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Made available in DSpace on 2019-08-12T10:40:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_flavia_ufmg_26_09_2013.pdf: 2014310 bytes, checksum: 36723b806fa38d2908fba2493827c880 (MD5) Previous issue date: 18

A biodiversidade tem importância significativa na economia de um país, podendo ser explorada principalmente como matéria-prima para diferentes setores industriais ou como fonte de informação através do acesso aos recursos biológicos. A Biotecnologia é vista como fonte potencial de inovação, cujos produtos e processos são importantes ferramentas para o desenvolvimento industrial e econômico do Brasil. Empresas públicas e privadas tem grande interesse nas inúmeras aplicações da Biotecnologia, especialmente na área da saúde, sendo a indústria farmacêutica um consistente exemplo disso. Uma forma de explorar a P&D na área farmacêutica é atrelando os conhecimentos técnicos da biotecnologia à biodiversidade para o desenvolvimento de novos medicamentos. A conservação da diversidade biológica se tornou tema de discussões públicas em nível internacional principalmente a partir da década de 1980. A discussão mais expressiva sobre a biodiversidade ocorreu em 1992 com a realização da Rio 92, ou Conferência das Nações Unidas sobre Meio Ambiente e Desenvolvimento, quando foi elaborada a Convenção sobre Diversidade Biológica (CDB), que foi o primeiro acordo mundial para a conservação e o uso sustentável da biodiversidade. O Brasil é um dos atuais 168 países signatários desta convenção. As determinações da CDB entraram no ordenamento jurídico brasileiro por meio de uma Medida Provisória MP nº 2.186-16/2001, o principal marco legal sobre este tema. Sua primeira edição foi criada tempestivamente em um contexto de ameaça de biopirataria, e apesar das 16 edições, a MP apresenta definições confusas e muitas lacunas. A legislação de acesso ao patrimônio genético tem forte influência na P&D e no desenvolvimento tecnológico do país e, em função dos problemas que apresenta, muitos defendem que ela se tornou um entrave para o desenvolvimento da pesquisa e, consequentemente, para a inovação no Brasil. O objetivo deste trabalho é analisar o arcabouço legal referente ao acesso ao patrimônio genético e a repartição de benefícios, a fim de identificar quais são seus pontos falhos, como eles interferem na P&D e na inovação e tentar propor soluções para isso. Foram analisados os conceitos apresentados nas legislações referentes ao assunto, bem como as autuações e deliberações, emitidas pelo CGen e pelo CNPq, de processos que solicitam a autorização de acesso para fins de pesquisa científica, bioprospecção e/ou desenvolvimento tecnológico. Por fim, por meio de dados do INPI, foi avaliado se esta legislação é aplicada de forma equivalente para nacionais e estrangeiros. Observou-se que a MP apresenta conceitos equivocados em termos biológicos, resultando no mau entendimento e na multiplicidade de interpretações da mesma. Os demais instrumentos jurídicos, embora elaborados para tentarem explicá-la, ainda deixam muitas lacunas.…

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Made available in DSpace on 2019-08-13T22:49:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_fernanda_costal_oliveira_pdf.pdf: 3431241 bytes, checksum: 8b90adbe369e63ada6321d947823ce16 (MD5) Previous issue date: 30

O escorpião Hadruroides lunatus é o mais abundante na costa central do Peru, onde ocorre a maioria dos casos de picadas e envenenamento em humanos. Entretanto, pouco se sabe sobre a composição e mecanismo de ação do veneno. Este trabalho tem como objetivo descrever, em termos gerais, a caracterização bioquímica, imunológica e farmacológica do veneno de H. lunatus, assim como analisar a patofisiologia de seu envenenamento. Análises proteômica mostraram que o veneno é composto por peptídeos e proteínas com massas moleculares que variam entre 2.000 e 70.000 Da. A dose letal média (DL50) via intracranial (i.c.) e via intraperitoneal (i.p.), em camundongos, foram determinadas como 0,1 mg/kg e 21,55 mg/kg, respectivamente. Como parâmetros bioquímicos foram avaliadas as atividades hialuronidásica, proteolítica e fosfolipásica. No que se refere aos estudos imunológicos, demonstramos a existência de reatividade cruzada entre o veneno de H. lunatus e os venenos de Centruroides sculpturatus e Tityus serrulatus. A análise hematológica de ratos envenenados mostrou que houve uma diminuição significativa de leucócitos, neutrófilos, linfócitos e eosinófilos nesses animais. Além disso, foi detectado um aumento nos níveis séricos de proteínas totais, albumina e proteínas de fase aguda, assim como de CK, CK-MB, AST e LDH. Esses dados, juntamente com a observação de que a produção de IL-6 se encontrou elevada em camundongos envenenados, sugerem a presença de inflamação e lesão muscular. A análise histopatológica dos pulmões de ratos injetados com veneno revelou a presença de hemorragia difusa. Foi observado que o veneno estudado leva ao aumento da frequência cardíaca e causa diversas arritmias, prejudicando assim o funcionamento do coração. A análise do transiente de cálcio em cardiomiócitos confirmou o efeito deletério que o veneno exerce sobre o coração, já que este se apresentou diminuído. Estes dados sugerem que, apesar de apresentar toxicidade moderada para mamíferos o veneno de H. lunatus é capaz de induzir efeitos típicos do envenenamento escorpiônico, como as alterações cardiopulmonares demonstradas, além de apresentar atividades menos comuns nos venenos escorpiônicos, como a proteolítica e fosfolipásica, justificando o estudo mais aprofundado deste veneno.

Hadruroides lunatus scorpions are the most abundant in the Peruvian central coast, where occurs most of the cases of stings and envenoming in humans. However, little is known about the composition and mechanism of action of venom. The aim of this study is to describe, in general terms, the biochemical, immunological and pharmacological characterization of H. lunatus venom as well as to analyze the pathophysiology of its envenoming. Proteomic analysis showed that H. lunatus venom is composed of peptides and proteins with molecular weights…

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Made available in DSpace on 2019-08-10T18:49:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_final_corrigida.pdf: 9362826 bytes, checksum: 030dbdf67fe1968e3ac9100abb29428d (MD5) Previous issue date: 21

A cristalografia de raios-X, em relação ao número de estruturas depositadas no Protein Data Bank (PDB), é o método mais utilizado para se obter informações estruturais de macromoléculas biológicas. Tais informações são úteis para o entendimento dos sistemas biológicos dos quais essas macromoléculas participam. Nesse trabalho, duas proteínas com interesse biotecnológico foram estudadas do ponto de vista bioquímico e estrutural: a proteína antigênica Pb27 de Paracoccidioides brasiliensis e a enzima NahF de Pseudomonas putida. O fungo P. brasiliensis é o agente causador de uma das mais importantes micoses sistêmicas do Brasil, a paracoccidioidomicose (PCM) e a proteína Pb27, apesar de já ter sido utilizada com alta especificidade e sensibilidade no diagnóstico e como adjuvante no tratamento da PCM, tem sua função ainda desconhecida e não apresenta proteínas similares com estrutura terciária resolvida. Com o intuito de resolver sua estrutura por cristalografia de raios-X, a proteína Pb27 recombinante (Pb27r) foi expressa em bactérias E. coli BL21(DE3) e purificada por cromatografia de afinidade e gel filtração de onde eluiu com volume equivalente a um monômero (24 kDa após remoção da cauda de histidinas N-terminal). Estudos de espalhamento dinâmico de luz (DLS) e dicroísmo circular (CD) mostraram essa proteína estava monodispersa e enovelada. Cristais da Pb27 foram obtidos em MgCl2 0,25 M, PEG 4000 25%, Tris-Cl 100 mM pH 7,0, com grupo espacial P212121 e difrataram com resolução de 1,9 Å. Para a obtenção de cristais derivados para a resolução da estrutura da Pb27r por espalhamento anômalo ou substituição isomórfica, foram realizados soaking e co-cristalização com sais de átomos pesados (NaI, CsCl, GdCl3, sais de Hg e Pt) além de marcação com Se-Met, no entanto, ainda não foram obtidos cristais com diferença isomórfica/anômala suficiente para determinação da estrutura da Pb27. Já a enzima NahF catalisa a oxidação do salicilaldeído em salicilato utilizando NAD+ como cofator, última reação da via superior de degradação do naftaleno em P. putida. O naftaleno é o composto mais abundante e tóxico do petróleo e tem sido utilizado como modelo em estudos de biorremediação. Para a compreensão dos determinantes estruturais da atividade dessa enzima, a proteína NahF recombinante (NahFr) foi expressa em E. coli Arctic Express a 12 °C e purificada por cromatografias de afinidade e gel filtração de onde eluiu em três frações. A fração principal, que continha a proteína em sua forma dimérica e monodispersa (dados obtidos por DLS) foi utilizada em ensaios cinéticos e estruturais. A NahFr apresentou maior atividade em pH 8,5 e 60 °C. EDTA, DTT e SDS inibiram a atividade enzimática enquanto Ni2+ a elevou em quase 20%. A enzima apresentou altos valores de kcat/KM e preferência para aldeídos aromáticos e por aldeídos alifáticos…

