▼ 

Giardia duodenalis is a parasite of several mammalian species, including humans, with a worldwide distribution. It is associated with diarrhea and nutritional disorders, especially in children. Molecular characterization of the parasite is crucial to identify assemblages/sub-assemblages related to infection, and its association with clinical manifestations. The goal was to identify the molecular assemblages/sub-assemblages of G. duodenalis in children from pre-school, from Araguari and Uberlândia, Minas Gerais, Brazil. It was used four genes for this research. The cysts were researched with 33% zinc sulfate flotation. The molecular characterization used SSU rRNA, β-giardin (bg), glutamate dehydrogenase (gdh) and triose phosphate isomerase (tpi) protocols. We conducted a multilocus genotyping (MLG) and the association between clinical manifestations and assemblage. Cysts of G.duodenalis were found in 45 (19.9%) of 226 stool samples from nurseries children. PCR detection (SSU rRNA protocol) failed to amplify DNA samples. Tpi protocol has amplified thirty-four sequences: 16 assemblage A, 14 assemblage B and four mixed samples A/B. Gdh protocol amplified 32 sequences, including 14 assemblage A, 16 assemblage B and two A/B. For bg protocol 19 samples sequenced, nine was characterized as assemblage A, five as assemblage B, three as E, and two mixed, A/E and B/E. The predominance of assemblages varied with the gene protocol used. Heterogeneous samples were found in all genes, including mixed inter-assemblages A/B, A/E, B/E, and intra-assemblage BIII/BIV. Animal-specific (assemblage E) samples were identified with bg, and not confirmed by other genes. From 45 positive samples by optical microscopy, 35 were amplified by nested PCR for at least one gene. Among all, 12 samples were characterized in full concordance by the three genes. It was described two new MLGs assemblages A and five new MLGs to assemblage B. Assemblage A was highly prevalent in Araguari (p = 0.0101) and assemblage B, in Uberlândia. There was a statistically association (p = 0.0454) between assemblage B and diarrhea. There was no association with other clinical manifestations such as abdominal pain, vomiting, weight loss, flatulence and stool consistency. These findings prove the importance of using more than one gene protocol, since the sensitivity and genetic variability changes with the locus used. Heterogeneous sequences were found for all three genes and were considered mixed infections. PCR failed to amplify positive samples by optical microscopy. The use of MLG was important for the classification of assemblage A isolates, but less effective in assemblage B.

Giardia duodenalis é parasito de várias espécies de mamíferos, incluindo humanos, tendo distribuição mundial. Está associado à diarréia e desordens nutricionais, especialmente em crianças. A caracterização molecular do parasito é fundamental para identificar as Assemblages/sub-Assemblages relacionadas à infecção, possibilitando a associação dessas com manifestações clínicas. O objetivo…

Advisors/Committee Members: Rodrigo Martins Soares, Márcia Cristina Cury, Jair Pereira da Cunha Junior.

▼ CAPÍTULO I: O sistema imunológico é constituído de uma complexa rede de moléculas e células que funciona a fim de proteger o organismo contra patógenos. O sistema imune sadio deve manter o balanço entre a capacidade de responder a agentes infecciosos e de sustentar a autotolerância. No entanto, podem ocorrer falhas que resultam em reações contra as células e tecidos do próprio organismo e que causam doenças autoimunes, como a Artrite Reumatóide (AR). Esta é uma doença autoimune caracterizada por artrite simétrica e aditiva, de causa desconhecida, que se inicia geralmente após os 30 anos, acometendo mulheres três vezes mais que em homens, com prevalência de 1,0% em algumas regiões. Nas artrites reumatóides, a membrana sinovial torna-se infiltrada por vários tipos de células inflamatórias, que sinergizam para causar destruição das articulações, provocando fortes dores articulares. O diagnóstico da artrite depende da associação de uma série de sintomas e sinais clínicos, achados laboratoriais e radiográficos. O objetivo do tratamento é aliviar as dores, melhorar ou manter a capacidade funcional, prevenir as incapacidades e melhorar sua qualidade de vida. Ainda não existe nenhum teste que confirme a presença da doença, não há exames laboratoriais considerados específicos para a sua definição diagnóstica. Modelos murinos são eficazes para ampliar nossa compreensão a respeito da artrite humana, como animais da linhagem DBA/1J que apresenta alta susceptibilidade ao desenvolvimento de artrite consequente de imunização com colágeno tipo II. Phage Display é um método de seleção no qual uma biblioteca contendo peptídeos que são expressos na superfície de fagos, com o material genético codificante para cada peptídeo localizado no genoma viral. O direcionamento com peptídeos ligantes à regiões altamente inflamadas são úteis para auxiliar no diagnóstico diferencial, avaliar a extensão da inflamação, determinar o prognóstico e resposta à terapia. Nesse sentido, a busca por novos biomarcadores podem levar a novos métodos para o diagnóstico e tratamento da AR. Essa revisão visa descrever alguns aspectos da Artrite Reumatóide e como a tecnologia de Phage Display in vivo pode ser utilizada na identificação de ligantes à diversos antígenos relacionados à inflamação. CAPÍTULO II: A Artrite Reumatóide (AR) é uma doença autoimune crônica, caracterizadas por inflamação persistente das articulações, sendo os sinais típicos desta inflamação a dor, inchaço e limitação dos movimentos. O termo Artrite se dá a uma inflamação da articulação, de causa pouco conhecida, podendo acometer diferentes articulações. O diagnóstico da AR depende da associação de uma série de sintomas e sinais clínicos, achados laboratoriais e radiográficos. Desta forma, trabalhos que são direcionados a investigar novos biomarcadores tornam-se de grande importância para o diagnóstico da AR. O objetivo deste estudo foi selecionar e identificar por meio da metodologia de Phage Display in vivo, peptídeos ligantes à regiões inflamadas de camundongos DBA/1 sintomatizados com alta… Advisors/Committee Members: Carlos Ueira Vieira, Jair Pereira da Cunha Junior, Marcelo Henrique Napimoga.

