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Lactobacilos are Gram-positive bacteria, catalase negative, capable of fermenting glucose and other sugars with its final major product been lactic acid. They must have several characteristics to make them potentially good candidates as antigenic vehicles for oral vaccines and as good probiotics. Seventy nine bacteria were isolated from the feces of Chinese Crested and Yorkshire Terrier puppies, around 20 days old, and were submitted to molecular identification at the genus level. Of these, 37 were identified at the species level as Lactobacillus, and submitted to probiotic characterization. In order to evaluate the ability of the lactobacilli isolates to overcome gastrointestinal challenges, the bacteria were tested for susceptibility to the acidic pH 2.5 found in the stomach and bile salts found in the small intestine; most of the bacteria were resistant to acidic pH and showed slight to moderate growth inhibition by bile salts. The potential for adhesion to the hydrophobic surfaces of intestinal epithelia was indirectly evaluated by the capacity of the isolate to be associated with organic solvents, highlighting 7 isolates with highly hydrophobic cellular surfaces. Most of the isolates showed strongly antagonistic activity against the seven bacterial pathogens tested; however, the isolates tested against Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae showed no zone of inhibition to pathogen growth. The vast majority of the isolates (34/37) tested showed themselves to be producers of hydrogen peroxide, an antimicrobial substance associated with vaginal colonization. Through all of the results obtained, it was possible to select 7 lactobacilli isolates as potential probiotics that could be used as vehicles for oral vaccinations.

Os lactobacilos são bactérias Gram-positivo, catalase negativo, fermentadoras de glicose e outros açúcares cujo produto final principal é o ácido lático. Devem apresentar várias características que façam delas candidatas em potencial a veículos de antígenos em processos de vacinação oral e bons probióticos. Neste estudo foram isoladas 79 bactérias de fezes de filhotes de cães de Crista Chinês e Yorkshire Terrier com cerca de 20 dias de vida, as quais foram submetidas à identificação molecular ao nível de gênero. Destas, 37 foram identificadas ao nível de espécie como lactobacilos e submetidas à caracterização probiótica. A fim de avaliar a viabilidade dos isolados perante os desafios do trato gastrintestinal, as bactérias foram testadas quanto a susceptibilidade ao baixo pH estomacal e aos sais biliares intestinais. A maior parte das bactérias foi resistente ao pH ácido do estômago e a maioria dos isolados apresentou inibição de crescimento leve ou moderada aos sais biliares. O potencial de adesão à superfície hidrofóbica do epitélio intestinal foi avaliado indiretamente pela capacidade dos isolados de se associarem a solventes orgânicos apolares, destacando-se sete isolados com superfície celular de alta hidrofobicidade. Quase todos os isolados apresentaram forte atividade…

Advisors/Committee Members: Alvaro Cantini Nunes, Alvaro Cantini Nunes, Andrea Maria Amaral Nascimento, Regina Maria Nardi Drummond.

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A possível indução de resistência bacteriana devido à inclusão de antibióticos na alimentação animal tem levado as autoridades competentes a proibir a utilização dos tradicionais promotores de crescimento baseados em drogas antimicrobianas para este fim. Além disso, os consumidores começaram a preferir produtos de origem animal com alta qualidade, sem possíveis resíduos destes antibióticos, promovendo uma pressão no mercado por compostos alternativos. Assim, os probióticos têm emergido como potenciais substitutos, pois proporcionam benefícios à microbiota intestinal e mostram capacidade imunomoduladora em seu hospedeiro. Neste contexto, este estudo teve como objetivo isolar e identificar novas linhagens de bactérias do ácido láctico a partir de diferentes mucosas de suínos que possam ser utilizadas para suplementação alimentar, promoção do crescimento e como adjuvante imune. Cinquenta e seis isolados foram obtidos a partir de fezes, focinho e boca de oito suínos e, em seguida, foram identificadas ao nível de gênero por amplificação das regiões espaçadoras entre os genes 16S-23S do rRNA. Aqueles isolados que apresentaram amplificação típica do grupo Lactobacillus e Weissella foram identificados ao nível de espécie por digestão com endonucleases de restrição dos amplicons 16S-23S rRNA e caracterizados quanto às suas propriedades probióticas. Vinte e quatro microrganismos do grupo Lactobacillus/Weissella foram identificados como pertencentes a oito espécies: Lactobacillus acidophilus, L. brevis, L. murinus, L. reuteri B, L. plantarum A, L. plantarum B/ L. paraplatarum/ L. pentosus, Weissella paramesenteroides, W. cibaria. Estas bactérias foram selecionadas quanto ao seu potencial probiótico com base na resistência aos sais bileres, tolerância ao baixo pH, hidrofobicidade da superfície celular e produção de substâncias antimicrobianas. Os resultados mostraram a presença de sete isolados com potencial probiótico, com dois destaques, o Lactobacillus acidophilus 1ANH4 e a Weissella paramesenteroides 1ANK4, que cumpriram plenamente todas as condições testadas, demonstrando maior potencial em relação às propriedades funcionais testadas in vitro.