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Made available in DSpace on 2019-08-12T18:01:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 flavia_figueiredo_de_rezende.pdf: 7798 bytes, checksum: d2f03086acfbd00da0fe19ba13a1ad96 (MD5) Previous issue date: 6

Peptídeos potenciadores de bradicinina (PPB) podem ser encontrados em diferentes fontes animais, e, do ponto de vista estrutural, estes peptídeos apresentam uma assinatura contendo um resíduo de ácido piroglutâmico no N-terminal e dois resíduos de prolina na porção C-terminal. O peptídeo TsHpt-I foi previamente isolado da peçonha do escorpião amarelo Tityus serrulatus e descrito como um PPB. Embora apresente o motivo estrutural Pro-Pro, este peptídeo não inibe a enzima conversora de angiotensina (ECA), como descrito para outros PPBs conhecidos, além de ser capaz tanto de potenciar a bradicinina quanto induzir uma rápida e transiente hipotensão in vivo em ratos normotensos.Para avaliar a possível participação de receptores de bradicinina na hipotensão mediada pelo TsHpt-I, células CHO transfectadas com os receptores de bradicinina e marcadas com DAF foram observadas por microscopia confocal perante o estímulo com TsHpt-I. Foi possível observar um aumento na fluorescência induzida pela produção de óxido nítrico em células estimuladas com BK (controle) e TsHpt-I. Análises de western blotting em células CHO-B2 mostraram a fosforilação da Ser1177, o resíduo excitatório da eNOS, na presença de BK e TsHpt-I, corroborando os resultados obtidos pela microscopia confocal.Em ensaio semelhante ao utilizado em células CHO-B2, a liberação de óxido nítrico foi avaliada em cardiomiócitos, que expressam constitutivamente os receptores de cininas. Nestas células, o peptídeo TsHpt-I, assim como a bradicinina, também induziram a liberação de NO, sendo este efeito abolido por HOE 140, um antagonista de B2R. Um análogo sintético estruturalmente minimizado, de apenas três aminoácidos (KPP), foi capaz de manter a atividade observada para o peptídeo integro. A acetilação da cadeia lateral da lisina (acKPP), aboliu a liberação de oxido nítrico, sugerindo que a carga positiva deste aminoácido seja essencial para o efeito agonista dos peptídeos no receptor. Ao estimular os cardiomiocitos com o análogo KPP na presença de HOE 140, a fluorescência também foi abolida, assim como observado para TsHpt-I. Em cardiomiocitos de animais duplo knockout para B1/B2, não houve liberação de NO nas presenças de BK, TsHpt-I e KPP. Neste experimento, somente o grupo controle positivo (Ang(1-7)) aumentou a fluorescência.Os resultados sugerem a ativação direta de B2R como o modo de ação primário de TsHpt-I, sendo que o peptídeo análogo, de apenas três aminoácidos, é capaz de manter este efeito. Foi ainda observado que a carga positiva da cadeia lateral da lisina é essencial para esta atividade.

Bradykinin Potentiating Peptides (BPPs) can be found in different animal sources and, from the structural point of view, share a common signature with a Pyroglutamic acid residue in the N-terminus and a doublet Pro-Pro residues at the C-terminal portion.…

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Made available in DSpace on 2019-08-12T00:53:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_eder.pdf: 593614 bytes, checksum: bf81e2d84aac3951afc521b52232f82c (MD5) Previous issue date: 10

Verificamos neste trabalho os efeitos do veneno do escorpião brasileiro Tityus bahiensis sobre correntes de sódio em corpos celulares de neurônios dos gânglios da raiz dorsal (DRG) submetidos a registros eletrofisiológicos na modalidade wholecell patch clamp. Em condições de controle, a inativação da corrente de sódio a 0 mV exibiu dois componentes cinéticos, um rápido (tau = 2,15 ± 0,18 ms) e um mais lento (tau = 13,19 ± 3 ms). Em condições experimentais, quando utilizamos o veneno de Tityus bahiensis numa diluição de 1:500 (concentração da proteína de 5,74 ìg/mL), houve uma redução na fração da corrente que se inativa rapidamente (de 80 ± 14 para 60 ± 9 %). O aumento na constante de tempo que se inativa rapidamente não foi alterado significativamente (tau = 2,37 ± 0,4 ms), mas houve um incremento na constante de tempo da inativação lenta (25,74 ± 3,18 ms). Houve, ainda, um aumento na fração da corrente que se inativa lentamente (de 14,1 ± 0,6 para 36 ± 0.4%) e surgimento de um componente persistente da corrente que não inativou mesmo durante pulsos despolarizantes longos (50 a 100 ms). Adicionalmente, na presença do veneno de Tityus bahiensis em condições experimentais, houve o surgimento de um componente que ativa rapidamente as correntes de sódio, independentemente da presença de um pré-pulso com potencial intensamente despolarizante (+50 mV). Nossos resultados concordam com Campos et al. (2007) e mostram que um prépulso não tem efeito nas correntes de sódio geradas, diferentemente da hipótese levantada por Cestèle et al. (2006). Na tentativa de constatar sobre quais isoformas de canais para sódio o veneno de Tityus bahiensis age, utilizamos tetrodotoxina (0,25 - 1ìM) com a finalidade de isolar farmacologicamente as correntes de sódio resistentes a tetrodotoxina, submetê-las a pulsos despolarizantes a 0 mV e verificar oefeito do veneno na cinética das suas correntes. O veneno não foi capaz de gerar efeitos nestas condições experimentais. Assim como os venenos de outros escorpiões, o veneno de Tityus bahiensis contém toxinas capazes de interferir na cinética de ativação e inativação dos canais para sódio sensíveis à tetrodotoxina, realizando ações típicas de toxinas de escorpião do tipo á e â.

In this study, we tested the effects of Tityus bahiensis scorpion venom on sodium currents recorded from the cell bodies of rat dorsal root ganglion neurons using the whole-cell patch clamp technique. In control conditions, sodium current inactivation at 0 mV exhibited two kinetic components, one fast (tau = 2.15 ± 0.18 ms) and one slow(tau = 13.19 ± 3 ms). In the presence of Tityus bahiensis venom at a dilution of 1:500 (concentration of 5.74 ìg/mL), there was a decrease in the fraction of current comprising the fast component of inactivation (from 80 ± 14 to 60 ± 9 %). The fast time constant of inactivation was…

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Made available in DSpace on 2019-08-10T08:10:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 7241526 bytes, checksum: fea687a6caceffcb039b2155739510e2 (MD5) Previous issue date: 20

Nos últimos anos, os avanços científicos e metodológicos, juntamente com o acelerado processamento de informações, proporcionaram um desenvolvimento exponencial na área da Saúde nas suas mais diversas áreas como diagnósticos, desenvolvimento de fármacos, clínica e etc. No campo da medicina regenerativa, esse fenômeno vem caminhando com maior velocidade desde a década de 50, quando os antígenos de histocompatibilidade humana (HLA) foram descobertos (Degos, 2009) e o entendimento sobre o processo de rejeição aos transplantes foi mais bem compreendido. Um marco importante na história recente dos transplantes ocorreu na década de 60, quando se obtiveram os primeiros transplantes bem sucedidos de medula óssea, os quais possibilitaram a cura para diversos tipos de leucemias (Adams et al., 1967). A crescente demanda pela medicina regenerativa, focada no potencial terapêutico das células-tronco, tem feito com que essas células venham sendo amplamente estudadas e seus segredos desvendados (Nadig, 2009). As células-tronco são consideradas, hoje, dentro das possibilidades terapêuticas de reposição e regeneração tecidual, uma realidade com bases teórico-práticas, que se desenvolve com precisão e segurança para uma transição do ponto experimental para a clínica médica (Fraser et al., 2004; Zuk, 2001).