▼ 

A exposição a alérgenos de ácaros da poeira domiciliar é o principal fator de risco para o desenvolvimento de alergia respiratória. Blo t 5 é o principal alérgeno do ácaro Blomia tropicalis (Bt) e pelo menos 70% dos pacientes com rinite possuem reatividade de IgE a este alérgeno. O objetivo deste estudo foi avaliar perfil de modificada (mBlo t 5) em pacientes atópicos e não atópicos. Três grupos de pacientes foram avaliados (atópico Bt +, atópico Bt e não atópico), com base no teste cutâneo e testes sorológicos. Nós projetamos dois construtos, um que codifica a sequência original de Blo t 5 (rBlo t 5) e outro uma sequência modificada (mBlo t 5) e produzimos os respectivos alérgenos recombinantes. A reatividade específica do rBlo t 5 e mBlo t 5 foi provada com o anticorpo monoclonal anti-Blo t 5 e soro IgE positivo de pacientes atópicos Bt + por slot-blot. Os níveis de IgE e positividade para ambos rBlo t 5 e mBlo t 5 foram comparáveis no grupo de pacientes atópicos Bt +. Um perfil semelhante de reatividade de IgG1 aos alérgenos recombinantes foi encontrado em ambos pacientes atópicos e não atópicos. Foi notável uma reatividade de IgG4 aumentada ao mBlo t 5 em relação ao rBlo t 5 em pacientes atópicos Bt +. Houve uma correlação positiva entre IgE e IgG4 para ambos alérgenos recombinantes, sendo rBlo t 5 preferencialmente reconhecido por IgG1 e IgG4 do que por IgE, sendo esse fenômeno mais evidente para IgG4 em relação ao mBlo t 5. Redução da reatividade de IgE ocorreu em 48% das amostras e 26% delas apresentaram uma redução significante (>20%). Em relação à reatividade de IgG4, 57% das amostras apresentaram um aumento, sendo que 37% dessas amostras tiveram um aumento >20%. Em conclusão, a modificação feita no alérgeno Blo t 5 favoreceu uma mudança de antigenicidade para o isotipo IgG4, tornando conveniente a sua utilização como potencial candidato em estudos de imunoterapia alérgeno específicos.

Exposure to house dust mite (HDM) allergens is the main risk factor for the development of respiratory allergy. Blo t 5 is the most important allergen from the mite Blomia tropicalis (Bt) and at least 70% of rhinitis patients show IgE reactivity to this allergen. The aim of this study was to evaluate the IgE, IgG1 and IgG4 reactivity profile to recombinant Blo t 5 allergen and its modified form in atopic and non-atopic patients. Three patient groups were evaluated (atopic Bt+, atopic Bt- and non-atopic) with basis on the skin prick test and serological assays. We designed two constructs encoding the Blo t 5 full sequence, one with the original sequence (rBlo t 5) and another with a modified sequence (mBlo t 5) and produced the respective recombinant allergens. The specific reactivity of rBlo t 5 and mBlo t 5 was probed with the monoclonal antibody to Blo t 5 and positive IgE serum from atopic Bt+ patients in slot-blot assays. IgE levels and positivity to both rBlo t 5 and mBlo t 5 were comparable in atopic Bt+ patients. A similar profile of IgG1 reactivity to recombinant allergens was found in both atopic and non-atopic…

Advisors/Committee Members: Ernesto Akio Taketomi, Gesmar Rodrigues Silva Segundo, Virmondes Rodrigues Junior, Jair Pereira da Cunha Junior.

