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A manipulação genética de micro-organismos permite a produção de enzimas com alto valor biotecnológico com aplicação em vários processos industriais. A enzima α-amilase de Bacillus licheniformis é amplamente utilizada nas indústrias de álcool, açúcar, cerveja e panificação para a hidrólise do amido inicial, clivando as ligações glicosídicas α-(1,4). Um sistema de expressão de proteínas heterólogas que tem sido utilizado com sucesso é o sistema da levedura metilotrófica Pichia pastoris. O objetivo deste trabalho foi clonar e expressar o gene que codifica a α-amilase de B. licheniformis DSM13 na levedura metilotrófica Pichia pastoris e após analisar a proteína recombinante secretada. O gene foi inserido no genoma de P. pastoris utilizando o vetor pPIC9 sendo então produzida e secretada pela levedura. A atividade enzimática máxima foi observada no sobrenadante do clone B8 (345,4 U/mL). Houve variação quanto ao peso molecular da enzima entre os clones analisados por gel SDS-PAGE. A enzima apresentou temperatura ótima de atividade de 70ºC, considerável estabilidade na presença de cálcio, pH ótimo de 7,0 e também manteve-se estável por um período de dois meses quando incubada a 4 ºC. Os valores de Km e Vmáx aparentes calculado para o extrato bruto do clone A7 foram de 10,74 mg/mL e 416,66 U/mL respectivamente.

Genetic manipulation of microorganisms allows the production of enzymes with high biotechnological value with application in various industrial processes. The enzyme α-amylase from Bacillus licheniformis is widely used in industries to produce alcohol, sugar and beer, and its activity involves hydrolysis of starch cleaving the glycosidic bonds α-(1,4). The methylotrophic yeast Pichia pastoris has been used successfully for heterologous protein expression, becoming an efficient expression system. The objective of this study was to clone and to express the gene encoding α-amylase from Bacillus licheniformis DSM13 in the methylotrophic yeast Pichia pastoris and also to analyze the recombinant protein secreted. The gene was inserted into the genome of P. Pastoris using the pPIC9 vector and after the induction process the protein was produced and secreted by the yeast. The maximum enzyme activity was observed in the supernatant of the clone B8 (345,4 U/mL). Variations in molecular weight of the enzymes among the clones were detected by SDS-PAGE gel analysis. The enzyme showed optimum activity at 70 ºC, pH optimum of 7.0 and its activity remained stable for a period of two months when maintained at 4 °C. The Km and Vmáx apparent values calculated for the crude extract clone A7 were 10.74 mg/mL and 416.66 U/mL, respectively.

Advisors/Committee Members: Astolfi Filho, Spartaco.

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O hormônio do crescimento é um polipeptídio essencial para o crescimento e desenvolvimento dos vertebrados. O tambaqui (Colossoma macropomum) é uma espécie de peixe amplamente distribuída na bacia amazônica, considerada como promissora para a piscicultura. Visando aplicações futuras na suplementação alimentar de peixes, este trabalho clonou e expressou o hormônio de crescimento de tambaqui (tGH), utilizando a bactéria Escherichia coli linhagem BL21 DE3 como hospedeira. Para expressão da proteína heteróloga, o gene tgh sintético (611pb) foi inicialmente clonado no vetor pUC19 e posteriormente inserido no vetor pGSM-1, construído especificamente para este trabalho, dando origem ao plasmídeo pGSM-tGH. A indução do tGH foi obtida cultivando-se células de E. coli/pGSM-tGH na presença do indutor IPTG (1 mM), sendo que o pico de expressão foi observado após 4h de indução. Os clones recombinantes expressaram uma proteína de aproximadamente 24 kDa, tamanho similar ao de outros trabalhos com GH de peixes. A obtenção do tGH recombinante foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 15%. O tGH recombinante expresso em E. coli descrito nesse trabalho será utilizado para estudos posteriores, possibilitando a sua melhor caracterização. Por fim, o tGH recombinante deverá ser posteriormente avaliado como suplemento alimentar em ração de peixes, com intuito de proporcionar maior valor econômico à piscicultura do tambaqui.

Growth hormone is a polypeptide essential for growth and development of vertebrates. The tambaqui (Colossoma macropomum) is a widely distributed fish species in the Amazon basin, considered as promising for farming. Aiming future applications in dietary supplementation of fish, this work has cloned and expressed the growth hormone from tambaqui (tGH), using the bacterium Escherichia coli strain BL21 DE3 as a host. For expression of heterologous protein, the synthetic gene tGH (611pb) was initially cloned into pUC19 vector and subsequently inserted into the vector PGSM-1, constructed specifically for this work, giving rise to plasmid PGSM-TGH. Induction of HGT was obtained by cultivating cells of E. coli / PGSM-GHT in the presence of the inducer IPTG (1 mM), where the peak of expression was observed after 4h of induction. Recombinant clones expressed a protein of approximately 24 kDa, similar in size to other works with fish GH. The recombinant tGH was confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE 15%. The recombinant tGH coli described in this work will be used in ongoing studies, allowing additional characterization. Finally, the recombinant TGH should be further evaluated as a food supplement in the diet of fish, in order to provide greater economic value to the fish farming of tambaqui.