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Made available in DSpace on 2019-08-10T19:17:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta__o_paula_ciscotto.pdf: 1165099 bytes, checksum: 0942f76a2146ce0e783d9c0a873bcad0 (MD5) Previous issue date: 25

Os venenos de animais peçonhentos constituem rica fonte de informação para os pesquisadores, por serem compostos de substâncias biologicamente ativas. Dentre essas substâncias destacam-se as proteínas e os peptídeos que, ao serem caracterizados, possibilitam o seu entendimento funcional, além de promover uma possível aplicabilidade biotecnológica. O presente trabalho teve início após a observação que entre diferentes venenos de animais peçonhentos testados quanto à capacidade antibacteriana, os das serpentes do gênero Bothrops apresentaram significante atividade, principalmente B. jararaca. O veneno de B. jararaca mostrou-se capaz de inibir o crescimento de bactérias gram-positivas e gram-negativas, sendo então fracionado pela combinação sucessiva das cromatografias de gel filtração, troca aniônica e afinidade à heparina, obtendo-se ao final dos processos uma fração com atividade antibacteriana. A atividade antibacteriana está diretamente ligada a atividade L-aminoácido oxidase. A fração purificada HTP1 e o veneno bruto apresentaram também atividade antiparasitária, matando formas promastigotas de Leishmania amazonensis e atividade hemolítica, promovendo a lise parcial de hemácias de cavalo. As atividades biológicas de HTP1 foram inibidas pela adição de catalase, um antioxidante, o que leva a sugerir a ligação direta do peróxido de hidrogênio nestas atividades. Após cromatografia de troca aniônica foi purificada uma proteína heterodimérica, denominada proteína P8 com massa molecular de 30260,87 Da observada por espectrômetro de massa. Após redução das ligações dissulfetos esta apresentou duas subunidades com 15,8 kDa e 14,4 kDa. A seqüência de aminoácidos da região N-terminal da subunidade P8a foi DCPSGWSSYEGNCYKFFQQK, e da subunidade P8b foi XCPPDWSSYEGHCYRFFKEE. As subunidades da proteína P8 apresentaram alto grau de identidade com proteínas tipo-lectina tipo-C. A atividade antigênica da proteína P8 foi caracterizada e foi observado que a potência de antivenenos botrópicos se correlacionou com títulos de anticorpos medidos por ELISA, quando esta proteína foi imobilizada nas placas.

Snake venoms contain many proteinaceous components which incapacitate and digest prey. Neurotoxins, cytotoxins, myotoxins, proteases and nucleases are found in varying quantities in snake venoms. The biochemical characterization of these compounds would facilitate the study of their functions and give a clue of their applicability in biotechnology. Venoms from 13 different animal species were tested using agar diffusion assay for antibacterial effects against Staphylococcus aureus. The venoms from five species of Bothrops showed strong antibacterial effects, mainly Bothrops jararaca venom. The crude venom from B. jararaca displayed antibacterial activity against various gram-negative and gram-positive bacteria.…

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Made available in DSpace on 2019-08-11T02:10:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_doutorado_paula_ciscotto_final.pdf: 4571922 bytes, checksum: 996f5e705829b258659dcf1c8b64a6ac (MD5) Previous issue date: 9

Com o desenvolvimento tecnológico, áreas da pesquisa como a proteômica, análises anti-venômicas e prospecção de novas proteínas com atividade biológica em venenenos de serpentes vem crescendo nos últimos anos. Estudos de venenos raros e de difícil obtenção, como os venenos de serpentes do gênero Micrurus começaram a ser realizados com maior frequencia. O gênero Micrurus (cobra coral) é o principal representante da família Elapidae nas Américas e compreende 61 espécies distribuídas do Sul dos Estados Unidos ao sul da América do Sul. No envenenamento por espécies deste gênero são observados sintomas neurotóxicos devidos a um progressivo bloqueio da transmissão neuromuscular, o que pode levar a vítima à morte por paralisia muscular e parada respiratória. Apesar da sua alta toxicidade poucas informações existem acerca da caracterização bioquímica e farmacológica desse veneno. No presente trabalho, em um primeiro momento, análises proteômicas foram realizadas objetivando o melhor entendimento da composição dos venenos das espécies M. frontalis, M. ibiboboca e M. lemniscatus. Nos três venenos investigados, proteínas com massa moleculares entre 6 e 8 kDa e 12 e 14 kDa mostraram-se mais abundantes. Por meio de sequenciamento Nterminal de proteinas purificadas, seqüenciamento por espectrometria de massa (MS/MS) de peptídeos trípticos de eletroforese bidimensional e pesquisa de similaridade em bancos de dados, foi verificado que os venenos são compostos de proteínas similares à: neurotoxinas de cadeia curta e de cadeia longa, weak neurotoxinas, venom protein E2, frontoxina III, precursores de lectina tipo C, PLA2, LAO, metaloproteases e â-bungarotoxina. Ainda, forma relatados pela primeira vez, a sequência N-terminal de sete proteínas purificadas do veneno de M. lemniscatus, similares à 3FTx, PLA2 e inibidores de proteases do tipo-kunitz já descritas em venenos de outras Micrurus e Elapídeos. Em um segundo momento, a atividade anti-venômica foi investigada por meio da reação cruzada entre diferentes venenos de Micrurus e antivenenos mono e polivalente, por meio de eletroforese bidimensional e immunoblotting. O antiveneno polivalente anti-Elapídico apresentou maior grau de reatividade cruzada com os venenos de M. frontalis, M. ibiboboca, M. lemniscatus e de espécimes peruanos de M. spixii, sendo este último usado como um ponto externo, exemplificando um veneno que não é comumente encontrado no Brasil. Ainda, o anti M. corallinus reagiu fracamente com as proteínas dos venenos testados, tendo o anti-M. ibiboboca mostrado melhor reação quando comparado ao anti-M.corallinus. As proteínas mais imunogências dos venenos pertencem são similares a 3FTx, PLA2, âbungarotoxin, venom protein E2, frontoxina III, LAO e proteínas tipo lectina tipo C. As implicações destes resultados para a produção de antivenenos…

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Made available in DSpace on 2019-08-14T16:58:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 bernardo_resumo.pdf: 16097 bytes, checksum: 85e6b3d5e11538ded77e8f603793f036 (MD5) Previous issue date: 27

Aparacoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica, granulomatosa eendêmica da América Latina, cujo agente etiológico éo fungoParacoccidioides brasiliensis. O diagnóstico da infecção é,principalmente,realizado por biópsia do tecido acometido. Diversos pesquisadores têmvoltado sues esforços na tentativa de isolar antígenos capazes dediagnosticar, sorologicamente, pacientes comPCM, assimcomo desencadearuma resposta protetora à infecção. Oantígeno Mexo,obtido a partir daP. brasiliensis foicapaz deextração das proteínas extracelulares do fungodiscriminar pacientes comPCM de indivíduos não infectados comsensibilidade de 100%. Alémdisso, pacientes emtratamento diminuemounão mais reconhecemantígenos presentes no Mexo. Uma proteína de 28 kDa(Pb28), presente no Mexo,foireconhecida por100% dos soros de pacientescomPCM testados.Essa proteína se mostrou altamente específica àinfecção, não sendo reconhecida pornenhumdos soros depacientes cominfecções diversas testados. APb28 foipurificada porFPLC e HPLC e aseqüência de sua região N-terminaldeterminada. As análises de homologia esimilaridade embancos de dados demonstraramque a Pb28 corresponde a umP. brasiliensis. Utilizando a mesma estratégia de purificaçãonovo antígeno de sequenciamento da região N-terminal, uma outra proteína dtambémreconhecida por soro de pacientes comPCM, foiidentificada. Essaproteína foicaracterizada como sendo o antígeno de 27 kDa do fungo(U41503.1), até então uma proteína hipotética, e denominada de Pb27r. Aseqüência de DNAcodificadora para a proteína Pb27r foiamplificada, clonadexpressa emsistema de expressão pGEX-4T-2.Estudosimunológicos coma Pb27r purificada demonstraramque essa proteína éaltamente sensível(80,5%) e específica (100%) àPCM emensaios de ELISAcomsoros humanos. Ela ainda foicapaz de induzir resposta imunológicaprotetora,comalta produção deIgG2b, emcamundongos Balb/C imunizadoscoma proteína e infectados como isolado virulento do fungo,Pb18. Estudosbioquímicos da Pb27r determinarama presença de 31,0% deestruturas -hélices;10,7% deestruturas folha-ß antiparalelas;9,0% deestruturas folha-ß paralelas ;17,3% deestruturas ß-Turn;32,4%de estruturas randômicas.Anticorpos Anti-Pb27r foramcapazes de localizar a proteína Pb27r nasuperfície do fungo.Esses resultados demonstramque ambas proteínas aquiestudas, Pb28 e Pb27r,têmcapacidade de discriminar pacientes comPCMpodendo serutilizadas emensaios de imunodiagnóstico e, a Pb27r podetambémser usada na confecção de vacina contrao fungo.