The possible acquisition of bacterial resistance due to the inclusion of antibiotics in animal feed has led the qualified authorities to ban the use of antimicrobial drugs for this purpose. Moreover, consumers began to prefer products of animal origin with high quality, without possible residues of the referred antibiotics. Thus, probiotics have emerged as potential substitutes to the traditional use of antimicrobial drugs because provide intestinal microbiota benefits and show immunomodulatory capacity in its host. Therefore, this study aimed to isolate and identify new strain of lactic acid bacteria from different mucosae of swine select candidates for feed supplementation, growth promotion and as immune adjuvant. Fifty-six isolates were obtained from feces, snout and mouth of eight swines and then were identified to genus level by amplification of the 16S-23S rRNA intergenic…

Advisors/Committee Members: Alvaro Cantini Nunes, Alvaro Cantini Nunes, Elisabeth Neumann, Vasco Ariston de Carvalho Azevedo.

Avaliação, Padronização e Aplicação da Técnica de Pcr No Diagnóstico Diferencial Entre Entamoeba Histolytica e Entamoeba Díspar, Em Amostra Fecais Provivenientes De Pacientes Brasileiros Advisors/Committee Members: Maria Aparecida Gomes, Maria Aparecida Gomes, Maria Norma Melo, Alvaro Cantini Nunes.

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O uso de bactérias como veículos para a entrega de plasmídeos vacinais pela rota oral constitui uma estratégia de vacinação promissora contra diversas doenças infecciosas. Para isto, bactérias patogênicas atenuadas como Shigella, Listeria e Salmonella vêm sendo utilizadas, ainda que as mesmas apresentem risco de reversão ao seu fenótipo selvagem. Sendo assim, a utilização de bactérias não patogênicas poderia constituir uma alternativa mais segura para este propósito. Lactococcus lactis é uma bactéria láctica modelo considerada GRAS (Generally Recognized As Safe) que vem sendo extensivamente utilizada para a produção e entrega de antígenos e citocinas ao nível de mucosas. Assim, L. lactis pode representar uma alternativa para a entrega de plasmídeos vacinais em relação aos patógenos atenuados, ainda que o mesmo não tenha capacidade invasiva. Neste contexto, foram construídas linhagens de L. lactis invasivas (L. lactis FnBPA, Innocentin et al., 2009) e também um plasmídeo replicativo em L. lactis, contendo um cassete de expressão eucariótica (pValac, Guimarães et al., 2009). Assim, a utilização de uma linhagem invasiva de L. lactis contendo o vetor pValac para a expressão eucariótica do antígeno ESAT-6 (6-kDa Early Secreted Antigenic Target) de Mycobacterium tuberculosis, pode vir a ser uma nova estratégia para o controle da tuberculose; uma doença infecto-contagiosa que atinge 1/3 da população mundial na forma latente. Desta forma, este trabalho teve como objetivo a construção do plasmídeo vacinal pValac:ESAT-6 e verificação de sua funcionalidade, in vitro, assim como a clonagem na linhagem invasiva de L. lactis para sua utilização como uma via de entrega oral de vacinas gênicas. A seqüência codificadora de ESAT-6 foi isolada por PCR a partir do DNA genômico de M. tuberculosis linhagem H37Rv para clonagem no vetor Zero Blunt® TOPO® e posteriormente no vetor pValac. A construção final, pValac:ESAT-6, foi primeiramente obtida em Escherichia coli TG1. Para a avaliação da funcionalidade do plasmídeo, células da linhagem CHO (Chinese Hamster Ovary) foram transfectadas com o plasmídeo pValac:ESAT-6 e a expressão de ESAT-6 foi avaliada por RT-PCR, Western blotting e Imunocitoquímica, sendo, a funcionalidade do plasmídeo pValac:ESAT-6, assim confirmada. Por fim, o plasmídeo pValac:ESAT-6 foi transformado na linhagem invasiva de L. lactis, gerando a linhagem L. lactis FnBPA(pValac:ESAT-6). Enfim, este trabalho constitui um primeiro passo rumo à validação da eficácia e efetividade de novas vacinas gênicas baseadas em bactérias lácticas geneticamente modificadas, por via de administração oral em mucosas; o que também poderá fornecer informações valiosas para a pesquisa e o desenvolvimento de vacinas contra outros patógenos.

The use of bacteria as vehicles for the delivery of vaccine plasmids by oral route constitutes a promising strategy for vaccination against various infectious diseases. Attenuated pathogenic bacteria such as Shigella, Listeria and Salmonella have been widely used for such purposes, although presenting…

Advisors/Committee Members: Anderson Miyoshi, Anderson Miyoshi, Alvaro Cantini Nunes, Dawidson Assis Gomes, Sophie Yvette Leclercq.

