixos níveis de IFN e de IL-10. A identificação de novos antígenos ou genes específicos de C. pseudotuberculosis pode prover novos biomarcadores específicos potencialmente antigênicos para a obtenção de antígenos candidatos à vacina e diagnósticos subclínicos mais acurados para o controle e erradicação da LC.

The Caseous Lymphadenitis (CL) is a disease caused by Corynebacterium pseudotuberculosis, which affects mainly sheep and goats. This illness is responsible for significant economic losses related to…

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Made available in DSpace on 2019-08-09T22:40:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o___vers_o_final.pdf: 4184059 bytes, checksum: fdc546b22ff08ee42c646302bbaa7e62 (MD5) Previous issue date: 28

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva, causadora da linfadenite caseosa em ovinos e caprinos. Para causar uma infecção bem sucedida, este patógeno intracelular facultativo precisa responder de modo eficiente às alterações do ambiente extracelular, sendo capaz de sobreviver às condições adversas encontradas no organismo hospedeiro. Um dos principais mecanismos utilizados por bactérias patogênicas para alcançar este objetivo consiste na ativação transitória de genes específicos de resposta aos estresses ambientais extracelulares por fatores sigma (s) alternativos da RNApolimerase. Com o seqüenciamento do genoma de C. pseudotuberculosis pela Rede Genoma de Minas Gerais e Rede Paraense de Genômica e Proteômica, foi possível identificar sete fatores sigma alternativos nesta bactéria: os fatores sigma B, C, D, E, H, K e M. Dentre estes, destaca-se o fator sH, o qual tem sido associado à irulência em Mycobacterium tuberculosis, uma bactéria filogeneticamente próxima de C. pseudotuberculosis, e à regulação de componentes importantes da resposta aos estresses térmico e oxidativo tanto em M. tuberculosis quanto em Corynebacterium glutamicum. Neste contexto, nosso grupo de pesquisa tem se dedicado ao estudo do papel dos fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis na resposta a diferentes condições de estresse in vitro e na virulência da bactéria. Neste trabalho, foi construída uma linhagem de C. pseudotuberculosis deficiente para o fator sH, utilizando-se um plasmídeo que não se replica nessa espécie bacteriana, e foi avaliada a resistência desta linhagem aos estresses ácido, térmico, oxidativo e osmótico, in vitro, por meio da comparação das curvas de crescimento da linhagem mutante para o fator sH e da linhagem 1002 selvagem quando expostas às diferentes condições de estresse. Não foram observadas diferenças significativas na susceptibilidade da linhagem mutante para o fator sH aos estresses ácido, térmico e oxidativo em relação à linhagem 1002 selvagem. Contudo, foi verificado que esta linhagem é significativamente mais susceptível ao estresse osmótico do que a linhagem 1002 selvagem,indicando que o fator sH deve desempenhar um papel importante para a resposta da bactéria a esta condição de estresse e, possivelmente, para a sua sobrevivência no interior dos macrófagos e para a sua virulência

Corynebacterium pseudotuberculosis is a Gram-positive bacterium, which causes caseous lymphadenitis in sheep and goats. In order to cause a successful infection, this facultative intracellular pathogen needs to respond efficiently to changes in the extracellular environment, thus, being able to survive to the harsh conditions encountered in its hostorganism. One of the main mechanisms used by pathogenic bacteria to achieve this goal is the transient activation of specific genes in…

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Made available in DSpace on 2019-08-14T14:08:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_final_thais.pdf: 2364859 bytes, checksum: 91bbcb6a3759601144438fc8bce8720a (MD5) Previous issue date: 2