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Made available in DSpace on 2019-08-10T21:13:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_doutorado_m_rcia.pdf: 3041569 bytes, checksum: 2adcd02129bb48d3da46ec5b82be7c1a (MD5) Previous issue date: 15

A existência do sistema renina-angiotensina (SRA) tem sido demonstrada no trato reprodutivo feminino. Neste local este sistema poderia estar funcionando independentemente ou em consonância com o sistema circulante, participando da regulação de vários aspectos funcionais, inclusive, em situações de anormalidades evidenciadas durante a gestação. Todos os componentes do SRA, incluindo o receptor AT1 foram identificados em placenta de humano. A tonina é uma serinoproteinase presente em muitos tecidos de rato, capaz de hidrolisar tanto o angiotensinogênio como a angiotensina I e liberar o peptídeo vasoativo angiotensina II (Ang II). O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar enzima com atividade tonina de tecido placentário humano. Placentas de mulheres hígidas foram obtidas em hospital público, após consentimento formal das pacientes. Logo após o parto, a placenta era colocada em saco plástico e mergulhada em gelo seco para o transporte e armazenamento a -80°C. No processamento, a placenta era descongelada e lavada com solução fisiológica em abundância para retirada do excesso de sangue. Fragmentos placentários eram homogeneizados em sacarose 0,25 M pH 7,0, contendo coquetel de inibidores. O homogenato bruto era tratado com sulfato de amônio a 25, 50 e 80% para precipitação das proteínas. Os precipitados eram ressuspendidos em água, dialisados e a atividade liberadora de Ang II rastreada através de radioimunoensaio. A atividade liberadora de angiotensina II foi verificada na fração 50%. Alíquotas desta fração foram aplicadas em cromatografia em coluna Superdex HR-200. As frações ativas desta etapa foram reunidas, concentradas contra polietileno glicol 6000, submetidas à diálise exaustiva contra tampão Tris-HCl 20 mM pH 8,4. Esse material foi aplicado em coluna Q-Sepharose, eluída com este mesmo tampão (etapa inicial) e com gradiente de NaCl. A fração ativa obtida em 100 mM de NaCl foi aplicada em coluna Phenyl- Superose eluída com gradiente linear (1,7 a 0,0 M) de sulfato de amônio. A atividade liberadora de Ang II e o perfil de proteínas em eletroforese eram analisados em cada etapa de purificação. Testes de inibição das frações ativas em Q- Sepharose foram realizados na presença dos inibidores (PMSF a 10 mM; pepstatina A 1 e10 mM e aprotinina 1 mM). Analisou-se também, a presença de atividade angiotensinásica e atividade liberadora de angiotensina I (Ang I). Foi identificada a presença de duas frações liberadoras de Ang II em tecido placentário humano; ambas, inibidas por PMSF, porém, não inibidas por pepstatina A e aprotinina. A atividade angiotensinásica e a atividade liberadora de Ang I não foram detectadas. A massa molecular estimada para as duas frações ativas é de 52 kDa. A seqüência N-terminal da proteína encontrada para a fração ativa 100 mM/NaCl foi EVQLVESGGGL.

The existence of a…

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Made available in DSpace on 2019-08-14T12:53:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_clara_guerra_duarte.pdf: 21220618 bytes, checksum: 1b868ec29017f8439171af5ee50efc06 (MD5) Previous issue date: 4

Mesmo com um tratamento ja bem estabelecido e antivenenos eficientes disponiveis no mercado, o envenenamento por escorpioes ainda constitui um grave problema de saude publica mundial. Apesar da evolucao na formulacao dos antivenenos, pouco tem sido efetivamente feito para melhorar a etapa de producao inicial deste soro: a imunizacao do animal produtor. O estudo de imunogenos que sejam eficazes na geracao de anticorpos neutralizantes e que nao sejam toxicos para oanimal produtor seria, portanto, de grande interesse. A identificacao de epitopos em um antigeno e importante para a caracterizacao de anticorpos, bem como para o entendimento das bases moleculares da antigenicidade e imunogenicidade, alem de ter aplicacao direta na manipulacao deste antigeno para sua utilizacao como imunogeno. Este trabalho teve como finalidade mapear, atraves de tecnicas que combinam abordagens bioinformaticas e experimentais, epitopos descontinuos de toxinas escorpionicas de relevancia medica e biotecnologica, como a AaH2 e a Ts3 , e de anatoxinas com potencial neutralizante, TsNTxP e Amm8. Foram identificados potenciais epitopos conformacionais nestas toxinas, utilizando-se anticorpos neutralizantes gerados a partir delas. Estes epitopos mapeados aparentemente se relacionam com a superficie bioativa determinada para a familia das -toxinas que afetam canais para sodio escorpionicas, justificando seu potencial neutralizante. A identificacao de tais epitopos contribui para um melhor entendimento da imunoquimica das toxinas e pode auxiliar no desenvolvimento de imunogenos para a criacao de uma nova geracao de imunoterapicos, mais especificos, seguros e eficazes para o tratamento dos acidentes escorpionicos.

Scorpionism is still a worldwide health problem, even though there is a well stabilished treatment and good quality antivenoms available. Despite the evolution in the prepararation of antivenoms, the first step in this process, the immunization of animals, has not followed this development. The study of immunogens that are capable of eliciting neutralizing antibodies but that are not toxic for the producer animal would be of great interest. The identification of epitopes within an antigen isimportant for the characterization of antibodies, as well as for the generalunderstanding of the molecular basis of antigenicity and immunogenicity, and can be directly applied in the manipulation of the antigen to be used as an immunogen. The main goal of this work was to map, through a combined approach of bioinformatics and experimentation, discontinuous epitopes in scorpion toxins of medical and biotechnological interest, as AaH2 and Ts3, and anatoxins with neutralizing potential, TsNTxP and Amm8. Putative discontinuous epitopes were identified, using neutralizing antibodies generated by immunization with these proteins. The…

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Made available in DSpace on 2019-08-13T07:56:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fran_oise.pdf: 26471 bytes, checksum: 718624d6228cd8016b20bc181c1fa261 (MD5) Previous issue date: 16

Há crescentes evidências que mostram que a modificação da LDL tem um papel potencial na aterogênese. No presente estudo, o floranol (3,5,7,2-tetrahiroxi-6-methoxi-8-prenilflavanona), um flavonóide isolado das raízes de Dioclea grandiflora, inibiu, com sucesso, a oxidação da LDL na presença de íons cobre avaliada pela formação de dieno conjugado e pelas subtâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. Como o mecanismo antioxidante pode envolver a coordenação com metais, tentamos compreender em detalhes as interações do floranol com Cu(II) e Fe(III) pela combinção de espectrofotometria UV-Visível (UV-Vis), espectrometria de massa, voltametria cíclica. As constantes de acidez do ligante, bem como, as constantes de estabilidade dos complexos metálicos foram calculadas. Os valores de pKa foram determinados 6.58, 11.97 e 13.87 e a ordem das constantes de acidez proposta foi 7-OH > 5-OH > 2-OH. O melhor ajuste entre os espectros experimentais e calculados foi obtido assumindo a formação de dois complexos de Cu(II): [CuL] log = 19.34 ± 0.05 e [CuL2]2 log = 26.4 ± 0.10 e três complexos de Fe(III): [FeL3]3 log = 44.72 ± 0.09, [FeL2] log = 35.32 ± 0.08 e [FeL]+ log = 19.51 ± 0.04. Além disso, a redução de cobre e ferro é menos favorável na presença de floranol. Esses resultados indicam que o floranol pode eficientemente ligar-se ao Cu(II) e ao Fe(III) prevenindo a oxidação da LDL por tais metais. Outro mecanismo antioxidante dos flavonóides é sua capacidade de seqüestrar radicais livres. Avaliamos, por quimioluminescência, o efeito antioxidante do floranol em macrófagos de camundongos ativados de camundongos deficientes para o gene da apoliproteína E (ApoE-/-), da óxido nítrico sintase indutível (iNOS-/-) e da linhagem selvagem C57Bl/6. Nós demonstramos o efeito atenuador do floranol no surto oxidativo de macrófagos das três linhagens experimentais estudadas, ativados com zymosan, que receberam diferentes concentrações de floranol. Em conjunto, os dados obtidos neste estudo mostram que o floranol atua com um antioxidante pela capacidade de quelar íons Cu(II) e Fe(III) e através da interação direta com radicais livres.

