Lead optimization process obtained from a phenotypic strategy, requires the characterization of the molecular mechanism of action involved. From a phenotypic screening previously performed on a group of compounds belonging to the family of thiosemicarbazones (TSCs), we have previously identified 4,4'-dimethoxybenzophenone thiosemicarbazone (T44Bf) as a lead compound in the U937 cell line. The characterization of the mechanism of action of T44Bf conducted on a panel of human leukemia cell lines (U937, HL60, Jurkat and KG1a) showed that T44Bf-mediated antiproliferative effects are associated with a reversible chronic mitotic arrest caused by inhibition of microtubules polymerization, followed by induced programmed cell death. Furthermore, T44Bf selectively induces apoptosis in leukemia cell lines when compared to differentiated hematopoietic cells. Also, apoptotic activity was associated with loss of mitochondrial membrane potential, and sustained phosphorylation of anti-apoptotic protein Bcl-2 and Bcl-xL as well as increased pro-apoptotic protein Bad levels. In addition, ERK signaling pathway activation was found to be a requisite for T44Bf apoptotic activity. Our findings further describe a novel activity for a benzophenone thiosemicarbazone and allow a rational establishment of a method for the development of this lead compound optimization.

Fil: Cabrera, Maia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina

El proceso de optimización de un compuesto líder obtenido a partir de una estrategia fenotípica, requiere de la caracterización del mecanismo molecular de acción involucrado. A partir de un cribado fenotípico realizado previamente sobre un grupo de compuestos pertenecientes a la familia de las tiosemicarbazonas (TSCs), se identificó el compuesto tiosemicarbazona 4,4?-dimetoxibenzofenona como un compuesto líder en la línea celular U937. La caracterización del mecanismo de acción de T44Bf, realizado sobre un panel de líneas celulares de leucemia aguda humana (U937, HL60, KG1a y Jurkat) mostró que su efecto antiproliferativo está asociado a un arresto mitótico reversible inducido por la inhibición de la polimerización de los microtúbulos, lo que eventualmente conduce a la muerte por apoptosis. Esta última resultó ser selectiva por células leucémicas en contraposición a células hematopoyéticas diferenciadas. Asimismo, la actividad apoptótica estuvo asociada a la pérdida de potencial de membrana mitocondrial, fosforilación sostenida de las proteínas anti-apoptóticas Bcl-2 y Bcl-xL y un incremento de la proteína pro-apoptótica Bad. Por último, la fosforilación de la MAPK ERK 1/2 demostró ser un requisito para la inducción de apoptosis. Los resultados describen un mecanismo novedoso para una TSC, y permiten establecer las bases racionales para la utilización de un biométodo para el desarrollo a fututo de los ensayos de optimización de este compuesto líder.

Fil: Alvarado, Cecilia Viviana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina

RAC3 es un coactivador de la transcripción de ciertos factores y receptores nucleares que colabora en la actividad biológica de estas moléculas facilitando la expresión génica. Originalmente fue descripto como específico de receptores de hormonas esteroideas, con actividad acetilasa de histonas y la capacidad de remodelar la cromatina facilitando la expresión de genes blanco de estas hormonas. Se lo encontró sobre-expresado en tumores dependientes de las mismas y por esta razón se lo asoció a tumorigénesis hormono-dependiente. Sin embargo, años más tarde, nuestro grupo y otros investigadores hemos demostrado que RAC3 es un coactivador para otros factores de transcripción y tiene además otras funciones a nivel citoplasmático por las cuales contribuye al desarrollo tumoral de una gran variedad de tumores dependientes o no de hormonas, por lo cual hoy día se define como un oncogén. Hemos demostrado previamente que RAC3 es un coactivador de NF-?B, aumentando su actividad transcripcional, así como la expresión de algunos de sus genes blanco. Muchos de estos genes están vinculados a la respuesta inflamatoria, así como al control de ciclo celular, proliferación, expresión de moléculas de adhesión y otros responsables de la supervivencia celular, todos ellos a su vez relacionados con el proceso de tumorigénesis. Estos hallazgos motivaron la búsqueda de niveles elevados de RAC3 en otros tumores no específicamente respondedores a hormonas esteroideas y hoy día se sabe de su alto título en una gran variedad de tumores como el de hígado, páncreas, estómago y la lista crece. También demostramos que su sobre-expresión contribuye al desarrollo tumoral inhibiendo la apoptosis inducida por vía de membrana y mitocondrial, en células tumorales y no tumorales. Su acción protectora de la supervivencia se debía no solo a su actividad remodeladora de la cromatina aumentando la expresión de genes anti-apoptóticos, sino también a acciones citoplasmáticas como la regulación de actividad de kinasas y el transporte de moléculas como AIF desde la mitocondria hasta el núcleo celular, demorando su ingreso a núcleo por asociación con la maquinaria motora de citoesqueleto. A diferencia de otros oncogenes conocidos, en el caso de RAC3, su rol oncogénico no depende de la expresión de variantes por mutación, sino que, la sola sobre-expresión es suficiente. Consecuentemente, su expresión en células normales, no tumorales, es limitante y en ocasiones indetectable por técnicas habituales de determinación de proteínas. Sin embargo, sus altos niveles de expresión en tumores, en la mayoría de los casos no se debe a amplificación génica y los mecanismos que controlan su expresión aún no han sido esclarecidos. En este trabajo de tesis, se investigaron los posibles mecanismos responsables del aumento en los niveles de expresión de RAC3. Demostramos que la respuesta inflamatoria inducida por administración de LPS in vivo en ratones produce el aumento en…