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O Brasil possui um dos maiores rebanhos de bovinos do mundo e é considerado o sexto maior produtor de leite mundial. O agronegócio do leite no país gera emprego e renda para mais de 3,6 milhões de pessoas e responde por 9% do PIB. Programas de melhoramento genético têm conseguido aumentar consideravelmente a produção leiteira dos rebanhos a partir de pequeno número de animais de maior valor genético para as características de interesse. Os touros com DEP elevada são intensivamente utilizados nos sistemas de reprodução assistida e muito pouco se sabe sobre o grau de diversidade genética ainda existente nos plantéis. Com o objetivo de analisar a diversidade genética dos touros da raça Guzerá avaliados nos programas de melhoramento genético da raça, uma amostra de 54 touros foi genotipada, utilizando-se quatro microssatélites Y-específicos INRA198, BYM-1, BM861 e UMN0307. Os microssatélites foram genotipados por amplificação por PCR e separação por eletroforese capilar. Frequências alélicas foram estabelecidas por contagem gênica. A diversidade haplotípica foi calculada com a fórmula de Nei. Os alelos identificados na raça foram INRA18982bp, INRA18990pb, UMN0307151pb, BM861158pb, BYM-1258pb, BYM-1260pb. O marcador INRA189 apresentou distúrbios de segregação e foi descartado da análise. O marcador BYM-1 foi bi-alélico e os demais foram monomórficos. Com base nos marcadores BYM-1, BM861 e UMN0307 foi possível identificar dois haplótipos. Os marcadores foram combinados em haplótipos (H1: UMN0307151pb, BM861158pb, BYM-1258pb e H2: UMN0307151pb, BM861158pb, BYM-1260pb). H1 foi o mais frequente, estando presente em 83% dos animais genotipados. A baixa diversidade haplotípica observada (0,28 ± 0,07) está de acordo com outros estudos na literatura, que também averiguaram pequeno número de haplótipos em raças zebuínas. Além disto, estudos de diversidade genética baseados na análise dos dados de registro genealógico da raça Guzerá no Brasil também indicam baixa diversidade genética e pequeno tamanho efetivo de população. Entretanto, estes resultados devem ser interpretados cautelosamente, uma vez que o sistema de haplotipagem precisa ser ampliado com a inclusão de mais marcadores genéticos.

Brazil has one at the largest cattle population in the world and is sthe sixth largest milk producer worldwide. Dairy agribusiness generates jobs and income for more than 3.6 million people in the country and accounts for 9% of national annual internal product. Breeding programs have been able to significantly increase milk production of herds based on a small number of animals with high genetic merit for traits of interest. Bulls with the highest DEP are extensively used in mating systems, and very little is known about the degree of genetic diversity still existing in the herds. In order to characterizing genetic diversity among Guzerat bulls evaluated the breeding programs for this breed in Brazil, a sample of 54 bulls were genotyped for the Y-chromosome specific microsatellites INRA198, BYM-1, BM861 e UMN0307. These genetic markers were…

Advisors/Committee Members: Maria Raquel Santos Carvalho, Maria Raquel Santos Carvalho, Alvaro Cantini Nunes, Maria Gabriela Campolina Diniz Peixoto.

▼ Resumo A identificação de infecções por Entamoeba histolytica constitui assunto prioritário em amebíase desde que a E. dispar foi reconhecida como espécie em 1997 pela Organização Mundial de Saúde (OMS). A E. histolytica é a única ameba no intestino humano que invade os tecidos, produzindo no indivíduo infectado graus de morbidade variados, que se não prontamente diagnosticado e tratado pode ser fatal. A E. dispar é considerada uma espécie comensal e o tratamento com imidazólicos é dispensável. As diversas taxas de prevalência da infecção relatadas na literatura em sua grande maioria foram obtidas antes do reconhecimento desta nova espécie de Entamoeba, existindo a necessidade da padronização de novas técnicas de diagnóstico a fim de se diferenciar as duas espécies. Entre os diversos métodos moleculares de diagnóstico, a PCR é tida como uma técnica altamente sensível e específica. Neste trabalho avaliamos a aplicabilidade da PCR como método diagnóstico de infecções por E. histolytica e E. dispar. A PCR foi comparada à microscopia e a técnica de ELISA para coproantígenos. Verificamos uma sensibilidade menor da PCR quando comparados aos métodos de microscopia (69.811%) e de ELISA (64.286%). No entanto estes resultados podem estar relacionados ao modelo tomado como padrão, a microscopia ótica e o ELISA. A microscopia ótica depende muito da experiência do microscopista, culminando principalmente, em resultados falso positivos. Tomando como padrão o perfil de zimodemas foi obtida uma concordância de 100% Experimentalmente, a técnica de ELISA para coproantígenos mais sensível apresenta resultados positivos com no mínimo 100 trofozoítos por poço. A PCR é capaz de identificar menos que um trofozoíto. Estes resultados sinalizam para a superioridade da PCR como método diagnóstico e estimulam a continuidade de estudos envolvendo sua padronização e otimização. Advisors/Committee Members: Maria Aparecida Gomes, Maria Aparecida Gomes, Maria Norma Melo, Edward Felix Silva, Alvaro Cantini Nunes.