Increasing evidences support the oxidative modification of LDL as playing a potential role in atherosclerosis. In the present study, floranol (3,5,7,2-tetrahyroxy-6-methoxy-8-prenylflavanone), a flavonoid isolated from the roots of Dioclea grandiflora, successfully inhibited the oxidation of LDL in the presence of copper ions as measured by conjugated diene formation and thiobarbituric acid-reacting substances (TBARS). As the antioxidant mechanism may involve metal coordination, we have undertaken a detailed study of floranol interactions with Cu(II) and Fe(III) by combination of UVvisible (UVVis) and mass spectrometry and cyclic voltammetry measurements. The acidity constants of the ligand, as well as the…

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Made available in DSpace on 2019-08-12T04:30:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 parte_i_final.pdf: 81465 bytes, checksum: 457adce5dd2fe9093f7dbca9a24be358 (MD5) parte_ii_final.pdf: 946363 bytes, checksum: 2f09bef73f708c6c6a2da9f359bf48b8 (MD5) Previous issue date: 24

O veneno de escorpião é uma rica fonte de peptídeos biologicamente ativos que atuam em diferentes alvos nos sistemas nervoso e cardiovascular. Uma nova família estrutural de peptídeos foi encontrada no veneno do escorpião amarelo Tityus serrulatus. Essa família, denominada TsHpTP (Tityus serrulatus HypoTensive Peptides), possui uma assinatura estrutural típica dos peptídeos potenciadores de bradicinina (PPB) na sua porção C-terminal. TsHpT-I, um peptídeo de 2722 Da, foi capaz de potencializar o efeito hipotensor da bradicinina (BK) em ratos normotensos, quando injetado via intravenosa. Foi verificado que este peptídeo possui na sua porção C-terminal, dois sítios de resistência à hidrólise por carboxipeptidase Y (Lys17-Glu18 e Pro23-Pro24), o que norteou a construção de dois peptídeos sintéticos (TsHpT17-25 e TsHpTac17-25am, um análogo que possui uma acetilação N-terminal e uma amidação C-terminal), utilizando a porção C-terminal de TsHpT-I. O efeito hipotensor da bradicinina foi mantido nestes dois análogos sintéticos, indicando que a porção C-terminal do peptídeo nativo é essencial para sua ação farmacológica. Ainda, um importante efeito hipotensor independente da injeção de BK foi verificado, o que mostra que estes peptídeos são, intrinsecamente, agentes hipotensores. Para estudar este efeito hipotensor causado por estes peptídeos, o peptídeo TsHpT17-25 foi testado em ratos de linhagens hipertensas (SHR - Spontaneous Hypertensive Rats - e TGR - Transgenic Rats) sendo demonstrada, portanto, a capacidade de induzir uma hipotensão de longa duração. O peptídeo TsHpT17-25 foi também capaz de causar uma bradicardia nestes animais. Os mecanismos de ação dos peptídeos estudados não foram elucidados até o presente momento. Entretanto, é possível que a enzima conversora de angiotensina - um alvo conhecido dos PPB - não seja o alvo primário destes peptídeos. Experimentos preliminares obtidos por meio de estudo de microscopia confocal utilizando células CHO transfectadas com o receptor B2 de bradicinina, indicam que estes peptídeos são capazes de potenciar a liberação de óxido nítrico mediada por bradicinina, muito embora os mecanismos moleculares desta potenciação não tenham sido elucidados ainda.

Scorpion venom is a rich source of biologically active peptides that act in different systems, such as nervous and cardiovascular. A new structural family of peptides was found in the venom of the Brazilian yellow scorpion Tityus serrulatus. This family, named TsHpTP (Tityus serrulatus HypoTensive Peptides), has a typical bradykinin-potentiating peptide (BPP) amino acid signature at its C-terminal extremity. TsHpT-I, a 2722 Da peptide, was able to potentiate the hypotensive effects of bradykinin (BK) in normotensive rats. It was observed that…

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Made available in DSpace on 2019-08-10T06:56:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 9494 bytes, checksum: b1901e726fd6330544c1ccf1b30bc62b (MD5) Previous issue date: 28

Os escolopendromorfos são artrópodes venenosos, responsáveis por um significante número de acidentes com humanos, ainda que não letais. Apesar disso, informações sobre a composição e atividades biológicas dos venenos desses animais são bastante escassas. No presente estudo, foi empregada uma abordagem proteômica bottom-up combinando 2D-LC, ESI-Q-TOF/MS, seqüenciamento N-terminal e procuras por similaridades, para melhor entender as complexidades dos venenos de duas espécies de escolopendromorfos brasileiros: Scolopendra viridicornis nigra e Scolopendra angulata. Comparações entre os perfis de LC e composição de massas moleculares são apresentadas. Ainda, as seqüências N-terminais de dez famílias de peptídeos ou proteínas foram determinadas com sucesso. Entretanto, nove das dez famílias de peptídeos, cujas seqüências N-terminais foram determinadas, não apresentaram quaisquer similaridades com outras seqüências depositadas no banco de dados do Swiss-Prot. Uma prospecção de atividades inseticidas em frações do veneno de S. viridicornis nigra também foi realizada. Seis das 12 frações testadas foram responsáveis por claros efeitos tóxicos sobre moscas domésticas. Este trabalho demonstra que os venenos de escolopendromorfos são uma fonte latente para a descoberta de novas moléculas com potencial aplicação biotecnológica.

Centipedes are venomous arthropods responsible for a significant but non-lethal number of human envenomations. Despite this, information about the composition and function of their venom contents is scarce. In this study we have used a bottom-up proteomic approach combining 2D-LC, ESI-Q-TOF/MS, N-terminal sequencing and similarity searching to better understand the complexities of the venoms from two Brazilian centipede species: Scolopendra viridicornis nigra and Scolopendra angulata. Comparisons between the LC profiles and the mass compositions of the venoms of the two species are provided. Also, the N-termini of representatives of 10 protein/peptide families were successfully sequenced where nine of them showed no significant similarity to other protein sequences deposited in the Swiss-Prot database. A screening for insetotoxic activity in fractions from S. viridicornis venom has also been performed. Six of the 12 tested fractions were responsible for clear toxic effects in house flies. This work demonstrates that centipede venoms might be a neglected but important source of new bioactive compounds.

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Made available in DSpace on 2019-08-13T22:33:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_de_doutorado.pdf: 17215269 bytes, checksum: 27a53ddbbe202d4179579cb19baae3f0 (MD5) Previous issue date: 13

Leucurolisina-a (leuc-a) e uma metaloprotease de veneno de serpente (SVMP) de classe P-I presente no veneno de Bothrops leucurus. A leuc-a teve sua estrutura primaria completamente sequenciada, apresentando uma unica cadeia polipeptidica com 202 residuos de aminoacidos e alta similaridades com outras SVMPs de classe P-I ja descritas. A leuc-a, mesmo em altas concentracoes, nao provoca hemorragia, apresentando apenas atividade proteolitica em proteinas de matriz extracelular. Essa enzima foi cristalizada, pelo metodo de difusao de vapor, e dois conjuntos de dados de difracao de raios-x, um a 1,8 eoutro a 1,6 A, foram coletados. Os dados mostraram que os cristais pertencem ao grupo espacial P212121, com parametros de celula unitaria muito similares A estrutura cristalografica da leuc-a foi resolvida pelo metodo de substituicao molecular usando o modelo da metaloproteinase BaP1 (PDB code 1ND1) purificada do veneno da serpente Bothrops asper. O modelo da leuc-a, a 1,8 A de resolucao, foi refinado ate um Rfator final = 0,168 e Rlivre = 0,235. A estrutura apresenta o conservado motivo de ligacao ao zinco H142E143XXH146XXG149XXH152 assim como o motivo gmet turn h C164I165M166, caracteristico da superfamilia metzincina. Um atomo de zinco foi observado no sitio catalitico da enzima sendo estabilizado pelos NÃ2 dos tres aneis imidazolicos dos residuos de histidinas H142H146H152 e uma molecula de agua entre o espaco do atomo de zinco e a cadeia lateral do residuo E143. Um ion calcio tambem foi observado unido das extremidades N e C-terminais da estrutura. Esse atomo e estabilizado por duas moleculas de agua e cinco atomos presentes nas cadeias laterais de residuos conservados: o oxigenio da carbonila do residuo Glu9; os dois oxigenios do carboxilato do residuo Asp93, o oxigenio da carbonila do residuo Cys197 e o oxigenio da carboxamida do residuo Asn200. A leuc-a possui seis residuos de cisteina (Cys117-Cys197, Cys157-Cys164, and Cys159-Cys181) envolvidos na formacao de pontes dissulfeto. A resolucao de outro conjunto de dados, com 1,6 A de resolucao, apresentou uma densidade eletronica desconhecida no sitio catalitico da enzima. Esse ligante foi identificado, sintetizado e utilizado com sucesso em ensaios de inibicao da atividade proteolitica da leuc-a.