▼ 

Recombinant proteins from Toxoplasma gondii have been used in several experimental models, as well as for serodiagnosis of human toxoplasmosis, particularly to differentiate acute from chronic phases of the infection. In the present study, we evaluated the kinetics of IgM, IgA, and IgG isotypes, in addition to IgG1 and IgG3 subclasses, by testing sequential serum samples from patients with acute toxoplasmosis. It was carried out immunoassays by using SAG2A recombinant antigen and soluble antigen of Toxoplasma (STAg). The avidity of IgG1 antibody was assessed using slot blot assay. Additionally, a ratio between IgG1 and IgG3 subclasses (IgG3:IgG1) was determined and evaluated its degree of association with levels of IgM and IgA specific for STAg and the avidity index of IgG1 specific for SAG2A. The results showed a decreasing kinetic profile for SAG2A and STAg for IgM and IgA. The kinetic profile for the IgG antibody was increasing for both antigens. Compared to the avidity for IgG1, it was observed that sera from an early stage showed a low average avidity of IgG1 for SAG2A while the same samples showed intermediate mean avidity of IgG1 when STAg was used as antigen. In a later phase, the average avidity observed was high for STAg and intermediate for SAG2A in the same tested sera suggesting that SAG2A may be a promising tool for the detection of avidity. Associations between IgG3/IgG1 and specific IgM and IgA levels for STAg and the avidity index of specific IgG1 for SAG2A were found, and together these parameters could be used as valuable tools in the diagnosis of human toxoplasmosis, especially in situations when the determination of different phases is critical.

Proteínas recombinantes de Toxoplasma gondii têm sido utilizadas em diversos modelos experimentais, assim como para o diagnóstico sorológico da infecção humana por este parasito, principalmente com o intuito de diferenciar as fases aguda e crônica da toxoplasmose. Neste estudo, foi avaliada a cinética dos anticorpos IgM, IgA ,IgG e subclasses (IgG1 e IgG3) através de imunoensaios realizados em amostras seqüenciais de soros humanos, provenientes de pacientes com toxoplasmose aguda. Estas amostras foram testadas frennte ao antígeno recombinante SAG2A, utilizando-se como paradigma de comparação o antígeno solúvel total de Toxoplasma (STAg). A avidez do anticorpo IgG1 foi avaliada utilizando a metodologia slot-blot. Adicionalmente, a razão entre as subclasses IgG3 e IgG1 (IgG3:IgG1) foi determinada e avaliada quanto ao grau de associação com os níveis de IgM e IgA específicos para STAg e aos índices avidez de IgG1 específicos para SAG2A. Os resultados demonstraram a presença de níveis decrescentes de IgM e IgA para ambos os antígenos utilizados, enquanto que para o isotipo IgG o perfil cinético demonstrou níveis crescentes para ambas preparações antígênicas. Em relação aos índices de avidez para IgG1, foi observado que amostras de soros de uma fase inicial apresentaram baixa avidez média de anticorpos IgG1 dirigidos para SAG2A, enquanto que as mesmas…

Advisors/Committee Members: Jose Roberto Mineo, Carlos Priminho Pirovani, Vânia Olivetti Steffen Abdallah, Jair Pereira da Cunha Junior.

▼ 

A tuberculose (TB) é uma doença bacteriana de alta mortalidade, causada pelo Mycobacterium tuberculosis, transmitida pelo doente através das vias respiratórias. A TB é um grave problema de saude pública. Estima-se que um terço da população mundial seja infectada com M. tuberculosis, na forma de infecção latente, que pode assim permanecer por toda a vida, até que por queda da imunidade venha se desenvolver caracterizando a infecção ativa. O Brasil, apesar da imunização em massa de recém-nascidos, está entre os 22 países que representam 80% dos infectados. Para controlar a disseminação e o avanço da doença é necessário, além de monitorar os pacientes garantindo o tratamento e cura, rapidez no diagnóstico. Os métodos diagnósticos atualmente utilizados não correspondem à necessidade quanto à agilidade e sensibilidade, e não são capazes de diferenciar infecção de doença ativa. Alguns estudos vem demonstrando a importância de proteínas secretadas por cepas virulentas para o uso em plataformas diagnósticas. Nas ultimas décadas, muitos autores tem chamado a atenção para as características promissoras da saliva como amostra biológica ideal para ensaios de diversos tipos de doenças. O objetivo deste trabalho foi selecionar e caracterizar ligantes de alta afinidade a Imunoglobulinas A presentes em saliva de indivíduos com tuberculose. Nós utilizamos a tecnologia de bibliotecas apresentadas em fagos, phage display, para identificar peptídeos miméticos a proteínas de M. tuberculosis, a partir de IgA de saliva de pacientes com tuberculose. Vinte clones foram selecionados e analisados quanto à similaridade e alinhamento com proteínas depositadas em banco de dados. Cinco apresentaram similaridade e alinharam com proteínas antigênicas relacionadas à virulência de M. tuberculosis, CFP-10/ESAT-6, rpf e família PE de proteínas, codificadas na Região de Diferenciação (RD1). Os clones foram submetidos a testes ELISA, para avaliar a imunorreatividade frente a IgA presente em saliva de indivíduos saudáveis, reativos ou não ao teste tuberculínico e de pacientes com tuberculose com tempo de tratamento variando de 0 a 6 meses. As análises estatísticas mostraram que os clones diferenciaram significantemente as salivas positivas das negativas (p<0,05), com sensibilidade de 100% e especificidade média de 73%. A análise da curva de regressão dos valores das absorbâncias em função do tempo de tratamento mostrou uma tendência a declínio. Nossos clones são potenciais marcadores para diagnóstico e possivelmente para controle de tratamento, sendo capazes de diferenciar infecção latente e doença ativa.