Os membros do gênero Brucella são bactérias Gram-negativas, intracelulares facultativas que podem causar infecções crônicas em mamíferos. Várias tentativas têm sido feitas com o objetivo de se obter uma vacina eficaz para esta doença. No entanto, apesar de conferir proteção, as vacinas comerciais atualmente disponíveis apresentam desvantagens, tais como a interferência no diagnóstico de animais infectados e resistência a antibióticos. Considerando LPS Brucella de um dos seus principais fatores de virulência, nós interrompemos o gene wbkC da Brucella abortus, que está relacionado com a biossíntese do seu LPS. Mais especificamente, o gene wbkC catalisa a conversão de GDP-4-NH2-4,6 dideoximanose em GDP-4-formamido-4,6 dideoximanose, que é a unidade monomérica do antígeno-O presente no LPS da Brucella. Neste trabalho foram gerados mutantes pela estratégia de recombinação homóloga dupla para a linhagem selvagem Brucella abortus S2308 vacinal e S19. Nas análises in vitro realizadas em macrófagos de medula óssea, foram observadas alterações na sobrevivência e tráfico intracelular dos mutantes em comparação com as linhagens parentais. Também foram realizados experimentos in vivo em camundongos C56BL/6 e knockout para IRF-1 (fator regulador de interferon-1). As linhagens mutantes wbkC apresentaram uma menor persistência em ambos os modelos murinos analisados, mostrando o papel fundamental deste gene na virulência da Brucella abortus. Experimentos de proteção revelaram que as linhagens mutantes wbkC induziram uma menor imunidade protetora em camundongos C56BL/6 quando comparados à linhagem vacinal lisa S19, no entanto o mutante ÄwbkC S2308 mutante apresentou o mesmo nível de proteção observado para a cepa da vacina rugosa RB51.

Members of genus Brucella are Gram negative, facultative intracellular bacterial pathogens that can cause chronic infections in mammals. Several attempts to get an efficient vaccine have been developed. However, in spite of conferring protection, the vaccines currently commercial available show disadvantages as diagnostic interference and resistance to antibiotics. Considering Brucellas LPS one of its main virulence factors, we disrupted Brucella abortus wbkC gene which is related to LPS biosynthesis pathway. More specifically, wbkC catalyzes the GDP-4-NH2-4,6 dideoximanose conversion in GDP-4-formamido-4,6 dideoximanose, the monomeric unit of antigen-O present in Brucella LPS. Mutants for smooth wild type Brucella abortus S2308 and vaccine strain S19 were generated by double recombination strategy. In vitro analyses were performed in bone marrow macrophages, were we observed alteration in intracellular survival and trafficking of the mutants compared to the parental strains. In vivo experiments in C56BL/6 and IRF-1 (interferon regulation factor-1) knockout mice models were also performed.…

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Made available in DSpace on 2019-08-11T08:24:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta_ao_final_vanessa_pdf.pdf: 4847471 bytes, checksum: 9b97260bb9b268fd147df853dfa228ba (MD5) Previous issue date: 16

O uso de bactérias como veículos para a entrega de plasmídeos vacinais pela rota oral constitui uma estratégia de vacinação promissora contra diversas doenças infecciosas. Para isto, bactérias patogênicas atenuadas como Shigella, Listeria e Salmonella vêm sendo utilizadas, ainda que as mesmas apresentem risco de reversão ao seu fenótipo selvagem. Sendo assim, a utilização de bactérias não patogênicas poderia constituir uma alternativa mais segura para este propósito. Lactococcus lactis é uma bactéria láctica modelo considerada GRAS (Generally Recognized As Safe) que vem sendo extensivamente utilizada para a produção e entrega de antígenos e citocinas ao nível de mucosas. Assim, L. lactis pode representar uma alternativa para a entrega de plasmídeos vacinais em relação aos patógenos atenuados, ainda que o mesmo não tenha capacidade invasiva. Neste contexto, foram construídas linhagens de L. lactis invasivas (L. lactis FnBPA, Innocentin et al., 2009) e também um plasmídeo replicativo em L. lactis, contendo um cassete de expressão eucariótica (pValac, Guimarães et al., 2009). Assim, a utilização de uma linhagem invasiva de L. lactis contendo o vetor pValac para a expressão eucariótica do antígeno ESAT-6 (6-kDa Early Secreted Antigenic Target) de Mycobacterium tuberculosis, pode vir a ser uma nova estratégia para o controle da tuberculose; uma doença infecto-contagiosa que atinge 1/3 da população mundial na forma latente. Desta forma, este trabalho teve como objetivo a construção do plasmídeo vacinal pValac:ESAT-6 e verificação de sua funcionalidade, in vitro, assim como a clonagem na linhagem invasiva de L. lactis para sua utilização como uma via de entrega oral de vacinas gênicas. A seqüência codificadora de ESAT-6 foi isolada por PCR a partir do DNA genômico de M. tuberculosis linhagem H37Rv para clonagem no vetor Zero Blunt® TOPO® e posteriormente no vetor pValac. A construção final, pValac:ESAT-6, foi primeiramente obtida em Escherichia coli TG1. Para a avaliação da funcionalidade do plasmídeo, células da linhagem CHO (Chinese Hamster Ovary) foram transfectadas com o plasmídeo pValac:ESAT-6 e a expressão de ESAT-6 foi avaliada por RT-PCR, Western blotting e Imunocitoquímica, sendo, a funcionalidade do plasmídeo pValac:ESAT-6, assim confirmada. Por fim, o plasmídeo pValac:ESAT-6 foi transformado na linhagem invasiva de L. lactis, gerando a linhagem L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6). Enfim, este trabalho constitui um primeiro passo rumo à validação da eficácia e efetividade de novas vacinas gênicas baseadas em bactérias lácticas geneticamente modificadas, por via de administração oral em mucosas; o que também poderá fornecer informações valiosas para a pesquisa e o desenvolvimento de vacinas contra outros patógenos.