Leucurolysin-a (leuc-a) is a P-I class snake venom metalloproteinase (SVMP) from the venom of Bothrops leucurus, a poisonous snake which is responsible for the majority of snakebites in the northeast of Brazil. It has been shown that leuc-a degrades fibrin clots directly in vitro without activating plasminogen (Pg), and does not elicit any hemorrhagic response. Leuc-a is a single chain zinc binding endopeptidase composed of 202 amino acids residues, which shows high similarity with other P-I SVMPs. In this work, leuc-a was crystallized using the hanging-drop…

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Made available in DSpace on 2019-08-13T22:50:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rates_tese_2011.pdf: 6030009 bytes, checksum: 9b271ff4ec795a01f61fedef35f2c26c (MD5) Previous issue date: 9

O presente estudo visou à prospecção e caracterização de peptídeos biologicamente ativos em venenos de animais representantes da biodiversidade brasileira, nomeadamente, Tityus serrulatus (Arachnida, Scorpiones, Buthidae), Acanthoscurria natalensis (Arachnida, Araneae, Theraphosidae) e Phasmahyla jandaia (Anura, Hylidae, Phyllomedusinae). Para tanto, empregou-se espectrometria de massa como ferramenta central. Destacam-se o seqüenciamento de novas famílias ou variantes peptídicos do veneno de T. serrulatus e dasecreção dérmica de P. jandaia, o que permitiu inferências sobre a biologia desses sistemas defensivos, e a determinação da estrutura primária completa da toxina -TRTX-An1a do veneno de A. natalensis. Ademais, demonstrou-se que a -TRTX-An1a, em preparação deneurônios DUM de Periplaneta americana, provoca aumento na freqüência de descargas espontâneas e diminuição da amplitude dos potenciais de ação.

The present study aimed at the prospection and characterization of biologically active peptides in venoms of animal representatives of the Brazilian biodiversity, namely Tityus serrulatus (Arachnida, Scorpiones, Buthidae), Acanthoscurria natalensis (Arachnida, Araneae, Theraphosidae) and Phasmahyla jandaia (Anura, Hylidae, Phyllomedusinae). For the attainment of such goal, mass spectrometry was employed as the central tool. The sequencing of new peptidic families or variants from the venom of T. serrulatus and from theskin secretion of P. jandaia, which allowed inferences on the biology of these defensive systems, and the complete determination of the primary structure of the toxin -TRTX-An1a from the venom of A. natalensis are highlighted. Moreover, it has been demonstrated that - TRTX-An1a elicits an increase in the spontaneous discharges frequency and a diminishment in the action potential amplitude in Periplaneta americana DUM neuron preparation.

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Made available in DSpace on 2019-08-11T12:19:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_miriam_maria_silva_costa.pdf: 51723568 bytes, checksum: df7e62760abded6701a79ff293d00cb1 (MD5) Previous issue date: 14

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecciosa grave causada por protozoários do gênero Leishmania. Nas Américas, o cão é o principal reservatório da doença, principalmente nas áreas urbanas, onde encontra-se em grande expansão. A LV é fatal se não for tratada adequadamente e/ou diagnosticada precocemente, porém, a eficácia dos métodos diagnósticos e vacinas disponíveis permanece parcial, sendo necessário o desenvolvimento de novas estratégias. Vários estudos demonstraram o potencial da proteína A2, específica do estágio amastigota de Leishmania, como antígeno vacinal e diagnóstico. No presente trabalho, inicialmente, testamos este antígeno, administrado na forma de vacina de DNA e observamos proteção em camundongos contra a infecção por L. (L.) chagasi e L. (L.) amazonensis. A seguir, descrevemos a proteção, em estudos de fase II, com cães beagles vacinados com a proteína A2 associada ao adjuvante saponina (constituindo a vacina Leish-tec.) contra a infecção por L. (L.) chagasi. Com relação ao diagnóstico utilizando este antígeno, observamos que peptídeos provenientes de análises in silico da proteína A2, associados a peptídeos de outras proteínas como NH, LACK e K39 apresentaram elevada sensibilidade e especificidade em testes com soros humanos ecaninos. No entanto, a busca por antígenos vacinais e diagnóstico na LV é incessante, e o atual estágio de desenvolvimento tecnológico com a possibilidade de utilizar abordagem proteômica para identificação de centenas de antígenos imunogênicos simultaneamente é atraente. Dessa forma, optamos por uma abordagem proteômica associada a análises in silico para identificar novos antígenos de L. (L.) chagasi. Nossa análise proteômica foi a primeira a utilizar amastigotas purificadas de baço de hamster e, além disso, é o primeiro estudo a mapear a antigenicidade da infecção por L. (L.) chagasi utilizando soros de cães de fase aguda e crônica. Todas as proteínas selecionadas porwestern blot-2DE (WB-2DE) foram mapeadas para epítopos de células B pelo software BepiPred e submetidas `a imuno-ensaios em membranas de celulose resultando na seleção de 25 peptídeos com elevado potencial para o diagnóstico sorológico da LV. Paralelamente, foi utilizada a técnica de DIGE para comparar a expressão diferencial deproteínas entre as formas amastigota e promastigota de L. (L.) chagasi e 40 proteínas foram identificadas, sendo 25 aumentadas em promastigotas, 5 aumentadas em amastigotas e 10 com expressão similar em ambas as formas. Além disso, todas as proteínas identificadas no trabalho, tanto por DIGE como por WB-2DE, forammapeadas para epítopos de células T utilizando o software NetCTL que permitiu a seleção de potenciais candidatos para o desenvolvimento de vacinas. Por fim, para complementar a análise de predição para células B, as mesmas proteínas imunogênicas…

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Made available in DSpace on 2019-08-14T13:32:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 simara_sem_ramis_de_ara_jo_disserta__o_2010.pdf: 3140859 bytes, checksum: 424fcaac3d79a10de130dc2be43e36e5 (MD5) Previous issue date: 12

A família gênica masp (proteína de superfície associada a mucina), identificada durante a anotação do genoma do Trypanosoma cruzi, é a segunda maior família mutligênica neste parasito, consistindo de aproximadamente 1400 membros. Membros da família MASP contêm domínios N- e C-terminais conservados que codificam para um peptídeo sinal e um sítio de adição de âncora de GPI, respectivamente. A região central é variável em comprimento e em sequência de aminoácidos, e contém um grande repertório de motivos repetitivos, os quais sugerem que MASP esteja envolvida em interações parasito-hospedeiro. Uma vez que nenhum membro da família MASP foi caracterizado até o momento, decidiu-se estudar as estruturas secundária e terciária de diferentes MASPs. Para este objetivo, optou-se por clonar e expressar em Escherichia coli a região central das sequências de quatro membros MASP. Para isso, algumas características das proteínas alvo foram consideradas, tais como curto comprimento da sequência de aminoácidos, em torno de 170 resíduos, baixo conteúdo de sítios potenciais de glicosilação e baixo grau de desordem estrutural. Uma vez que regiões de baixa complexidade normalmente correspondem a segmentos desenovelados ou estruturas extendidas, foi utilizado o servidor PONDR VL-XT para predizer regiões desordenadas nos quatro membros MASP. Proteínas nativamente desenoveladas têm sido descritas por possuírem elevada taxa de resíduos carregados e baixa taxa de resíduos hidrofóbicos. Gráficos de carga líquida média versus taxa de hidrofobicidade foram obtidos para as regiões centrais das quatro MASPs. Estas análises revelaram a presença das quatro regiões centrais no espaço designado para proteínas nativamente desenoveladas. As sequências foram amplificadas por PCR, clonadas nos sistemas de clonagem TOPO e/ou pGEM-T e submetidas ao sequenciamento de DNA. Posteriormente, os produtos de PCR foram transferidos para dois vetores de expressão derivados do vetor pET-28a (Novagen), que foram modificados no Centro de Biologia Molecular e Estrutural (CeBiME, Campinas / SP). Em ambos os vetores, o sítio de reconhecimento por trombina foi substituído pelo sítio de reconhecimento da protease TEV (tobacco etch vírus). As quatro proteínas MASP em fusão a cauda de histidina N-terminal foram expressas na forma solúvel, enquanto que aquelas fusionadas a GST N-terminal foram expressas como corpos de inclusão insolúveis, exceto a recombinante MASP1:GST. A purificação da MASP 3 fusionada a cauda de histidina foi realizada por cromatografia de afinidade. Após a clivagem da etiqueta por TEV, a proteína foi purificada por cromatografia de troca iônica. O estudo da estrutura tridimensional de proteínas MASP permitirá uma compreensão mais detalhada destas moléculas, tal como a localização de seus epítopos e seu enovelamento, o que…

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Made available in DSpace on 2019-08-13T09:56:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_corrigida_v_nia_santos.pdf: 1194712 bytes, checksum: 39c9ce61e405c6dc865a9348f7e2514b (MD5) Previous issue date: 10