Tuberculosis (TB) is a bacterial disease of high mortality, caused by Mycobacterium tuberculosis, transmitted by the patient through the respiratory tract. TB is a serious public health problem. It is estimated that one third of the world population is infected with M. tuberculosis in the form of latent infection, which may as well stay for the entire life, until a drop of immunity will develop characterizing the active infection. Brazil, despite the…

Advisors/Committee Members: Milton Ozório Moraes, Jair Pereira da Cunha Junior, Luiz Ricardo Goulart Filho.

▼ O coração é um órgão vital propulsor de sangue, que transporta oxigênio e nutrientes para todo organismo, todavia quando estes componentes não chegam a ele devido à obstrução arterial, ocorre instabilidade elétrica no processo de contração deste músculo, causando arritmias que, normalmente em menos de uma hora, promovem o infarto agudo do miocárdio, que juntamente com os problemas vasculares cerebrais são os maiores responsáveis pela mortalidade em todo o mundo. O diagnóstico segundo a OMS tem 3 vertentes: clínico, eletrocardigráfico e bioquímico. Este último é muito lento e os dois primeiros apresentam muitas falhas, sendo necessário o desenvolvimento de técnicas analíticas que possam gerar resultados rápidos, específicos, sensíveis e de baixo custo. Polímeros como poli(aminofenóis) são plataformas interessantes para imobilização de biomoléculas em função dos substituintes no anel aromático e de suas características, tais como: excelente permeabilidade, seletividade, reprodutibilidade e tempo de resposta rápida. Para formação destes polímeros a síntese eletroquímica é a mais usual e quando o interesse é pela detecção óptica, substratos vítreos como o óxido de estanho dopado com flúor (FTO) tornam-se atrativos como transdutores, pelas suas excelentes características, tais como: boa condutividade elétrica, alta transparência, inércia química, alta reprodutibilidade e aderência ao vidro. A detecção óptica indireta através de marcadores aumenta a sensibilidade do diagnóstico, sendo que os quantum dots têm se mostrado superiores aos fluoróforos convencionais, como a cianina, a rodamina e o alexa flúor, em função de suas propriedades fotofísicas extraordinárias como: amplo espectro de absorção, estreito espectro de emissão, elevada fotoestabilidade e tempo de decaimento. Neste trabalho foi eletropolimerizado em FTO através de voltametria cíclica o 3-aminofenol, cujo espectro de ultravioleta na região do visível mostrou absorção entre 300 e 350 nm, proporcional a quantidade de material formado. A troca iônica das sondas redox ferro/ferricianeto de potássio e cloreto de hexaminrutênio (II) demonstraram que o material tem atração por estruturas catiônicas e repulsão por estruturas aniônicas. As imagens de microscopia eletrônica de varredura com emissão de campo e de força atômica mostraram recobrimento polimérico rugoso quase total da superfície do FTO, cuja espessura máxima por interferometria a laser foi estimada em 37575 nm. A caracterização elétrica e a espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) demonstraram que o material tem um elevado caráter passivante, podendo ser aplicado como matriz na construção de uma plataforma de diagnóstico para lesão cardíaca através da formação de uma ligação amida estável entre os grupamentos NH2 do poli(3-aminfenol) e as carboxilas terminais (Fc) do anti-troponina T via EDC/NHS. Adicionalmente este anticorpo foi modificado com biotina, sendo sua afinidade a estreptavidina, assim como a especificidade entre anticorpo e antígeno exploradas no design deste sistema. A detecção seletiva… Advisors/Committee Members: Ana Graci Brito Madurro, João Marcos Madurro, Jair Pereira da Cunha Junior, Herman Sander Mansur.