▼ A mineração é uma atividade antrópica de importância econômica que gera grandes impactos aos diferentes ecossistemas. Dentre estes, o ecossistema aquático é um dos mais afetados. Este estudo detectou e comparou a diversidade e a distribuição de procariotos de dois córregos por meio de uma abordagem independente de cultivo, compreendendo construção de bibliotecas de clones do gene 16S rRNA e seu sequenciamento. Os sítios de amostragem foram os sedimentos do Córrego da Mina (MS), historicamente contaminado por metais, com ênfase no arsênio, e do Córrego Mutuca (MTS), que é relativamente pristino, ambos pertencentes à bacia do Rio das Velhas. As curvas de rarefação e os índices de diversidade das bibliotecas de clones indicaram uma alta diversidade filogenética de bactérias, enquanto as arqueias foram menos diversas. Embora as comunidades bacterianas de ambos sedimentos tenham sido diversas, foram estatisticamente distintas, de acordo com a análise pelo LIBSHUFF. Identificaram-se 224 OTUs (operational taxonomic unity), pertencentes ao domínio Bacteria, sendo que os clones da biblioteca MS e MTS afiliaram-se a 14 e 17 filos, respectivamente. A maioria dos filos afiliaram-se a Proteobacteria (, , , ) e Bacteroidetes. Os taxa Gemmatimonadetes, Actinobacteria e Alphaproteobacteria foram encontrados somente na biblioteca MS, enquanto Fusobacteria, Spirochaetes, Armatimonadetes e os candidatos às divisões OP11 e KSB1, ocorreram apenas na biblioteca MTS. Sequências de 16S rDNA de arqueias afiliaram-se apenas a dois filos em ambas bibliotecas: Crenarchaeota e Euryarchaeota. No entanto, 75% destas sequências se afiliaram ao Crenarchaeota, na biblioteca MS, enquanto Euryarchaeota foi predominante na biblioteca MTS. A análise por PCR quantitativa revelou que as bactérias do sedimento de MS foram 100 vezes mais abundantes do que em MTS. Em contrapartida, a abundância de arqueias foi equivalente em ambos os sedimentos. Os dados obtidos neste estudo mostraram que, apesar dos sedimentos dos córregos apresentarem características distintas, as comunidades bacterianas compartilharam alta diversidade, revelando que ambientes historicamente impactados por metais podem ser tão diversos quanto ambientes relativamente pristinos. Advisors/Committee Members: Andrea Maria Amaral Nascimento, Edmar Chartone de Souza, Andrea Maria Amaral Nascimento, Edmar Chartone de Souza, Vera Lucia dos Santos, Alvaro Cantini Nunes.

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Lactococcus lactis, a bactéria láctica modelo, é considerada segura e vem sendo há muito utilizada para produção e entrega de antígenos e citocinas às superfícies de mucosas. Mais recentemente, os estudos envolvendo este microorganismo têm também focado em sua utiilização como veículo para entrega de vacinas de DNA, plataforma vacinal inovadora que envolve a administração de um vetor plasmideano de expressão eucariótica capaz de codificar proteínas imunogênicas ou imunomoduladoras e que apresenta grande potencial como agente profilático e terapêutico. Todavia, a despeito das metodologias de entrega de vacinas de DNA até o momento desenvolvidas apresentarem relativa eficiência na entrega dos plasmídeos vacinais às células hospedeiras, estas são falhas em direcioná-los para o núcleo celular, evento crucial para que a ORF de interesse seja expressa e a vacina de DNA desempenhe sua função. Considerando que o envelope nuclear constitui o maior obstáculo à entrada dos plasmídeos vacinais no núcleo das células alvo, a otimização do direcionamento destes para o núcleo, bem como a transposição desta barreira é de fundamental importância para a eficácia de uma vacina gênica. Com o objetivo de melhorar os níveis de importação nuclear e de expressão gênica a partir de um plasmídeo vacinal desenvolvido por nosso grupo de pesquisa (pValac; Vaccination using lactic acid bacteria), a ser entregue especificamente por uma linhagem invasiva de L. lactis, este trabalho procurou otimizá-lo através da inserção de uma sequência nucleotídica do vírus símio 40 (SV40, do inglês Simian Virus 40), descrita como sendo capaz de direcionar DNA exógeno ao núcleo de células eucarióticas e aumentar a expressão gênica a partir dos plasmídeos que a contenham. Esta sequência, denominada Sequência de Endereçamento Nuclear (DTS, do inglês DNA nuclear Targeting Sequence), foi clonada no vetor pValac e para avaliação da funcionalidade desta construção, a ORF da proteína verde fluorescente (GFP, do inglês Green Fluorescent Protein) foi utilizada como repórter. A avaliação da funcionalidade da construção final pValac::DTS::gfp se deu por meio de sua transfecção em células mamíferas e análises através de microscopia de fluorescência e RT-PCR. Para efeito de comparação entre a expressão de GFP a partir do plasmídeo pValac::DTS::gfp e do plasmídeo controle pValac::gfp, foram realizados ensaios de Citometria de Fluxo. Os resultados mostraram que a presença da DTS no plasmídeo pValac::gfp não foi capaz de aumentar a expressão da proteína GFP, resultados estes que estão em desacordo com a maioria daqueles reportados pela literatura.

Lactococcus lactis, the Lactic Acid Bacteria model, is considered to be safe and has been widely used for the production and delivery of antigens and cytokines to the mucosal level. More recently some studies have focused on their use as delivery vehicles of DNA vaccines, an innovating vaccine platform that involves administration of a plasmid vector of eukaryotic expression capable of coding imunogenic or imunomodulatory proteins…

Advisors/Committee Members: Anderson Miyoshi, Sophie Yvette Leclercq, Anderson Miyoshi, Sophie Yvette Leclercq, Alvaro Cantini Nunes, Débora de Oliveira Lopes.