Advisors/Committee Members: Porto, Jorge Ivan Rebelo, Astolfi Filho, Spartaco, Nozawa, Monica Stropa Ferreira, Silva, Carlos Gustavo Nunes da, Marshall, Nislanha Ana dos Anjos.

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O hormônio do crescimento é um polipeptídio essencial para o crescimento e desenvolvimento dos vertebrados. O tambaqui (Colossoma macropomum) é uma espécie de peixe amplamente distribuída na bacia amazônica, considerada como promissora para a piscicultura. Visando aplicações futuras na suplementação alimentar de peixes, este trabalho clonou e expressou o hormônio de crescimento de tambaqui (tGH), utilizando a bactéria Escherichia coli linhagem BL21 DE3 como hospedeira. Para expressão da proteína heteróloga, o gene tgh sintético (611pb) foi inicialmente clonado no vetor pUC19 e posteriormente inserido no vetor pGSM-1, construído especificamente para este trabalho, dando origem ao plasmídeo pGSM-tGH. A indução do tGH foi obtida cultivando-se células de E. coli/pGSM-tGH na presença do indutor IPTG (1 mM), sendo que o pico de expressão foi observado após 4h de indução. Os clones recombinantes expressaram uma proteína de aproximadamente 24 kDa, tamanho similar ao de outros trabalhos com GH de peixes. A obtenção do tGH recombinante foi confirmada por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 15%. O tGH recombinante expresso em E. coli descrito nesse trabalho será utilizado para estudos posteriores, possibilitando a sua melhor caracterização. Por fim, o tGH recombinante deverá ser posteriormente avaliado como suplemento alimentar em ração de peixes, com intuito de proporcionar maior valor econômico à piscicultura do tambaqui.

Growth hormone is a polypeptide essential for growth and development of vertebrates. The tambaqui (Colossoma macropomum) is a widely distributed fish species in the Amazon basin, considered as promising for farming. Aiming future applications in dietary supplementation of fish, this work has cloned and expressed the growth hormone from tambaqui (tGH), using the bacterium Escherichia coli strain BL21 DE3 as a host. For expression of heterologous protein, the synthetic gene tGH (611pb) was initially cloned into pUC19 vector and subsequently inserted into the vector PGSM-1, constructed specifically for this work, giving rise to plasmid PGSM-TGH. Induction of HGT was obtained by cultivating cells of E. coli / PGSM-GHT in the presence of the inducer IPTG (1 mM), where the peak of expression was observed after 4h of induction. Recombinant clones expressed a protein of approximately 24 kDa, similar in size to other works with fish GH. The recombinant tGH was confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE 15%. The recombinant tGH coli described in this work will be used in ongoing studies, allowing additional characterization. Finally, the recombinant TGH should be further evaluated as a food supplement in the diet of fish, in order to provide greater economic value to the fish farming of tambaqui.

Advisors/Committee Members: Porto, Jorge Ivan Rebelo, Astolfi Filho, Spartaco, Nozawa, Monica Stropa Ferreira, Silva, Carlos Gustavo Nunes da, Marshall, Nislanha Ana dos Anjos.