▼ A cirurgia cardíaca pediátrica com auxílio da circulação extracorpórea (CEC) está associada a uma resposta inflamatória complexa, de intensidade variável. Em alguns casos tal reação pode desencadear uma disfunção de múltiplos órgãos resultando em morbidade e mortalidade significativas. Estudos prévios demonstraram a participação de citocinas tanto com perfil pró-inflamatório quanto anti-inflamatório na resposta inflamatória nesse grupo de pacientes, assim como sua relação com a morbidade no período pós-operatório (PO). O presente estudo teve os seguintes objetivos: delinear a cinética das concentrações plasmáticas de oito diferentes citocinas, determinar o impacto da hemotransfusão nesta cinética e avaliar a possível correlação da cinética das concentrações plasmáticas das citocinas com a morbidade no PO. A casuística foi constituída por um grupo de 19 crianças com diagnóstico de cardiopatias congênitas não cianosantes com sobrecarga de volume de ventrículo esquerdo e hiperfluxo pulmonar, classificadas como de baixo risco para mortalidade operatória, submetidas a cirurgia corretiva com CEC. Foram coletadas amostras sanguíneas das crianças incluídas no estudo em sete momentos diferentes: após a indução da anestesia mas antes do início da cirurgia (T0), cinco minutos após o início da CEC (T1), cinco minutos após a abertura da pinça da aorta (T2), ao final do procedimento cirúrgico (T3), quatro horas após o final da cirurgia (T4) , primeiro dia de PO (T5) e segundo dia de PO (T6). Para cada amostra foi realizada a mensuração das concentrações plasmáticas da interleucina (IL)-2, interleucina (IL)-4, interleucina (IL)-6, interleucina (IL)-10, interleucina (IL)-17, fator de necrose tumoral (TNF)-α, interferon (IFN)-γ e do fator inibidor da migração de macrófagos (MIF). Também foram avaliadas a transfusão de hemoderivados e oito variáveis relacionadas a morbidade: tempo de CEC, tempo de pinçamento aórtico, escore inotrópico, escore de TISS cumulativo, índice de oxigenação, volume de sangramento pós-‐operatório nas primeiras 48 horas, tempo de ventilação mecânica e tempo de internação na UTI no período pós-operatório. Considerando a cinética das concentrações plasmáticas das citocinas avaliadas, as concentrações de IL-6, IL-10 e MIF se modificaram significativamente em resposta ao procedimento cirúrgico. As concentrações de IL-6 se elevaram em T3, T4 e T5 e retornaram aos valores basais em T6. As concentrações de IL-10 se elevaram em T2, T3 e T4 e retornaram aos valores basais em T5. As concentrações de MIF se elevaram em T2 e T3, retornaram aos valores basais em T4 e se elevaram novamente em T6. A transfusão de concentrado de hemácias não teve impacto nas concentrações plasmáticas de IL-6, IL-10 e MIF. As concentrações plasmáticas de IL-2, IL-4, IL-17, IFN-γ e TNF-α não se modificaram significativamente desde a indução da anestesia até o segundo dia de PO. Quanto a correlação das concentrações das citocinas com a morbidade no PO, foi detectada uma correlação positiva entre as concentrações… Advisors/Committee Members: Jose Roberto Mineo, Aguinaldo Coelho da Silva, Jair Pereira da Cunha Junior, Fernando Antibas Atik, Ricardo Ribeiro Dias.

▼ 

The aim of this study was to verify the efficiency of the treatment with combination of drugs (sulphadiazine, pyrimethamine, and folinic acid- SPFA), azithromycin, Artemisia annua infusion and spiramycin on the prevention vertical transmission of toxoplasmosis in Calomys callosus. Female C. callosus were perorally infected with 20 cysts of Toxoplasma gondii ME-49 strain at the day that a vaginal plug was observed (1st day of pregnancy -dop). Treatment with azithromycin, A. annua infusion and spiramycin started at the 4th dop, while the treatment with drug association started at the 14th dop. Placenta and embryonic tissues were collected for morphological and immunohystochemical analyses, bioassay and PCR from the 15th to 20th dop. No morphological changes were seen in the placenta and embryonic tissues from females treated with SPFA or azithromycin or spiramycin, but embryo atrophy was observed in animals submitted to A. annua infusion treatment. After treatment, parasites were observed in the placenta and fetal (brain and liver) tissues of the animals that were treated with SPFA, A. annua infusion and spiramycin but the number of parasites was lower than in non-treated animals. Parasites were also observed in the placenta of the animals treated with azithromycin, but not in their embryos. Bioassay and PCR results confirmed the immunohistochemical data. In addition bradyzoite immunostaining was observed in placental and fetal tissues of the animals treated with SPAF. In conclusion, the treatment with azithromycin has shown to be more effective to inhibit the vertical transmission of toxoplasmosis in C. callosus.

O objetivo deste trabalho foi verificar a eficácia dos tratamentos com sulfadiazina, pirimetamina e ácido folínico (SPAF) associados, azitromicina, infusão de Artemisia annua e espiramicina na prevenção da transmissão vertical da toxoplasmose em Calomys callosus (Rodentia: Cricetidae). Fêmeas de C. callosus foram oralmente infectadas com 20 cistos de Toxoplasma gondii (cepa ME-49) no dia de detecção da rolha vaginal (primeiro dia de gestação). O tratamento com azitromicina, infusão de A. annua e espiramicina iniciou-se a partir do 4 dia de gestação e o tratamento com a associação de SPAF a partir do 14 dia de gestação e inóculo. Placenta e tecidos embrionários foram coletados para análises morfológica, imuno-histoquímica, bioensaio e reação de PCR do 15 ao 20 dia de gestação/inóculo. Não foram vistas alterações morfológicas nos tecidos placentários e fetais (fígado) de fêmeas tratadas com SPAF, azitromicina e espiramicina mas observou-se a presença de embriões atrofiados em animais submetidos ao tratamento com infusão de A. annua. Após os tratamentos, parasitos foram visibilizados em tecidos placentários e fetais (fígado) dos animais tratados com SPAF, infusão de A. annua e espiramicina, porém a quantidade de imunomarcações do parasito foi significativamente menor nesses animais quando comparados aos não tratados. Parasitos foram também observados nos tecidos placentários dos animais tratados com…

Advisors/Committee Members: Jose Roberto Mineo, Angélica Lemos Debs Diniz, Maria das Gracas Reis, Sônia Maria Oliani, Jair Pereira da Cunha Junior, Eloisa Amália Vieira Ferro.