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Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria que causa a Linfadenite Caseosa (LC) em pequenos ruminantes, promovendo redução da produtividade dos animais infectados. A doença se caracteriza pela formação de abscessos em nódulos linfáticos superficiais e/ou órgãos internos. Vários métodos diagnósticos para a LC na forma subclínica foram desenvolvidos, mas nenhum deles com eficácia e praticidade satisfatórias. Assim, neste trabalho foi realizada a padronização de um Teste Intradérmico de Hipersensibilidade (TIH) com proteínas secretadas de C. pseudotuberculosis para o diagnóstico subclínico da LC em pequenos ruminantes. Os animais utilizados nos experimentos foram avaliados através de exames clínicos e laboratoriais, e separados em dois grupos constituídos de 10 caprinos positivos (grupo A) e 10 caprinos negativos (grupo B) para a LC. Paralelamente, as proteínas secretadas da linhagem bacteriana MIC6 de C. pseudotuberculosis foram extraídas através da técnica de fracionamento em três fases (TPP) e quantificadas pelo método de Bradford. Posteriormente, o TIH foi padronizado e aplicado por via intradérmica na dose de 0,1mL na região cervical esquerda em uma área tricotomizada. Nos mesmos animais foi aplicado 0,1mL de Tris-HCl (pH 7,4) sem as proteínas secretadas, na região cervical direita para controle do experimento. As mensurações do TIH foram realizadas com cutímetro Hauptner, antes da inoculação e a cada 24h nos seis dias subsequentes. O grupo A apresentou a média geral dos valores do TIH em todos os dias avaliados, significativamente superior ao grupo B. Nas primeiras 24h houve um pico de reação, com maior evidência no grupo A, declinando até as 72h, com retorno à normalidade após 96h da aplicação do TIH. Todos os controles mantiveram seus valores semelhantes em ambos os grupos e ao decorrer dos dias avaliados. O TIH padronizado para diagnóstico subclínico da LC em caprinos demonstrou resultados promissores e será aprimorado para utilização no controle da LC

Corynebacterium pseudotuberculosis is a bacterium that can cause Caseous Lymphadenitis (CLA) in small ruminants and consequently reduce the productivity of infected animals. The disease is characterized by the formation of abscesses in superficial lymph nodes and / or internal organs. Several diagnostic methods for the subclinical form of CLA have been developed, but none of them with satisfactory efficiency and practicability. Thus, a standardized Intradermal Hypersensitivity Test (IHT) with proteins secreted by C. pseudotuberculosis for the diagnosis of subclinical CLA in small ruminants was developed in this study. The animals used in experiments were evaluated by clinical examination and laboratory assays and separated into two groups consisting of 10 positive goats (group A) and 10 negative goats (group B) for CLA. In parallel, proteins secreted from the bacterial strain MIC6 of C. pseudotuberculosis were extracted using the technique of three-phase partitioning (TPP) and quantified by the method of Bradford. Subsequently, the IHT has been…

Advisors/Committee Members: Vasco Ariston de Carvalho Azevedo, Vasco Ariston de Carvalho Azevedo, Sergio Costa Oliveira, Alvaro Cantini Nunes, Aurora Maria Guimaraes Gouvea.

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O sistema do complemento desempenha um importante papel na imunidade inata e adaptativa, principalmente através da opsonização de organismos invasores, produção de anafilotoxinas e formação de poros na superfície de patógenos. A saliva de Lutzomyia longipalpis, o principal vetor de Leishmania infantum nas Américas, é capaz de inibir tanto a via clássica como a via alternativa do sistema do complemento humano. Este estudo teve o objetivo de ampliar o conhecimento sobre a inibição do complemento por L. longipalpis. Em relação à via clássica, a saliva de L. longipalpis não inibiu a deposição do primeiro componente do complemento, o C1q. Porém, uma expressiva inibição dos componentes seguintes C4b, C3b, C5b e C9 ocorreu quando a saliva estava presente. A formação do complexo de ataque à membrana não foi influenciada pela presença da saliva, indicando um ponto de inibição nas etapas iniciais da cascata. O extrato de glândula salivar foi capaz de inibir a clivagem do C4, mas não atuou inibindo a atividade enzimática do C1s. O modo de atuação da saliva de L. longipalpis parece estar relacionado com o fato do extrato de glândula salivar ser capaz de se ligar ao C1q humano. A proteína salivar responsável pela inibição da via clássica foi identificada como sendo a LJM19, uma proteína recombinante de aproximadamente 11 kDa que é encontrada na saliva como um dímero de 22,3 kDa. A inibição da via alternativa também foi relacionada às etapas iniciais da cascata do complemento. O extrato de glândula salivar foi capaz de inibir a deposição de C3b, fator Bb, C5b e C9. A inibição da deposição do fator Bb, e provavelmente de todos os outros componentes da via alternativa, foi relacionada à capacidade da saliva em impedir a clivagem do fator B. Porém, a saliva de L. longipalpis não foi capaz de inibir diretamente a atividade enzimática do fator D. Além da inibição do complemento pela saliva de L. longipalpis, o conteúdo intestinal também foi testado. Nesse caso, os ensaios de deposição não constataram inibição do C5b para a via alternativa. Para a via clássica, o conteúdo intestinal de L. longipalpis inibiu a deposição de C3b e C5b, sem inibir a deposição de C4b. A presença de inibidores do complemento na saliva e intestino de flebotomíneos deve estar relacionada com a proteção do epitélio intestinal contra os efeitos líticos presentes no sangue ingerido. Além disso, considerando que a opsonização de moléculas (mesmo moléculas solúveis como as proteínas salivares) por C3b aumenta consideravelmente sua imunogenicidade, a inibição do complemento acabaria por proteger essas moléculas salivares de uma resposta imunológica dirigida contra elas

The complement system plays an important role in both innate and adaptive immunity, mainly by the opsonization of invading organisms, anaphylatoxin production and pore formation in the surface of pathogens. The saliva of Lutzomyia longipalpis, the main vector of Leishmania infantum in Americas, is able to inhibit both the classical and alternative pathways of the human complement system. This study…

Advisors/Committee Members: Nelder de Figueiredo Gontijo, Nelder de Figueiredo Gontijo, Aparecida Sadae Tanaka, Marcelo Gustavo Lorenzo, Alvaro Cantini Nunes, Ricardo Toshio Fujiwara.