▼ Na região Amazônica brasileira ocorrem cerca de 99,7% dos casos de malária do Brasil, onde o principal vetor é o Anopheles darlingi. Em 2007, na região da Amazônia Legal, foram relatados aproximadamente 185 mil casos da doença. Há a necessidade de estudos para o entendimento do genoma funcional do A. darlingi, considerando a pouca quantidade de sequências de genes expressos disponíveis em bancos genômicos públicos na Internet. As Etiquetas de Sequências Expressas (Expressed Sequence Tags-EST) de A. darlingi, obtidas por meio de construções de bibliotecas de cDNA foram mapeadas por hibridização in silico em cromossomos de Anopheles gambiae, a fim de comparar virtualmente suas localizações cromossômicas. A hibridização in silico foi realizada a partir do downloading de clusters e singlets de bibliotecas de cDNA de A. darlingi, depositadas no banco de dados do Laboratório Nacional de Computação Científica (LNCC), para um ambiente virtual com parâmetros pré definidos. As sequências gênicas de A. darlingi e A. gambiae foram submetidas ao programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) a fim de reconhecer regiões com similaridade entre essas espécies. Os dados foram submetidos ao programa ARTEMIS , para visualização das regiões hibridizadas. Os clusters e singlets foram hibridizados nos 3 cromossomos de A. gambiae. No cromossomo X, foram hibridizados 13 clusters. No cromossomo 2, braço 2R, 64 clusters; no braço 2L, foram hibridizados 40 clusters. No cromossomo 3, no braço 3R, foram hibridizados 45 clusters, e no braço 3L, 34 clusters. As sequências homólogas encontradas foram agrupadas por categoria geral de função do COG, dentre as quais, a categoria geral Armazenagem e Processamento de Informações foi a mais frequente, com maior número de sequências (36%). Entre os contigs e singlets hibridizados, detectou-se reads tais como genes de Actina, genes ribossomais e sequências gênicas desconhecidas e/ou hipotéticas. Além destes genes expressos, detectou-se similaridade das ESTs de A. darlingi com sequências de outros organismos: Aedes aegypti, Drosophila melanogaster e Culex spp. Tais resultados auxiliarão estudos futuros no conhecimento da sintenia dos genes em termos evolutivos além de poder auxiliar no controle da malária de forma a localizar genes de resistência a inseticidas nos vetores. Foi aplicada também, a metodologia de hibridização in situ nos cromossomos politênicos de A. darlingi, cuja marcação dos cDNAs foram feitas por Nick translation (Invitrogen®). Os cromossomos, contendo os sinais das sondas foram corados com DAB (diaminobenzidine tetrahydrochloride - Sigma, Cat. No. D-5637). As microfotografias foram obtidas em microscópio de luz Axioplan Zeizz epifluorescente, com campo claro e contraste de fase. As sondas que demonstraram sinais de hibridização foram as seguintes: Lisozima, cuja hibridização ocorreu no braço cromossômico 2R, seções 8C e 8D; Troponina, cuja marcação localizou-se no braço 2R, seção 14B; Actina, cuja hibridização localizou-se no braço 2L, seção 23 e a Glutationa Transferase que… Advisors/Committee Members: Rafael, Míriam Silva, Astolfi Filho, Spartaco, Gaiesky, Vera Lúcia da Silva Valente, Rohde, Cláudia, Loreto, Elgion Lucio da Silva, Loreto, Elgion Lucio da Silva.

▼ Na região Amazônica brasileira ocorrem cerca de 99,7% dos casos de malária do Brasil, onde o principal vetor é o Anopheles darlingi. Em 2007, na região da Amazônia Legal, foram relatados aproximadamente 185 mil casos da doença. Há a necessidade de estudos para o entendimento do genoma funcional do A. darlingi, considerando a pouca quantidade de sequências de genes expressos disponíveis em bancos genômicos públicos na Internet. As Etiquetas de Sequências Expressas (Expressed Sequence Tags-EST) de A. darlingi, obtidas por meio de construções de bibliotecas de cDNA foram mapeadas por hibridização in silico em cromossomos de Anopheles gambiae, a fim de comparar virtualmente suas localizações cromossômicas. A hibridização in silico foi realizada a partir do downloading de clusters e singlets de bibliotecas de cDNA de A. darlingi, depositadas no banco de dados do Laboratório Nacional de Computação Científica (LNCC), para um ambiente virtual com parâmetros pré definidos. As sequências gênicas de A. darlingi e A. gambiae foram submetidas ao programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) a fim de reconhecer regiões com similaridade entre essas espécies. Os dados foram submetidos ao programa ARTEMIS , para visualização das regiões hibridizadas. Os clusters e singlets foram hibridizados nos 3 cromossomos de A. gambiae. No cromossomo X, foram hibridizados 13 clusters. No cromossomo 2, braço 2R, 64 clusters; no braço 2L, foram hibridizados 40 clusters. No cromossomo 3, no braço 3R, foram hibridizados 45 clusters, e no braço 3L, 34 clusters. As sequências homólogas encontradas foram agrupadas por categoria geral de função do COG, dentre as quais, a categoria geral Armazenagem e Processamento de Informações foi a mais frequente, com maior número de sequências (36%). Entre os contigs e singlets hibridizados, detectou-se reads tais como genes de Actina, genes ribossomais e sequências gênicas desconhecidas e/ou hipotéticas. Além destes genes expressos, detectou-se similaridade das ESTs de A. darlingi com sequências de outros organismos: Aedes aegypti, Drosophila melanogaster e Culex spp. Tais resultados auxiliarão estudos futuros no conhecimento da sintenia dos genes em termos evolutivos além de poder auxiliar no controle da malária de forma a localizar genes de resistência a inseticidas nos vetores. Foi aplicada também, a metodologia de hibridização in situ nos cromossomos politênicos de A. darlingi, cuja marcação dos cDNAs foram feitas por Nick translation (Invitrogen®). Os cromossomos, contendo os sinais das sondas foram corados com DAB (diaminobenzidine tetrahydrochloride - Sigma, Cat. No. D-5637). As microfotografias foram obtidas em microscópio de luz Axioplan Zeizz epifluorescente, com campo claro e contraste de fase. As sondas que demonstraram sinais de hibridização foram as seguintes: Lisozima, cuja hibridização ocorreu no braço cromossômico 2R, seções 8C e 8D; Troponina, cuja marcação localizou-se no braço 2R, seção 14B; Actina, cuja hibridização localizou-se no braço 2L, seção 23 e a Glutationa Transferase que… Advisors/Committee Members: Rafael, Míriam Silva, Astolfi Filho, Spartaco, Gaiesky, Vera Lúcia da Silva Valente, Rohde, Cláudia, Loreto, Elgion Lucio da Silva, Loreto, Elgion Lucio da Silva.