▼ 

O ácaro da poeira domiciliar Dermatophagoides pteronyssinus (Dp) é uma das principais fontes de alérgenos intradomiciliar em todo o mundo, e por isto considerado importante na sensibilização de indivíduos predispostos geneticamente. Alguns alérgenos deste ácaro podem ocorrer como isoalérgenos diferenciando na sequência dos aminoácidos ou mesmo no padrão de glicosilação, o que pode causar diferenças na sensibilização alergênica. O objetivo do presente trabalho foi investigar novos antígenos imunodominantes com potencial aplicabilidade no diagnóstico laboratorial e monitoramento de indivíduos atópicos sob imunoterapia alérgeno-específica. Para isto, o extrato de Dp foi separado por eletroforese bidimensional (2D) com subsequente immunoblotting para detecção de componentes ligantes de IgE e IgG1 específica. O pool de soros testado no immunoblotting 2D foi escolhido a partir de um painel de soros positivos a alérgenos de Dp determinados por immunoblotting 1D para IgE e IgG1 específica em pacientes atópicos (A) e IgG1 em indivíduos não atópicos (NA), grupos estes definidos por teste cutâneo de puntura (TCP) e níveis específicos de IgE e IgG1 determinados por ELISA. Os níveis de IgE a Dp bem como a soropositividade foram maiores em atópicos (mediana IE = 3,8; 100%) do que em não atópicos (mediana IE = 0,7; 0%) (P<0,0001), enquanto níveis de anticorpos IgG1 específicos a Dp não mostraram diferença significante entre os grupos (mediana IE = 2,9; 84% vs mediana IE = 2,5; 86%). Os principais alérgenos ligantes de IgE determinados por immunoblotting 1D foram as bandas de 15 kDa, 60 kDa e 103 kDa, enquanto os principais alérgenos ligantes de IgG1 foram as bandas >56 kDa. A eletroforese 2D do extrato de Dp mostrou uma resolução de mais de 70 spots na faixa de ponto isoelétrico (pI) 3-10 e massa molecular 11-110 kDa. O immunoblotting 2D revelou diferenças nos padrões de ligação de IgE e IgG1, com vários spots reconhecidos por anticorpos IgE entre 15 e 103 kDa (pI 5,1-8,0). A reatividade de IgG1 no grupo A foi observada principalmente aos spots mais fortemente reconhecidos na faixa de maior massa molecular (70-103 kDa) e menor pI 5,1-6,6. Para a reatividade de IgG1 no grupo NA, os spots mais fortemente reconhecidos foram observados entre 85-103 kDa (pI 5,1-5,8). Assim, a eletroforese 2D com a subseqüente realização do immunoblotting permitiu a identificação de isoalérgenos específicos reconhecidos por diferentes isotipos de anticorpos em atópicos e não atópicos, o que pode contribuir de maneira relevante no desenvolvimento de potenciais candidatos para uso em diagnóstico e também no monitoramento do níveis de IgE e IgG1 específicos de pacientes alérgicos sob imunoterapia.

The house dust mite Dermatophagoides pteronyssinus (Dp) is a major source of indoor allergens in the world and considered important for sensitization of genetically predisposed subjects. Some allergens from this mite can occur as isoallergens with differences in amino acid sequences or glycosylation, leading to differences in allergenic sensitization. The aim…

Advisors/Committee Members: Ernesto Akio Taketomi, Deise Aparecida de Oliveira Silva, Jair Pereira da Cunha Junior, Cristina Ribeiro de Barros Cardoso.