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Symbiosis between insects and prokaryotes are recognized as essential to the survival of these invertebrates. The bacterial community in the gastrointestinal tract of termites, social insects, is diverse and the function of this microbiota has been characterized. This study investigated the molecular diversity of prokaryotes in soil of the mound and its agent Cornitermes cumulans using a cultivation-independent approach. Thus, samples of the termite nest soil (SC), reference soil (SR) and termite (CP) - Cornitermes cumulans - were collected. The amplicon of the 16S rRNA gene of bacteria was used for the ARDRA fingerprint analysis of the SC, SR and CP samples and the construction of libraries from SC and CP. Moreover, the construction of 16S rDNA library from archaea was obtained using SC sample. Analysis of restriction profiles of 16S rRNA gene revealed that bacterial communities in SC, SR and CP were different, although SR and CP communities were more similar. Phylogenetic analysis using 16S rRNA gene sequences revealed a high diversity of bacterial communities in SC, detecting 67 OTUs which were affiliated to ten phyla: Actinobacteria, Proteobacteria, Acidobacteria, Firmicutes, Planctomycetes, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Chloroflexi, Gemmatimonadetes and Bacteria_incertae_sedis. On the other hand, the community of archaea of the sample SC showed that only two OTUs affiliated to the phylum Chrenoarcheota. The bacterial community of Cornitermes cumulans presented eight OTUs which were affiliated with four phyla Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria and Synergistetes. Identified bacterial phyla, Proteobacteria, Firmicutes and Actinobacteria were common to both communities in SC and CP. The Shannon-Weaver and Simpson indices and the ACE and Chao1 values showed that SC and CP had high bacterial diversity while SC had a low diversity of archaea. Thus, the results reveal bacterial diversity, yet unexplored, in the soil of termite mound and Cornitermes cumulans.

A simbiose entre insetos e procariotos é reconhecida como sendo essencial para a sobrevivência desses invertebrados. A microbiota existente no trato gastrointestinal de cupins, insetos sociais, é diversa e a sua função vem sendo caracterizada. Este estudo pesquisou a diversidade molecular de procariotos em solo do cupinzeiro e de seu agente Cornitermes cumulans, utilizando uma abordagem independente de cultivo. Assim amostras de solo do cupinzeiro (SC), do solo de referência (SR) e do cupim (CP) - Cornitermes cumulans - foram coletadas. O amplicon do gene de rRNA 16S de bactérias foi usado para a análise do fingerprint ARDRA das amostras SC, SR e CP e para a construção de bibliotecas de clones de SC e CP. Além disso, a construção da biblioteca de clones do gene de rRNA 16S de arqueias foi obtida para a amostra SC. A análise do perfil de restrição do gene de rRNA 16S revelou que as comunidades bacterianas de SC, SR e de CP foram distintas, sendo as comunidades SR e CP mais similares. A análise filogenética utilizando o gene de rRNA 16S revelou uma alta…

Advisors/Committee Members: Andrea Maria Amaral Nascimento, Edmar Chartone de Souza, Andrea Maria Amaral Nascimento, Edmar Chartone de Souza, Vera Lucia dos Santos, Alvaro Cantini Nunes.