The use of bacteria as vehicles for the delivery of vaccine plasmids by oral route…

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Made available in DSpace on 2019-08-14T08:16:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta_ao_carol8.pdf: 1677378 bytes, checksum: 19a2d74853f9b2b31ada27c3cee081f2 (MD5) Previous issue date: 3

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva, causadora da linfadenite caseosa em ovinos e caprinos. Para causar uma infecção bem sucedida, este patógeno intracelular facultativo precisa responder de modo eficiente às alterações do ambiente extracelular, sendo capaz de sobreviver às condições adversas encontradas no organismo hospedeiro. Um dos principais mecanismos utilizados por bactérias patogênicas para alcançar este objetivo consiste na ativação transitória de genes específicos de resposta aos estresses ambientais extracelulares por fatores sigma alternativos da RNA polimerase. Com o seqüenciamento do genoma de C. pseudotuberculosis pela Rede Genoma de Minas Gerais e Rede Paraense de Genômica e Proteômica, foi possível identificar sete fatores sigma alternativos nesta bactéria: os fatores sigma B, C, D, E, H, K e M. Dentre estes, destaca-se o fator sigma C, o qual tem sido associado à virulência em Mycobacterium tuberculosis, e cujo gene se encontra em uma ilha de patogenicidade em C. pseudotuberculosis. Neste contexto, nosso grupo de pesquisa tem se dedicado ao estudo do papel dos fatores sigma alternativos de C. pseudotuberculosis na resposta a diferentes condições de estresse in vitro e na virulência da bactéria. Neste trabalho, foi construída uma linhagem de C. pseudotuberculosis deficiente para o fator sigma C, utilizando um plasmídeo suicida, e foi avaliada a resistência desta linhagem aos estresses oxidativo, ácido, osmótico e térmico in vitro, através da comparação das diferenças no crescimento relativo e na viabilidade relativa das bactérias expostas às condições de estresse em relação às bactérias crescidas sob condições normais, entre os tempos sucessivos de exposição das linhagens 1002 selvagem e mutante para o fator sigma C a cada agente gerador de estresse. Não foi observada uma diferença significativa na susceptibilidade da linhagem mutante para o fator sigma C ao estresse ácido em relação à linhagem 1002 selvagem. Contudo, foi verificado que esta linhagem é significativamente mais susceptível aos estresses oxidativo, osmótico e térmico do que a linhagem 1002 selvagem, indicando que o fator sigma C deve desempenhar um papel importante para a resposta da bactéria a estas condições de estresse, e possivelmente, para a sua sobrevivência no meio ambiente e no interior do hospedeiro e para a sua virulência.

Corynebacterium pseudotuberculosis is a Gram-positive bacterium, which causes caseous lymphadenitis in sheep and goats. To cause a successful infection, this facultative intracellular pathogen needs to respond efficiently to the changes in the extracellular environment, being able to survive faced with the harsh conditions found in the host organism. One of the main mechanisms used by pathogenic bacteria to achieve this goal is the transient activation of specific…