▼ 

CAPÍTULO I: A detecção precoce do carcinoma oral de céulas escamosas (OSCC) é fator importante na diminuição das taxas de mortalidade e o sucesso do tratamento relaciona-se diretamente com seu diagnóstico em fases iniciais. Contudo, infelizmente, a maioria dos carcinomas orais é diagnosticada em fases tardias da doença. No presente trabalho, pela primeira vez, é descrito um fragmento scFv, selecionado por Phage Display contra proteínas totais salivares, que reconhece efetivamente antígenos com potencial diagnóstico para a detecção precoce do câncer oral. A análise de reatividade por meio do teste imunoenzimático ELISA em 30 amostras de saliva de pacientes com OSCC e 30 indivíduos saudáveis, mostrou que o scFv D09 reconhece antígenos presentes na saliva tumoral (p<0.0001). O teste diagnóstico apresentou elevado poder discriminativo, avaliado estatisticamente pela curva ROC (AUC=0.97), além de 100% de especificidade. Ensaios de imunohistoquímca mostraram que o anticorpo seleciondo também apresenta afinidade por estruturas teciduais características de carcinomas orais bem diferenciados, como, por exemplo, pérolas de queratina. A análise proteômica bidimensional revelou que o scFv D09 reconhece 2 spots nas amostras de saliva (~50 kDa; pI 5.75 e 5.86) e apenas um nas amostras de tecido (~28 kDa and pI 4.68). A caracterização final das sequências peptídicas está em andamento por meio de espectrometria de massas. Esses dados, embora preliminares, alteram significativamente o diagnóstico do câncer oral, pois fornecem fortes evidências de que a saliva representa uma poderosa ferramenta clínica para sua detecção precoce, por meio de um método diagnóstico de baixo custo, minimamente invasivo e altamente sensível. CAPÍTULO II: Vários estudos têm descrito a anexinaA1 (ANXA1) como uma proteína ativa no processo de tumorigênese em muitos órgãos. Contudo, o seu papel como biomarcador tem sido, principalmente, avaliado em amostras de tecido por imuno-histoquímica ou cultura celular. Na presente investigação, amostras de sangue periférico de 27 pacientes com carcinoma oral de células escamosas (OSCC) e 25 voluntários saudáveis foram examinadas por meio da técnica de RT-PCR em tempo real quantitativa. Foram observados menores níveis de expressão dos transcritos nos pacientes com OSCC (p=0.026). Níveis significativamente menores de RNA mensageiro foram correlacionados à idade, sexo e também ao sítio anatômico das lesões tumorais. Ademais, análises estatísticas por meio de curvas ROC revelaram que a análise da expressão da ANXA1 é adequada para discriminar pacientes com lesões dentro da cavidade oral, especialmente aqueles do sexo feminino e/ou com 60 anos de idade ou mais. Pela primeira vez foi demonstrado o potencial da ANXA1 como biomarcador sanguíneo e propõe-se a sua adoção como teste diagnóstico complementar não-invasivo. Esses dados sugerem que, além da sua função antiinflamatória, a anexina A1 pode ainda desempenhar um papel supressor de tumor em células do sangue periférico, tais como os leucócitos.

CHAPTER I: Early detection…

Advisors/Committee Members: Luiz Ricardo Goulart Filho, Adriano Mota Loyola, Sônia Maria Oliani, Jair Pereira da Cunha Junior, Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay.

▼ 

Toxoplasma gondii é conhecido por modular a resposta imune pró-inflamatória desencadeada por agonistas de receptores tipo Toll e, neste contexto, tem sido amplamente utilizado como modelo de subversão da imunidade inata. No presente trabalho, um dos possíveis mecanismos pelos quais o parasita é capaz de impedir a produção de óxido nítrico e IL - 12 por macrófagos ativados e células dendríticas ativados é relatado. Foi encontrado que a imunomodulação induzida pelo parasita é independente da invasão pelo parasito vivo e de sua replicação, apresentando padrões distintos dependendo do tipo de cepa utilizada (tipo I ou II). O bloqueio da proteína de superfície por SAG2A por monoclonal específico reverteu a supressão de células ativadas de forma dose dependente. Análises adicionais indicaram que a modulação imune inata induzida através da SAG2A depende da presença da região C-terminal da proteína. Além disso, a análise in silico revelou que a proteína apresenta diversos sítios de fosforilação intracelular de quinases e AMPc do hospedeiro e um sequência ortóloga da cadeia-α do receptor de IL-6 humano e murino, o qual mostrou-se capaz de ligar-se a essa citocina. Assim, a presença de SAG2A em T. gondii é capaz de modular as respostas imune inatas e contribui para mecanismos de evasão do parasita frente a resposta efetora induzida pelo hospedeiro.

Toxoplasma gondii is known to shut down pro-inflammatory responses triggered by Toll-like receptor agonists and, in this sense, has been widely used as a model for subversion of innate immunity. Here, we describe one of the possible mechanisms by which the parasite is able to down regulate nitric oxide and IL-12 production by activated macrophages and dendritic cells. We show that parasite-induced immunomodulation is independent of live invasion and replication, and presented distinct patterns depending on the type of strain used (type I or II). Strikingly, blockage of SAG2A surface protein by specific monoclonal antibody reverted the suppression of activated cells in a dose-dependent manner. Further analysis indicated that the innate immune modulation induced by the molecule depends on the presence of the intact Cterminal region of the protein. Additionally, in silico analysis revealed that the protein presents diverse phosphorylation sites of hosts intracellular kinases and cAMP, in addition to an orthologue of the human IL-6 binding site at the cytokine α−chain receptor, which is shown to actively bind the cytokine. Altogether, we demonstrate that SAG2A by T. gondii is able to modulate innate immune responses and contributes to parasite evasion of effectors mechanisms induced by the host.