▼ A Amebíase é uma doença tipicamente humana causada pelo protozoário parasita E. histolytica. Esta ameba pode colonizar o intestino humano, permanecendo como comensal assim como a ameba não-patogênica, E. dispar. As semelhanças entre E. histolytica e E. dispar fazem desta última um modelo atrativo para estudos visando esclarecer a fisiopatologia da amebíase. Muitas das proteínas descritas como envolvidas com a virulência da E. histolytica estão presentes também em E. dispar. A patogenicidade desta ameba está em parte relacionada com sua associação com espécies bacterianas. A esta associação se acrescentam moléculas produzidas pela E. histolytica responsáveis por sua virulência e pela evasão do sistema imune, incluindo o complemento. Os trofozoítos estão continuamente expostos ao complemento e em geral o ativam pela via alternativa, mas a atuação do complemento sobre os trofozoítos e a área de necrose amebiana é controversa e pouco estudada in vivo. Neste estudo objetivou-se através da comparação de cepas de E. histolytica em cultivo misto e axênico entre si e entre as cepas de E. dispar de cultivo misto, estudar a necrose hepática amebiana reproduzindo-a em camundongo. Também foi avaliada a influência da expressão in situ do componente C9 do complemento sobre as áreas de necrose e os trofozoítos das cepas de E. histolytica e E. díspar. Lesões hepáticas foram observadas em todos os animais inoculados, inclusive com a E. dispar. Embora não-patogênica em humanos, esta espécie de ameba também mostrou-se capaz de produzir Amebíase hepática experimental murina. As áreas de necrose produzidas por ambas as cepas de E. histolytica foram estatisticamente iguais, mostrando que a presença de bactérias não interferiu significativamente na virulência da cepa Ehm. Os animais inoculados com a cepa Ehm de E. histolytica, foram aqueles que apresentaram a menor intensidade do infiltrado inflamatório e amplas regiões de necrose, sugerindo a participação de leucócitos destruídos no aumento da necrose. Mesmo com maior quantidade de trofozoítos, os animais inoculados com a cepa Ehax não desenvolveram necrose significativamente maior do que a produzida pela cepa Ehm. Grande quantidade de leucócitos próximos à necrose e maiores áreas de marcações granulosas anti-trofozoítos foram encontradas nos animais inoculadas com as cepas de E. dispar, sugerindo uma destruição mais eficaz desta ameba. Os animais inoculados com E. histolytica apresentaram as maiores áreas de marcação C9(+) no parênquima hepático normal e lesado, bem como um maior número de trofozoítos C9(+). Apesar disso, nestes animais não foram observadas grandes áreas de marcações granulosas anti-trofozoítos, o que indicaria a destruição dos parasitos. Diante disso, os resultados também sugerem uma maior capacidade de evasão in vivo da E. histolytica em relação ao complemento. Advisors/Committee Members: Marcelo Vidigal Caliari, Marcelo Vidigal Caliari, Maria Aparecida Gomes, Maria Aparecida Gomes, Alvaro Cantini Nunes, Virginia Hora Rios Leite.

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Sheep milk, obtained from one of the oldest domestic animals, is unique for its high solids ratio. Its cheese are more famous than the milk itself. Lactic acid bacteria, abundant in milk from several mammals, include most of the probiotic microorganisms, which bring benefits to their consumers when ingested in viable and adequate portions. Few data are available in the literature on the microbiota of ewe milk as well on its possible probiotic features. Therefore, the objective of this work was to identify the species of lactic acid bacteria in milks from Lacaunes, Santa Inês and its breeds and evaluate their in vitro probiotic potential. The identification was made through Sangers 16S rDNA sequencing method. The identified species were Enterococcus faecium (56.25%), E. durans (31.25%) and E. casseliflavus (12.5%). Their probiotic potential was evaluated by gastric pH and biliary salt resistance and antimicrobial susceptibility; and antagonism against samples and reference microorganisms. It was observed that 75% of the tested enterococci were resistant to gastric pH (2.0) and 56.25% to 0,3% of oxgall (biliary salts). All the tested enterococci were resistant to ceftazidime, oxaciclin, and streptomycin and sensible to clindamycin, erythromycin, and penicillin. The resistance to ciprofloxacin, gentamicin, tetracycline, and vancomycin varied among the tested species. All the tested enterococci strongly inhibited Escherichia coli and Listeria monocytogenes samples, moderately inhibited E. faecalis and Staphylococcus aureus samples, and didnt inhibit Psedomonas aeruginosa, Salmonella enterica var. Typhimurium samples and also one E. durans sample isolated from the evaluated sheep milk. Four samples of E. faecium, one of E. durans, and one of E. casseliflavus presented the best probiotic potential. However, more studies are needed to prove that these samples dont carry neither virulence genes nor antimicrobial resistance genes, as well as their probable transmission to other microorganisms

O leite de ovelha, obtido de um dos animais domésticos mais antigos do mundo, é diferenciado por seu alto teor de sólidos. Seus produtos derivados, principalmente os queijos, têm maior importância social e econômica que o leite de ovelha em si. As bactérias ácido-lácticas, abundantes no leite de todas as espécies domésticas leiteiras, incluem a maior parte dos microrganismos probióticos, que trazem benefícios ao consumidor quando ingeridos em quantidades adequadas e viáveis. Poucos dados estão disponíveis na literatura sobre a microbiota do leite de ovelha, bem como sobre seu potencial probiótico. Então, o objetivo desse trabalho foi identificar as espécies de bactérias ácido-lácticas no leite de ovelhas das raças Lacaune, Santa Inês e suas mestiças além de avaliar o seu potencial probiótico in vitro. A identificação foi realizada por técnicas de biologia molecular como o sequenciamento pelo método de Sanger do 16S rDNA. As espécies identificadas foram Enterococcus faecium (56,25%), E. durans (31,25%) e E. casseliflavus (12,5%). Não…

Advisors/Committee Members: Marcelo Resende de Souza, Alvaro Cantini Nunes, Marcelo Resende de Souza, Andréia Marçal da Silva, Jacques Robert Nicoli.