The interaction of lymphoid tumor cells with components of the extracellular matrix via the integrin ?v?3 allows tumor survival and growth. This integrin was demonstrated to be the membrane receptor for thyroid hormones in several tissues. We found that thyroid hormones (THs), acting as soluble integrin ?v?3 ligands, activated growth-related signaling pathways in T-cell lymphomas (TCL). In this work we show that physiological concentrations of THs acting through the integrin ?V?3 induced angiogenesis and proliferation of immature and mature TLC cells. We characterized the transcriptional program triggered upon the activation of the integrin ?V?3 by TH, that is ultimately linked to a NF-?B dependent mechanism that lead to the induction of angiogenic and cell proliferation genes such as VEGF. Moreover, we found that pharmacological inhibition of integrin ?V?3 reduces the proliferation of T-cell lymphomas in pre-clinical models, including patient-derived xenografts of ALCL tumors. In sum, we here show that integrin ?V?3 transduces pro-survival signals into TCL nuclei, suggesting a novel mechanism for the endocrine modulation of TCL pathophysiology. Targeting this mechanism could constitute an effective and potentially low-toxicity chemotherapy-free treatment for TCL patients.

Fil.: Cayrol, María Florencia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquìmica; Argentina

En este trabajo evaluamos el rol que ejercen las hormonas tiroideas (HTs) a través de su receptor nuclear y de membrana (TR y mTR), sobre líneas de distintos subtipos de linfomas de células T humanos (LCT). Particularmente, se evaluó la acción del mTR utilizando HTs unidas a agarosa (HT-AG, impermeables a la célula) y demostramos que en células T malignas este receptor de membrana es la integrina ?V?3. Se determinaron los programas transcripcionales activados por HTs a través del mTR, y se observó que esta acción induce la expresión de genes involucrados en proliferación celular y angiogénesis. Se desarrollaron modelos in vivo donde se evaluó el crecimiento tumoral de distintas líneas humanas de LCT en ratones inmunodeficientes NOD-SCID y se encontró que la inhibición de la integrina ?V?3 disminuye el crecimiento de los mismos. Más aún, se evaluó el efecto de un inhibidor del mTR en un modelo pre-clínico de linfoma sonde se transplantaron tumores derivados pacientes ALCL, y se observó una disminución significativa de los tumores tratados con el inhibidor. Estos resultados nos proporcionan un marco de conocimiento, para la inhibición selectiva de la integrina ?V?3 como posible estrategia terapéutica para los pacientes con linfomas de células T.

In the central nervous system (CNS), Transferrin (Tf) and Thyroid Hormones (THs) promoted oligodendrocyte (OLG) maturation and myelination. Results from our laboratory suggested that Tf and THs could act together in the regulation of the above mentioned processes, given that THs modulated Tf expression and Tf might have effects on THs receptor alpha (TR?). In order to elucidate this potential interaction mechanism, we performed some in vivo experiments to test the combined effects of Tf and THs on myelination and on THs receptors (TRs) expression as well. Additionally, we used neural progenitor cells (NPCs) and analyzed the action of both factors acting together or individually on OLG maturation.\nOur in vivo results showed that apoTransferrin (aTf) and THs exerted individual positive effects on myelination. Furthermore, THs regulated Tf expression during the first two weeks of life and there was an interaction between both factors involving TRs since THs regulated TR? expression and Tf modulated TR? expression.\nThe in vitro experiments revealed that when Tf expression is knocked down OLG maturation was limited. Under these circumstances, THs partially promoted OLG maturation and when TR? was blocked, aTf was able to partially support OLG maturation. Tf knock down decreased TR? expression while aTf administration induced the contrary. At the same time, the treatment of CPNs with THs induced the increase of TR? expression and a premature increase of Tf expression which was abolished by blocking TR?.\nThese findings indicated that the combined actions of Tf and THs are required in order to achieve a proper OLG maturation and myelination; in addition the effects observed are the consequence of the crosstalk between the actions of both factors on OLG maturation. In agreement with this hypothesis, our results demonstrated that THs were capable of regulating Tf expression, which in turns exerted positive effects on OLG maturation and increased TR? expression as part of a feedback circuit, which together with THs effects mediated by TR? ensured the accomplishment of an adequate OLG maturation and myelination.

Fil: Marziali, Leandro Nazareno. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina

En el sistema nervioso central (SNC) la Transferrina (Tf) y las Hormonas Tiroideas (HTs) favorecen la maduración de los oligodendrocitos (OLGs) y la mielinización. Resultados de nuestro laboratorio sugirieron que la Tf y las HTs, regularían en forma conjunta dichos procesos debido a que las HTs modulan la expresión de la Tf mientras que esta última tendría efecto sobre la expresión del receptor ? de las HTs (TR?). Para dilucidar este potencial mecanismo de interacción realizamos experimentos in vivo en los que evaluamos la influencia combinada de la Tf y las HTs sobre la mielinización así como sobre los receptores de las HTs (TRs). Posteriormente utilizamos células progenitoras neurales (CPNs) y analizamos la acción de ambos factores en forma conjunta o individualmente sobre la maduración…