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A utilização de produtos biotecnológicos, especialmente proteínas e enzimas no setor industrial, tem aumentando significativamente em nível mundial. A glicoamilase é uma das principais enzimas responsáveis pela hidrólise do amido para a formação de xarope de glicose, matéria-prima utilizada pela indústria de alimentos e como fonte de carbono em processos fermentativos diversos. A levedura metilotrófica Pichia pastoris tem sido utilizada com sucesso para expressão de várias proteínas de interesse biotecnológico. O objetivo deste trabalho foi avaliar o sistema de expressão heteróloga utilizando a levedura P. pastoris para a produção da enzima. O cDNA da glicoamilase isolado do fungo Aspergillus awamori 2B 361 U2/1 foi inserido no genoma de P. pastoris utilizando o vetor de expressão pPIC9, baseado no promotor AOX, gerando clones recombinantes de fenótipos Mut+ e MutS cultivados sob agitação constante para a produção e secreção da proteína. As atividades das enzimas foram avaliadas utilizando o método DNS que quantifica açúcares redutores resultantes da clivagem das moléculas de amido. A máxima atividade enzimática observada no sobrenadante bruto do clone com fenótipo Mut+ foi 7.7 U/mL e do clone transformante MutS foi 6.9 U/mL. Os dois clones secretaram glicoamilases com 116 kDa que apresentaram diferentes poder catalítico, mas foram bioquimicamente semelhantes, com mesma temperatura de atividade ótima a 60ºC, elevada ação catalítica em pH ácido que varia de 4.5 a 2.5 com atividade máxima em pH 3.5 e suas estabilidades frente ao pH do meio de reacional, possuindo portanto, características desejáveis para uso em alguns processos bioindustrias. Ambos os produtos se mantiveram estáveis quando os extratos brutos foram incubados a temperatura de 4Cº por 60 dias, mantendo perto de 100% da atividade máxima. No entanto, a enzima produzida por P. pastoris Mut+ apresenta maior estabilidade térmica, retendo cerca de 70% de atividade residual quando incubada por 60 minutos a 60Cº, contra menos de 10% de atividade residual observada para a enzima expressa pelo clone MutS, avaliada nas mesmas condições. Diferentes modificações pós-traducionais poderiam estar envolvidos na pronunciada diferença de estabilidade térmica das proteínas produzidas por P. pastoris que tem se mostrado um excelente sistema de expressão de proteínas.

The utilization of biotechnological products, mainly proteins and enzymes in the industrial sector, has been increased considerably worldwide. Glucoamylase is of main enzyme responsible for the hydrolysis of starch for the formation of glucose syrup, raw material used by the food industry and carbon source in diverse fermentative process. The methylotrophic yeast Pichia pastoris has been successfully used for the expression of some heterologous proteins of biotechnological interests. The aim of this work was to evaluate the system of proteins heterologous expression using the yeast P. pastoris for enzyme production. The glucoamylase cDNA isolated from Aspergillus awamori 2B 361 U2/1 was inserted into P.…

Advisors/Committee Members: Astolfi Filho, Spartaco, Lozano, Jorge Luis López, Schenberg, Ana Clara Guerrini, Willerding, André Luis, Silva, Leonor Alves de Oliveira da, Silva, Leonor Alves de Oliveira da.