▼ A saliva de artrópodes hematófagos contém biomoléculas envolvidas diretamente ou indiretamente no processo de hematofagia, entre as quais estão moléculas inibidoras do sistema complemento. A função mais óbvia para estes inibidores seria a proteção do intestino médio contra danos causados pelo complemento. Para investigar esta hipótese, ninfas de Triatoma brasiliensis foram forçadas a ingerir soro humano em condições nas quais os inibidores salivares eram incapazes de proteger o intestino. Nestas condições, o epitélio do intestino médio anterior foi marcado e danificado pelo complemento, causando morte celular. Uma vez que a saliva de Aedes aegypti não contém inibidores do complemento, foi formulada a hipótese da possível existência destes inibidores no intestino médio. Assim, a atividade inibitória foi investigada no intestino de A. aegypti, na saliva e no intestino de três espécies de triatomíneos (T. brasiliensis, T. infestans e Rhodnius prolixus) por meio de um método imunológico capaz de determinar o nível de deposição de alguns fatores do complemento (C1q, C3b, ou C4b) na superfície de moléculas ativadoras em microplacas. Esta metodologia permitiu identificar em quais pontos da cascata do complemento as moléculas presentes na saliva ou no conteúdo intestinal de triatomíneos podem inibir o complemento. Foi verificado que tanto a saliva quanto o conteúdo intestinal solúvel das espécies de triatomíneos estudadas não inibiram a deposição de C1q pela via clássica. O conteúdo intestinal solúvel das três espécies de triatomíneos foi capaz de inibir a deposição de C4b pela via clássica. Somente a saliva de T. brasiliensis foi capaz de inibir a deposição de C4b. Ambos, saliva e conteúdo intestinal das três espécies de triatomíneos puderam inibir a deposição de C3b nas vias clássica e alternativa. Nenhum dos materiais extraídos das membranas de células intestinais dos triatomíneos inibiu a deposição de C3b na via clássica. Como esperado, o conteúdo intestinal solúvel de A. aegypti foi capaz de inibir a deposição de C3b pelas vias clássica e alternativa. A existência de inibidores de complemento pode apresentar consequências biológicas importantes tanto para o sucesso na hematofagia dos insetos quanto para o seu papel na interação com seus parasitos. Advisors/Committee Members: Nelder de Figueiredo Gontijo, Marcos Horacio Pereira, Nelder de Figueiredo Gontijo, Alessandra Aparecida Guarneri, Alvaro Cantini Nunes, Ricardo Toshio Fujiwara, Marcos Horacio Pereira, Marcos Henrique Ferreira Sorgine.

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Pela primeira vez, foi demonstrada a relação entre genes responsáveis pelo metabolismo energético do cérebro, genes da via GABAérgica e comportamento aditivo em um modelo animal. Foram utilizados camundongos machos Swiss, não-isogênicos, expostos a um modelo de livre escolha entre três soluções (água, etanol 5% v/v e 10% v/v) por um período que consistia de quatro fases: aquisição (AQUI), abstinência (ABS), reapresentação (RE) e adulteração com quinina (AD). Depois, os camundongos foram classificados comportamentalmente em três grupos: consumidor sem-controle (A; preferência por etanol e alto consumo dessa droga durante todas as fases), consumidor pesado (P; preferência por etanol e alto consumo durante a fase AQUI e redução significativa na fase AD) e consumidor leve (L; preferência por água e baixo consumo de etanol em todas as fases). Análise de microarranjo usando RNA total dos núcleos da amígdala cerebral mostrou que a via do metabolismo do ácido graxo estava alterada pelo tratamento por livre escolha. Análises posteriores usando reação de cadeia de polimerase em tempo real dos genes selecionados pelos dados do microarranjo mostraram que, o gene Acss2 estava significativamente aumentado apenas nos camundongos sem-controle. Ainda, nesse grupo foi observada uma correlação inversamente significativa entre os níveis dos transcritos do gene Hadh e outros genes do metabolismo energético cerebral nessa mesma área, sugerindo que talvez alterações nessa via possam contribuir para a manutenção do consumo de etanol nos camundongos sem-controle. Para avaliar o envolvimento do receptor GABAB, o RNAm dos genes Gabbr1 e Gabbr2 foi quantificado pela reação de cadeia de polimerase em tempo real no córtex pré-frontal, hipotálamo, hipocampo e estriado. No córtex pré-frontal dos camundongos do grupo A, foi observado um aumento dos níveis dos transcritos do Gabbr1 e Gabbr2, sendo significativo para o Gabbr1 comparado com os outros grupos. No hipocampo foi observada uma redução nos níveis desses dois genes, sendo significativo para o Gabbr2 nos animais do grupo A comparado aos demais grupos. No estriado, foi encontrado um aumento significativo nos níveis dos transcritos do Gabbr1 apenas no grupo A. Nenhuma diferença foi observada na região do hipotálamo. Considerando que as áreas cerebrais analisadas são relevantes para o comportamento de consumo das drogas, nossos resultados revelam que esses genes podem estar envolvidos com o consumo alto e persistente no grupo A. Além disso, o estudo do metabolismo energético cerebral e do receptor GABAB tem o potencial de produzir novas perspectivas para o delineamento da neuroplasticidade associada ao alcoolismo.

For the first time, we have demonstrated the relation between genes responsible for energy metabolism of the brain, genes of GABAergic pathway and addictive behavior in an animal model. We used non-inbred, Swiss mice exposed to a three-bottle free-choice model (water, 5% v/v ethanol, and 10% v/v ethanol) over a long period consisting of four phases: acquisition (AC), withdrawal (W),…

Advisors/Committee Members: Ana Lucia Brunialti Godard, Roseli Boerngen Lacerda, Ana Lucia Brunialti Godard, Alvaro Cantini Nunes, Maria Raquel Santos Carvalho, Cláudia Vianna Maurer Morelli, André de Avila Ramos.