O controle do pH intestinal em Lutzomyia longipalpis é primordial para o inseto lidar com os diferentes itens de sua dieta. Os flebotomíneos necessitam mudar repentinamente de um pH 6,0, adequado a digestão de açúcares, para um pH próximo de pH 8,0, que aumenta a eficiência da digestão do repasto sanguíneo. Antes da ingestão de sangue, o pH no intestino médio de L. longipalpis é rigorosamente mantido em pH 6,0 por um eficiente mecanismo regulador. Aparentemente, a alcalinização observada seria viabilizada pela volatilização do CO2 presente no sangue ingerido, e também por outro mecanismo ainda não caracterizado até então. Assim, o presente trabalho teve como primeiro objetivo, caracterizar o estímulo inicial, presente no sangue ingerido, responsável pela desativação da manutenção do pH 6,0, e pelo disparo do mecanismo de alcalinização do pH no intestino médio abdominal. De acordo com os nossos resultados, a ingestão de diferentes proteínas (não só aquelas presentes no sangue), induziu o processo de alcalinização do pH intestinal. Aminoácidos livres, na concentração normalmente encontrada no sangue não foram capazes de promover o aumento de pH no intestino médio, mas quando ingeridos em alta concentração, dispararam o mecanismo de alcalinização do pH. Umextrato preparado com o conteúdo de células intestinais foi capaz de promover uma suave alcalinização do pH intestinal quando aplicado diretamente em intestinos dissecados, e previamente acidificados. A serotonina, um hormônio provavelmente liberado na hemolinfa logo após o início do repasto sanguíneo, também foi aplicada em tubos digestivos dissecados, mas se mostrou ineficiente em promover a alcalinização do pH intestinal. A anidrase carbônica parece estar envolvida no processo de aumento do pH intestinal, uma vez que a acetazolamida (inibidor da anidrase carbônica) diminuiu a eficiência de alcalinização do intestino médio abdominal promovida pela ingestão de proteína. Um modelo geral para explicar o mecanismo de alcalinização é sugerido no presente trabalho. Utilizando-se microeletrodos íons sensíveis, foram medidas as concentrações de sódio e potássio no conteúdo intestinal ao longo da digestão do repasto sanguíneo. Foi observado que o sódio diminui, ao passo que o potássio aumenta àmedida que o sangue é digerido. Estes resultados indicam que a manutenção do pH alcalino durante o processo digestivo pode ter relação com o transporte de sódio e potássio entre o lúmen e o citoplasma das células intestinais. Levando-se em consideração a importância do pH intestinal no desenvolvimento de Leishmania intantum em seu vetor, o pH do intestino médio de L. longipalpis infectados foi medido através de microeletrodos H+ sensíveis. Foi observado que, 30h após o repasto sanguíneo, ocorre uma acidificação precoce do pH nos insetos infectados (pH ~7,0), quando…

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Made available in DSpace on 2019-08-13T11:43:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 capa_2_corrigida.pdf: 291327 bytes, checksum: c5eca46280310c50ff5a9c9eb1efa340 (MD5) tese_c_ntia_corrigida.pdf: 4887823 bytes, checksum: 25829cfc5cfac2113cb5d9eeb02b7d9a (MD5) Previous issue date: 21

A esquistossomose permanece como um grave problema de saúde pública nos países tropicais e é considerada uma das infecções parasitárias humanas mais importantes em termos de morbidade e mortalidade. Apesar das drogas utilizadas no tratamento da esquistossomose serem altamente eficazes na eliminação dos vermes adultos, elas não impedem os quadros de reinfecção e de formação do granuloma no fígado. Portanto, o desenvolvimento de uma vacina é uma estratégia essencial para o controle da esquistossomose. Nosso grupo de pesquisas identificou as proteínas recombinantes (r) P22 e (r) P44 como componentes da fração PIII de verme adulto, conhecida por gerar proteção e imunomodulação da resposta granulomatosa na esquistossomose experimental. Clones contendo a sequência codificadora das proteínas rP22 e rP44 foram isolados da biblioteca de cDNA de verme adulto de S. mansoni utilizando soro de coelho anti-PIII. As sequências selecionadas apresentaram identidade completa com o antígeno Sm 21.7 e a proteína frutose 1,6-bifosfato aldolase de S. mansoni, respectivamente. Foram realizadas imunizações de camundongos com as proteínas recombinantes rP22 e rP44, combinadas ou individuais, para investigar a proteção gerada após a infecção desafio. Camundongos imunizados com rP22 e rP44, tanto combinadas com individuais, apresentaram uma diminuição significativa do número de vermes recuperados. Somente os camundongos imunizados com a combinação das proteínas apresentaram uma redução significativa do número de ovos retidos no tecido hepático. Análises histológicas dos cortes de fígado de camundongos revelaram que tanto a vacinação dos animais com rP22 quanto com a combinação rP22/rP44 produziram uma redução significativa do tamanho dos granulomas hepáticos e da área de fibrose, sugerindo que rP22 poderia contribuir para a regulação da hipersensibilidade granulomatosa em resposta aos ovos de S. mansoni. A imunidade protetora foi associada aos títulos elevados de anticorpos IgG específicos para rP22 e rP44; à produção aumentada de IFN-, TNF- e IL-10; e aos baixos níveis de IL-4. Dessa forma, esses resultados demonstram que a produção de uma vacina composta pela combinação das proteínas rP22 e rP44 pode ser uma ferramenta útil na geração de proteção contra a esquistossomose. Além disso, a capacidade pronunciada da proteína rP22 em reduzir a patologia hepática poderia contribuir para a produção de uma vacina anti-esquistossomótica mais eficaz. Para caracterizar os epítopos relacionados à resposta humoral produzida após a imunização de animais experimentais com rP22 ou rP44, foi feita a predição dos epítopos lineares de linfócitos B encontrados na sequência primária da rP22 e rP44 e peptídeos de 16 resíduos de aminoácidos foram sintetizados em…

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Made available in DSpace on 2019-08-10T06:04:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo_ivanildce_pdf.pdf: 48553 bytes, checksum: fb9cf844f351ffac121e5c07a6477f5b (MD5) Previous issue date: 21

O Brotheas amazonicus é um escorpião endêmico da região norte do Brasil. Por viver em região de floresta os casos de acidentes com esta espécie acontecem esporadicamente. No presente estudo, foi empregada cromatografia líquida bidimensional (2D-LC), MALDI-TOF-TOF, seqüenciamento de novo e pesquisa por similaridades em bancos de dados a fim de conhecer a diversidade peptídica do veneno de Brotheas amazonicus. Os perfis de 2D-LC e composição de massas moleculares são apresentados. Um total de 201 espécies moleculares foi identificado com massas entre 800 e 17000 Da. Oito peptídeos foram seqüenciados, sendo que nenhum deles apresentou similaridade com outras moléculas conhecidas. Dois deles apresentaram amidação C-terminal. As moléculas com massas entre 6 e 7,5 KDa equivaleram à aproximadamente 8% do total de moléculas detectadas, as moléculas com massas entre 2 e 7 KDa equivaleram à 43%. O restante das moléculas apresentaram massas variando de 0,8 KDa à 2 KDa e de 7 KDa à 17 KDa. Este trabalho demonstra que muito se tem a descobrir a respeito desses animais e a composição de suas peçonhas.

Brotheas amazonicus is an endemic scorpion from the northern Brazil. Since it dwells the Amazon forest, human accidents involving this species occur sporadically. In this study, two-dimensional liquid chromatography (2D-LC), MALDI-TOF-TOF, de novo sequencing and similarities searches were employed in assessment of the peptide diversity of the Brotheas amazonicus venom. The chromatographic profiles and the mass compositions of the venom are provided. A total of 201 molecules were detected with molecular masses between 800 and 17000 Da. Eight peptides were de novo sequenced which did not present significative similarity with other known molecules. The molecules with masses between 6 and 7.5 KDa corresponded to approximately 8% of all detected molecules and molecules with masses between 2 and 7 KDa corresponded to 43%. Other molecules have masses ranging from 0.8 KDa to 2 KDa and 7 KDa to 17 KDa. This work shows that much has yet to be discovered regarding these animals and the composition of their venoms.