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A utilização de produtos biotecnológicos, especialmente proteínas e enzimas no setor industrial, tem aumentando significativamente em nível mundial. A glicoamilase é uma das principais enzimas responsáveis pela hidrólise do amido para a formação de xarope de glicose, matéria-prima utilizada pela indústria de alimentos e como fonte de carbono em processos fermentativos diversos. A levedura metilotrófica Pichia pastoris tem sido utilizada com sucesso para expressão de várias proteínas de interesse biotecnológico. O objetivo deste trabalho foi avaliar o sistema de expressão heteróloga utilizando a levedura P. pastoris para a produção da enzima. O cDNA da glicoamilase isolado do fungo Aspergillus awamori 2B 361 U2/1 foi inserido no genoma de P. pastoris utilizando o vetor de expressão pPIC9, baseado no promotor AOX, gerando clones recombinantes de fenótipos Mut+ e MutS cultivados sob agitação constante para a produção e secreção da proteína. As atividades das enzimas foram avaliadas utilizando o método DNS que quantifica açúcares redutores resultantes da clivagem das moléculas de amido. A máxima atividade enzimática observada no sobrenadante bruto do clone com fenótipo Mut+ foi 7.7 U/mL e do clone transformante MutS foi 6.9 U/mL. Os dois clones secretaram glicoamilases com 116 kDa que apresentaram diferentes poder catalítico, mas foram bioquimicamente semelhantes, com mesma temperatura de atividade ótima a 60ºC, elevada ação catalítica em pH ácido que varia de 4.5 a 2.5 com atividade máxima em pH 3.5 e suas estabilidades frente ao pH do meio de reacional, possuindo portanto, características desejáveis para uso em alguns processos bioindustrias. Ambos os produtos se mantiveram estáveis quando os extratos brutos foram incubados a temperatura de 4Cº por 60 dias, mantendo perto de 100% da atividade máxima. No entanto, a enzima produzida por P. pastoris Mut+ apresenta maior estabilidade térmica, retendo cerca de 70% de atividade residual quando incubada por 60 minutos a 60Cº, contra menos de 10% de atividade residual observada para a enzima expressa pelo clone MutS, avaliada nas mesmas condições. Diferentes modificações pós-traducionais poderiam estar envolvidos na pronunciada diferença de estabilidade térmica das proteínas produzidas por P. pastoris que tem se mostrado um excelente sistema de expressão de proteínas.

The utilization of biotechnological products, mainly proteins and enzymes in the industrial sector, has been increased considerably worldwide. Glucoamylase is of main enzyme responsible for the hydrolysis of starch for the formation of glucose syrup, raw material used by the food industry and carbon source in diverse fermentative process. The methylotrophic yeast Pichia pastoris has been successfully used for the expression of some heterologous proteins of biotechnological interests. The aim of this work was to evaluate the system of proteins heterologous expression using the yeast P. pastoris for enzyme production. The glucoamylase cDNA isolated from Aspergillus awamori 2B 361 U2/1 was inserted into P.…

Advisors/Committee Members: Astolfi Filho, Spartaco, Lozano, Jorge Luis López, Schenberg, Ana Clara Guerrini, Willerding, André Luis, Silva, Leonor Alves de Oliveira da, Silva, Leonor Alves de Oliveira da.

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O tambaqui, Colossoma macropomum, é um peixe de grande valor comercial para região amazônica e representa uma espécie modelo para a região em vista dos inúmeros estudos a seu respeito, quer seja pela biologia, fisiologia e genética. Devido a sua grande importância, o objetivo desse trabalho foi construir e caracterizar uma biblioteca de cDNA mista de hipófise e partes do cérebro, identificar transcritos através de anotação genômica utilizando ferramentas de bioinformática, para categorização dos transcritos e posteriormente identificação de genes de interesse biotecnológico, seguido da expressão e secreção de um deles na forma recombinante. A biblioteca gerada foi sequenciada e como resultado foi obtido 1728 clones que resultaram em 1060 ESTs agrupados em 184 contig s e 12 singlets. A maioria dos genes conhecidos, encontrados na presente análise, está relacionada com os genes ribossomais, seguido dos genes mitocondriais. Além desses, outros transcritos importantes foram identificados e o índice de novidade foi de 43%. Nessas análises, foi possível identificar e isolar o gene do hormônio de crescimento (GH) e logo iniciar o estudo de expressão e secreção do hormônio de crescimento recombinante do tambaqui (tGH) no sistema Pichia pastoris. A partir da sequência de cDNA do tambaqui, a região estrutural do gene do hormônio de crescimento foi construída por síntese química e introduzida no cassete de expressão/ secreção do vetor pPIC9. O plasmídeo recombinante denominado tGH foi introduzido em células de P. pastoris por eletroporação, os clones recombinantes foram selecionados pelo marcador genético auxotrófico HIS4. A maior expressão do tGH pela P. pastoris GS115 foi alcançada após 72 h de cultivo. A massa molecular estimada em gel de SDS-PAGE 15% revelou que o tamanho do tGH era de 22 kDa, similar ao tamanho do hormônio de crescimento de outras espécies de vertebrados descritos na literatura. Dessa forma, o tGH dessa importante espécie para aquicultura local poderá ser posteriormente aplicado em ensaios experimentais, visando o futuro uso como fator de aceleração do crescimento de peixes de interesse comercial. Tais resultados abrem perspectivas para um estudo mais amplo tanto na área genômica quanto na aplicação do hormônio de crescimento recombinante na piscicultura.

The tambaqui, Colossoma macropomum, is a fish of great commercial value to the Amazon region and represents an emblematic species taking into account the studies carried out on its biology, physiology and genetics. Due to its importance, the aim of this study was to construct and characterize a cDNA library of mixed parts of the hypophysis and the brain in order to identify transcripts by genome annotation using bioinformatics tools for categorization of the transcripts. Genes of biotechnological interest, followed by the expression and secretion of one of them in recombinant form were also identified. A total of 1728 clones were sequenced that resulted in 1060 ESTs grouped into 184 contig s and 12 singlets. Most of the known genes found in this…

Advisors/Committee Members: Porto, Jorge Ivan Rebelo, Astolfi Filho, Spartaco, Hilsdorf, Alexandre Wagner Silva, Schneider, Maria Paula Cruz, Brigido, Marcelo de Macedo, Torres, Fernando Araripe Gonçalves, Torres, Fernando Araripe Gonçalves.

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O principal objetivo do trabalho foi isolar as regiões estruturais dos genes sod correspondentes às ORFs CV0867 (sodB2) e CV2504 (sodB1) de C. violaceum e expressá- las em células de Escherichia coli portando os genes sod, para avaliar o incremento da atividade de SOD nas células recombinantes submetidas a condições de estresse oxidativo. O gene sodB1 foi isolado via PCR, utilizando iniciadores específicos, e clonado em vetor pGEM ® -T Easy. Para sodB2, não conseguiu-se otimizar a reação de amplificação. Com o intuito de obter um vetor para expressão heteróloga regulada de SOD foram traçadas estratégias para a construção de vetores com expressão controlada por um promotor estericamente regulado - srp. O gene sodB1 foi então subclonado nos vetores pCR4-SRP e pUC-SRP, derivados de pCR ® 4-TOPO ® e pUC72, respectivamente, ambos desenvolvidos a partir deste trabalho. No entanto, não foi possível a obtenção de clones recombinantes. Apesar de SOD não ser uma proteína tóxica para a célula, testou-se a hipótese de que a superexpressão desta proteína seria a causa da letalidade dos clones recombinantes. Assim, foram clonados os genes amy e pfu em pUC-SRP. Porém, mais uma vez não foram obtidos clones portando os genes de interesse. Conclui-se então que os mecanismos de expressão do vetor pUC-SRP, bem como de pCR4-SRP, devem ter ocasionado efeitos deletérios às células hospedeiras, e que alterações na sua estrutura devem ser feitas no sentido de minimizar os níveis de expressão heteróloga, reduzindo assim o risco de produção de toxicidade para os clones.

The main objective of this work was to isolate the ORFs CV0867 (sodB2) e CV2504 (sodB1) of C. violaceum and induce their expression in Escherichia coli cells harboring sod genes, to evaluate the increase in SOD activity in the recombinant cells exposed to oxidative stress conditions. The sodB1 gene was isolated by PCR, using specific primers, and cloned into pGEM ® -T Easy vector. The amplification reaction could not be optimized for the second set of primers, specific for sodB2 gene. In an attempt to obtain a vector suitable for the regulated heterologous expression of SOD, some strategies were proposed for the construction of vectors with expression under the control of a sterically repressed promoter – srp. The sodB1 gene was then subcloned into vectors pCR4-SRP and pUC-SRP, derived from pCR ® 4-TOPO ® e pUC72, respectively, both developed during this project. However, the obtaining of recombinant clones was not possible. Despite the fact that SOD is not a toxic protein for the cell, we tested the hypothesis of the lethality of recombinant clones caused by the overexpression of SOD. Thus, amy and pfu genes were cloned into pUC-SRP, although the clones harboring the gene of interest could not be obtained. We concluded that the expression mechanisms of pUC-SRP and pCR4-SRP vectors may have caused deletery effects to the host cells, and that modifications in their structure should be made for the minimizing of heterologous expression levels, reducing the risk of toxicity for…

Advisors/Committee Members: Astolfi, Filho, Spartaco, Andrade, Edmar Vaz de.

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A conclusão do seqüenciamento do genoma de Chromobacterium violaceum deu origem à necessidade de caracterizar a funcionalidade dos genes anotados presentes no cromossomo essa bactéria. Em seu genoma foram encontradas várias ORFs (Open Reading Frames), correspondentes a genes de interesse biotecnológico, e entre eles cinco que codificam quitinases. Esse trabalho apresenta os resultados da clonagem e expressão dos genes que codificam quitinases de Chromobacterium violaceum. Foram selecionadas quatro ORFs cujas seqüências de DNA foram obtidas por meio de PCR, com iniciadores específicos. Foram utilizadas duas estratégias neste trabalho, a clonagem da seqüência completa dos genes, e outra a clonagem da região codificadora fusionada com a seqüência da subunidade B da proteína A de Staphylococcus aureus, utilizando sinais de transcrição e tradução de um vetor de expressão conhecido. A primeira estratégia não produziu resultados conclusivos, pois não se obteve sucesso na clonagem. Com a segunda estratégia foi obtida expressão da seqüência correspondente a ORF CV2736 , cuja proteína foi expressa em altos níveis e apresentou atividade frente ao substrato.