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Made available in DSpace on 2019-08-09T19:05:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_cmb.pdf: 4575059 bytes, checksum: 880d7e9f7383dccee05cab5b4b8d4b76 (MD5) Previous issue date: 6

O câncer representa uma das principais causas de morte em todo o mundo. Estima-se que em 2008 7,6 milhões de pessoas morreram em conseqüência dessa condição patológica. No Brasil, o câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais comum e são esperados 49 mil novos casos em 2010. O diagnóstico e o tratamento desse tipo de câncer permanecem como desafios. A caracterização de novas linhagens celulares é uma ferramenta importante para a compreensão dos processos biológicos envolvidos no câncer e as respostas induzidas pelos tratamentos disponíveis. No presente estudo foram usadas duas novas linhagens de células de câncer de mama humano estabelecidas a partir de fragmentos de tumor primário: MACL-1 e MGSO-3. A susceptibilidade dessas linhagens ao tratamento com radiação ionizante (RI) foi comparada com aquela da linhagem comercial MDA-MB-231, derivada de sítio de metástase. A RI (10 ou 20 Gy) induziu redução da viabilidade celular e morte, mensurada por meio do ensaio de fragmentação do DNA, 48 e 72 h após o tratamento. Além disso, após 48 h, foi observado aumento da porcentagem de células apoptóticas. O tratamento com 20 Gy reduziu, também, a sobrevivência clonogênica. Porém, quando mantidas em cultura após o tratamento com RI (20 Gy), as células das três linhagens recuperaram-se em 21 dias e a viabilidade celular dessas culturas foi semelhante àquela das culturas que não foram previamente expostas à radiação, sugerindo que apresentam fenótipo radiorresistente. O inibidor de caspases zVAD-FMK inibiu a fragmentação do DNA e a redução de viabilidade celular induzidas pela RI, sugerindo o envolvimento de caspases na morte celular induzida pela RI. De fato, o tratamento com RI (20 Gy, 24 h) ativou caspase-9 nas linhagens MACL-1 e MDA-MB-231, mas não em MGSO-3. Além disso a RI (20 Gy, 30 h) induziu ativação das caspases 8 e 3 nas três linhagens usadas. Apesar de ter sido demonstrado que a RI induz citotoxicidade, não foi detectada alteração na expressão protéica, avaliada por eletroforese bidimensional, 24 ou 30 h após o tratamento de células da linhagem MDA-MB-231 com 20 Gy. Por meio de eletroforese bidimensional e espectrometria de massas foi demonstrado que existem diferenças no perfil de expressão protéica das linhagens MACL-1 e MGSO-3 em relação a células obtidas a partir de tecido de mama saudável. Em conjunto, esses resultados sugerem que as novas linhagens de câncer de mama humano MACL-1 e MGSO-3 podem ser úteis em estudos para compreender a radiobiologia do câncer de mama e contribuir para o desenvolvimento racional de modelos para o estudo do tratamento do câncer bem como para a identificação de marcadores para esse tipo de câncer.

Cancer represents a major cause of death worldwide. It is estimated that in 2008 7.6 million people died as a consequence of this disease. In Brazil, breast cancer is the second most…

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Made available in DSpace on 2019-08-14T15:21:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo_dmresende.pdf: 19724 bytes, checksum: 8e88ca6affb32970979f71e2a8cf008e (MD5) Previous issue date: 9

A leishmaniose é endêmica em muitos países do Velho e do Novo Mundo. O antígeno amastigota específico A2 é um fator de virulência que já foi descrito em várias espécies de Leishmania, entre elas L. donovani, L. chagasi e L. amazonensis. Também já foi mostrado que a A2 é capaz de induzir proteção contra L. amazonensis em camundongos. Neste trabalho, foram definidos os epítopos reconhecidos por anticorpos, assim como os epítopos para células T CD4+ e T CD8+ reconhecidos após a imunização com o antígeno A2. A imunização de camundongos BALB/c, altamente susceptíveis à infecção com Leishmania, com adenovírus expressando a A2 (AdA2), resultou em baixos níveis de anticorpos anti-A2, contrastando com altos níveis de células T CD4+ e T CD8+ produtoras de IFN-. Além disso, células T CD8+ específicas de camundongos imunizados foram capazes de lisar células alvo sensibilizadas com peptídeo em ensaios de citotoxicidade in vivo. Finalmente, foi demonstrado que camundongos imunizados com duas doses de AdA2, em um protocolo prime/boost homólogo, e desafiados com 107 promastigotas de L. chagasi, apresentaram número reduzido de parasitas no baço e no fígado. Assim, a vacinação com AdA2 induziu altos níveis de células T CD4+ e T CD8+ produtoras de IFN- e atividade citotóxica in vivo, sendo associada com imunidade protetora contra a leishmaniose visceral murina

Leishmaniasis is endemic in many countries in Old an New World. The amastigote specific antigen A2 of Leishmania is a virulence factor shared by L donovani, L. chagasi and L. amazonensis, which are main etiologic agents of visceral and other forms of leishmaniaisis. A2 was also shown to induce protection against experimental Leishmania amazonensis infection in mice. Using predicted hydrophilic as well as class I and II MHC-binding synthetic peptides, we defined the A2 epitopes recognized by antibodies, CD4+ T as well as CD8+ T cells elicited during immunization protocols. Immunization of highly susceptible BALB/c mice with the adenovirus vector expressing A2 (AdA2) resulted in low levels of anti-A2 antibody response, contrasting with high levels of IFN- producing CD4+ T, as well as CD8+ T cells. Further, A2-specific CD8+ T cells from immunized mice were also capable of lysing peptide-sensitized target cells in in vivo cytotoxic assays. Finally, we demonstrated that mice immunized with AdA2 and challenged with 107 live L. chagasi parasites, presented reduced parasite loads at both liver and spleen. Thus, vaccination with AdA2 induces high levels of A2-specific CD4+ T cell as well as CD8+ T lymphocytes that produce high levels of IFN-, display in vivo cytolytic activity, and are associated with protective immunity against murine visceral leishmaniasis.

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Made available in DSpace on 2019-08-11T12:39:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 resumo_thiago_verano_braga_doutorado.pdf: 7347 bytes, checksum: fb70d8221b1fb485aa55404e29a5a588 (MD5) resumo_thiago_verano_braga_doutorado.pdf: 7347 bytes, checksum: fb70d8221b1fb485aa55404e29a5a588 (MD5) Previous issue date: 17

Após a descoberta dos primeiros peptídeos potenciadores de bradicinina (PPBs) no início dos anos 70, por Sérgio Ferreira e colaboradores, várias moléculas similares foram identificadas na peçonha de artrópodes e vertebrados. Utilizando ferramentas proteômicas, uma nova família de peptídeos foi isolada da peçonha do escorpião Tityus serrulatus e denominada T. serrulatus Hipotensinas (TsHpts). Estes peptídeos são lineares e capazes de potenciar os efeitos hipotensivos da bradicinina (BK). Foi realizado um estudo de minimização da estrutura primária de TsHpt-I (AEIDFSGIPEDIIKQIKETNAKPPA), um membro desta família, para inferir os resíduos de aminoácidos cruciais para a atividade biológica das Hipotensinas, além de avaliar a estrutura primária mínima capaz de manter esta atividade. Utilizando a extremidade C-terminal de TsHpt-I como molde, foram sintetizados os peptídeos TsHpt-I[17-25] (KETNAKPPA); TsHpt-I[21-25] (AKPPA); TsHpt-I[22-25] (KPPA); TsHpt-I[23-25] (PPA); TsHpt-I[22-24] (KPP); TsHpt-I[22-23] (KP); TsHpt-I[23-24] (PP); TsHpt-I[24-25] (PA) e TsHpt-I[ac22-24] (acKPP), que não contém uma carga positiva na sua cadeia lateral. Todos os peptídeos que apresentam as duas prolinas C-terminais foram capazes de potenciar a BK, sendo que a carga positiva do radical da lisina se mostrou crucial para que estes peptídeos induzam uma hipotensão imediata e transiente, quando administrados intravenosamente. O efeito vasodilatador, dependente de endotélio e da síntese de NO, também foi afetado pela ausência da carga positiva deste resíduo de aminoácido. Diferentemente da grande maioria dos PPBs descritos, TsHpt-I e seus análogos sintéticos não foram capazes de inibir a ECA. Este estudo também revelou que a minimização estrutural de TsHpt-I não alterou significativamente os seus efeitos cardiovasculares, muito importante do ponto de vista biotecnológico, pois peptídeos de baixa massa molecular apresentam poucos, ou nenhum ponto de clivagem proteolítica, além de terem baixo custo de síntese.

Using a proteomic approach, a new structural family of peptides was put in evidence in the venom of the yellow scorpion Tityus serrulatus. T. serrulatus Hypotensins (TsHpt) are random-coiled linear peptides that act as bradykinin potentiating peptides (PPBs). Aiming to better understand the relationship between the primary structure of TsHpt-I (AEIDFSGIPEDIIKQIKETNAKPPA) and its capacity to potentiate the hypotensive effect of BK, some synthetic peptides were constructed using the C-terminal portion of TsHpt-I as model; TsHpt-I[17-25] (KETNAKPPA); TsHpt-I[21-25] (AKPPA); TsHpt-I[22-25] (KPPA); TsHpt-I[23-25] (PPA); TsHpt-I[22-24] (KPP); TsHpt-I[22-23] (KP); TsHpt-I[23-24] (PP); TsHpt-I[24-25] (PA) and…