The sequencing of the Chromobacterium violaceum genome generated the necessity of characterizes the genetic function of the transcripts present in this bacterial chromosome set. In this genome were found several ORFs (Open Read Frame) corresponding to the biotechnological target genes, and among them five that codify Chitinases. This work shows the results obtained with cloning and express chitinases genes of Chromobacterium violaceum We selected four ORFs who s the DNA sequences were obtained by PCR, with specific primers. Two strategies were utilized in this work, one was cloning the complete gene sequence, and other was cloning the code region in a fusion with the Staphylococcus aureus B subunit of A protein, using the transcription and translation signals of a known expression vector. The first strategy didn t produce good results because we didn t obtained success with cloning. The second strategy it made possible the expression of the sequence corresponding to ORF CV2736, who s the enzyme was obtained in high levels and presented activity when in contact with substrate.

Advisors/Committee Members: Astolfi Filho, Spartaco, Marco, Janice Lisboa de, Vicente, Elisabete Jose, Yamane, Tetsuo, Pereira, José Odair, Pereira, José Odair.

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A conclusão do seqüenciamento do genoma de Chromobacterium violaceum deu origem à necessidade de caracterizar a funcionalidade dos genes anotados presentes no cromossomo essa bactéria. Em seu genoma foram encontradas várias ORFs (Open Reading Frames), correspondentes a genes de interesse biotecnológico, e entre eles cinco que codificam quitinases. Esse trabalho apresenta os resultados da clonagem e expressão dos genes que codificam quitinases de Chromobacterium violaceum. Foram selecionadas quatro ORFs cujas seqüências de DNA foram obtidas por meio de PCR, com iniciadores específicos. Foram utilizadas duas estratégias neste trabalho, a clonagem da seqüência completa dos genes, e outra a clonagem da região codificadora fusionada com a seqüência da subunidade B da proteína A de Staphylococcus aureus, utilizando sinais de transcrição e tradução de um vetor de expressão conhecido. A primeira estratégia não produziu resultados conclusivos, pois não se obteve sucesso na clonagem. Com a segunda estratégia foi obtida expressão da seqüência correspondente a ORF CV2736 , cuja proteína foi expressa em altos níveis e apresentou atividade frente ao substrato.

The sequencing of the Chromobacterium violaceum genome generated the necessity of characterizes the genetic function of the transcripts present in this bacterial chromosome set. In this genome were found several ORFs (Open Read Frame) corresponding to the biotechnological target genes, and among them five that codify Chitinases. This work shows the results obtained with cloning and express chitinases genes of Chromobacterium violaceum We selected four ORFs who s the DNA sequences were obtained by PCR, with specific primers. Two strategies were utilized in this work, one was cloning the complete gene sequence, and other was cloning the code region in a fusion with the Staphylococcus aureus B subunit of A protein, using the transcription and translation signals of a known expression vector. The first strategy didn t produce good results because we didn t obtained success with cloning. The second strategy it made possible the expression of the sequence corresponding to ORF CV2736, who s the enzyme was obtained in high levels and presented activity when in contact with substrate.

Advisors/Committee Members: Astolfi Filho, Spartaco, Marco, Janice Lisboa de, Vicente, Elisabete Jose, Yamane, Tetsuo, Pereira, José Odair, Pereira, José Odair.

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Pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke, Lauraceae) tem importância econômica e ecológica na região Amazônica. Como conseqüência desta importância econômica, as populações de pau-rosa têm sido dizimadas na floresta. Espécies de nove gêneros de Lauraceae têm seu cariótipo caracterizado com n=x=12 cromossomos na fase gametofítica. O gênero Aniba é um dos membros da família Lauraceae menos estudado e os genomas destas espécies são ainda desconhecidos. Os resultados da citogenética apresentaram um cariótipo com 12 pares (2n=24) de cromossomos relativamente pequenos, com tamanhos de 1.34 a 2.25 μm. Neste estudo foi identificado a presença da região organizadora do nucléolo no braço curto do cromossomo 7. O tamanho do genoma também foi determinado por citometria de fluxo com valor 2C = 2.32 pg de DNA (aproximadamente 2.24x10 9 pares de bases). Dentro da necessidade de conservação e propagação da espécie. O objetivo era estabelecer um protocolo viável de micropropagação. A propagação in vitro de pau-rosa foi obtido utilizando meristema apical de plântulas em meio MS (Murashige & Skoog) suplementado com a combinação de 6 Benzilaminopurine (BAP) e indole- 3- acetic acid (AIA). Alta taxa de proliferação (4.50 brtações/explante) foi conseguido em 15 μM BAP +10 μM AIA. O enraizamento in vitro também foi alto (>60%) com 0 μM BAP + 25 μM AIA. Estes resultados sugerem que a combinação auxina e citocinina são uma alternativa importante para o sucesso na propagação in vitro de A. rosaeodora, embora requeira um estudo detalhado de cada tratamento para maximizar a proliferação das brotações e a formação de raízes.

Amazonian rosewood (Aniba rosaeodora Ducke, Lauraceae) has ecologic and economic importance in the region. As a consequence of its economic importance, rosewood populations have been decimated in the forest. Species of nine genera of the Lauraceae family have characterized karyotypes with n=x=12 chromosomes in the gametophytic phase. The Aniba genus is one of the least studied members of the Lauraceae family and the genomes of these species are still undescribed. The karyotype was found to contain 12 pairs (2n=24) of relatively small submetacentric chromosomes, with lengths from 1.34 to 2.25 μm. The presence of the nucleolar organizer region in the short arm of chromosome 7 was identified. The genome size was determined by flow cytometry with a 2C value = 2.32 pg of DNA (approximately 2.24x109 base pairs). In this study, was developed also a system of micropropagation has been for the conservation of the genetic diversity of the rosewood. In vitro propagation of rosewood was achieved using seedling shoot tip explants on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with combination 6 Benzilaminopurine (BAP) and indole- 3- acetic acid (AIA). The greatest proliferation rate (4.50 shoots/explant) was achieved in 15 μM BAP +10 μM AIA. Rooting in vitro was also greatest (up to >60%) with 0 μM BAP + 25 μM AIA. These results suggest that the combination auxin and cytocinina is an…

Advisors/Committee Members: Contim, Luis Antônio Serrão, Clement, Charles Roland, Nagao, Eduardo Ossamu, Sampaio, Paulo de Tarso Barbosa, Astolfi Filho, Spartaco, Alfenas, Acelino Couto, Alfenas, Acelino Couto.

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Pau-rosa (Aniba rosaeodora Ducke, Lauraceae) tem importância econômica e ecológica na região Amazônica. Como conseqüência desta importância econômica, as populações de pau-rosa têm sido dizimadas na floresta. Espécies de nove gêneros de Lauraceae têm seu cariótipo caracterizado com n=x=12 cromossomos na fase gametofítica. O gênero Aniba é um dos membros da família Lauraceae menos estudado e os genomas destas espécies são ainda desconhecidos. Os resultados da citogenética apresentaram um cariótipo com 12 pares (2n=24) de cromossomos relativamente pequenos, com tamanhos de 1.34 a 2.25 μm. Neste estudo foi identificado a presença da região organizadora do nucléolo no braço curto do cromossomo 7. O tamanho do genoma também foi determinado por citometria de fluxo com valor 2C = 2.32 pg de DNA (aproximadamente 2.24x10 9 pares de bases). Dentro da necessidade de conservação e propagação da espécie. O objetivo era estabelecer um protocolo viável de micropropagação. A propagação in vitro de pau-rosa foi obtido utilizando meristema apical de plântulas em meio MS (Murashige & Skoog) suplementado com a combinação de 6 Benzilaminopurine (BAP) e indole- 3- acetic acid (AIA). Alta taxa de proliferação (4.50 brtações/explante) foi conseguido em 15 μM BAP +10 μM AIA. O enraizamento in vitro também foi alto (>60%) com 0 μM BAP + 25 μM AIA. Estes resultados sugerem que a combinação auxina e citocinina são uma alternativa importante para o sucesso na propagação in vitro de A. rosaeodora, embora requeira um estudo detalhado de cada tratamento para maximizar a proliferação das brotações e a formação de raízes.

Amazonian rosewood (Aniba rosaeodora Ducke, Lauraceae) has ecologic and economic importance in the region. As a consequence of its economic importance, rosewood populations have been decimated in the forest. Species of nine genera of the Lauraceae family have characterized karyotypes with n=x=12 chromosomes in the gametophytic phase. The Aniba genus is one of the least studied members of the Lauraceae family and the genomes of these species are still undescribed. The karyotype was found to contain 12 pairs (2n=24) of relatively small submetacentric chromosomes, with lengths from 1.34 to 2.25 μm. The presence of the nucleolar organizer region in the short arm of chromosome 7 was identified. The genome size was determined by flow cytometry with a 2C value = 2.32 pg of DNA (approximately 2.24x109 base pairs). In this study, was developed also a system of micropropagation has been for the conservation of the genetic diversity of the rosewood. In vitro propagation of rosewood was achieved using seedling shoot tip explants on Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with combination 6 Benzilaminopurine (BAP) and indole- 3- acetic acid (AIA). The greatest proliferation rate (4.50 shoots/explant) was achieved in 15 μM BAP +10 μM AIA. Rooting in vitro was also greatest (up to >60%) with 0 μM BAP + 25 μM AIA. These results suggest that the combination auxin and cytocinina is an…

Advisors/Committee Members: Contim, Luis Antônio Serrão, Clement, Charles Roland, Nagao, Eduardo Ossamu, Sampaio, Paulo de Tarso Barbosa, Astolfi Filho, Spartaco, Alfenas, Acelino Couto, Alfenas, Acelino Couto.