Advisors/Committee Members: Neide Maria da Silva, Tiago Wilson Patriarca Mineo, Jair Pereira da Cunha Junior, Ana Patricia Yatsuda Natsui.

▼ 

O objetivo deste estudo foi caracterizar uma nova preparação antigênica de Brucella abortus obtida pela extração com o detergente Triton X-114 (TX-114) por análise imunoproteômica e immunoblot-avidez, utilizando os conjugados de detecção anti-IgG bovina e Proteína A, marcados com peroxidase. Amostras de soros de três grupos de bovinos foram analisadas: (GI) 30 vacas soropositivas não-vacinadas; (GII) 30 novilhas soropositivas e vacinadas com B. abortus S-19; (GIII) 30 vacas soronegativas não-vacinadas. Os perfis eletroforéticos unidimensionais (1-D) e bidimensionais (2-D) do antígeno TX-114 revelaram amplo espectro de polipeptídeos (10 a 79 kDa), e immunoblot 1-D mostrou um extenso perfil de reatividade por soros de GI comparado a um perfil mais restrito por soros de GII, independente dos conjugados de detecção utilizados. Anticorpos IgG de alta avidez foram detectados em soros de GI por ambos os conjugados analisados, mas Proteína A/peroxidase mostrou maior capacidade de detectar anticorpos IgG2 de baixa avidez em soros de GII. Cinco componentes antigênicos imunodominantes (24, 28, 35, 47 e 52 kDa) foram predominantemente reconhecidos por anticorpos IgG de alta avidez em GI, em adição a três componentes antigênicos não imunodominantes reconhecidos exclusivamente por soros deste grupo (10, 12 e 17 kDa), sendo considerados como potenciais marcadores de infecção e exclusão de resposta vacinal. A caracterização proteômica revelou 42 spots no gel 2-D e permitiu a identificação de 22 proteínas citoplasmáticas hipotéticas, enquanto o immunoblot 2-D demonstrou sororeatividade de polipeptídeos abaixo de 20 kDa exclusivamente com soros de GI. A análise por espectrometria de massa destes polipeptídeos permitiu a identificação de cinco proteínas antigênicas de B. abortus (Bfr, Dps/Ndpk-I, Sod e Proteína B de invasão), das quais Ndpk-I e proteína B de invasão foram identificadas em cepa vacinal de B. abortus S-19 pela primeira vez no presente estudo, e relacionadas com a antigenicidade em amostras soropositivas de bovinos não vacinados. Em conclusão, a análise imunoproteômica deste novo antígeno solúvel de B. abortus permitiu a caracterização de várias proteínas antigênicas da cepa S-19 que podem ser candidatas ao sorodiagnóstico da brucelose bovina e diferenciação entre animais vacinados e infectados. A avaliação da avidez de anticorpos IgG2 específicos a marcadores antigênicos do antígeno TX-114 pode ser também considerada como ferramenta adicional para permitir melhor distinção sorológica no perfil de afinidade funcional de anticorpos IgG em resposta à infecção e vacinação na brucelose bovina.

The aim of this study was to characterize a new soluble antigen of Brucella abortus obtained by Triton X-114 (TX-114) extraction by immunoproteomic analysis and immunoblot-avidity, using the detection conjugates anti-bovine IgG and Protein A labeled with peroxidase. Serum samples of three groups of bovine were studied: (GI) 30 nonvaccinated seropositive cows; (GII) 30 S19-vaccinated seropositive heifers; (GIII) 30 nonvaccinated…

Advisors/Committee Members: Deise Aparecida de Oliveira Silva, Jair Pereira da Cunha Junior, Maria Cristina da S. Pranchevivius, Marcelo Emílio Beletti, Jose Roberto Mineo, Renato Fontana.

▼ CAPITULO II: A Leishmania amazonensis é um dos agentes causadores da leishmaniose tegumentar no Novo Mundo. Apesar do fato de que os parasitas intracelulares representam a maior causa de doenças e apesar de anos de esforços, nenhuma vacina efetiva foi desenvolvida. Antígenos de superfície, secretados e excretados foram testados para seu potencial profilático por serem os primeiros fatores do parasito a interagir com sistema imune do hospedeiro e estão usualmente envolvidos no estabelecimento da infecção. Uma vez que a resposta humoral é induzida por epítopos na superfície de um antígeno, ao invés de um antígeno inteiro, é importante localizar estes epítopos com o objetivo de se conceber uma vacina eficaz. Neste intuito, a tecnologia de phage display foi utilizada para a seleção de anticorpos combinatoriais ligantes à superfície do parasito. Um anticorpo denominada La7h foi isolado e a sua reatividade em relação ao parasito foi testada por diferentes ensaios imunológicos demonstrando alta afinidade. Prováveis epítopos ligantes ao anticorpo recombinante foram caracterizados pela seleção de peptídeos recombinantes expressos em fagos, o que permitiu a caracterização de uma possível região antigênica comum em diferentes proteínas de superfície caracterizadas como principais na espécie. Por meio de imunoprecipitação utilizando o anticorpo recombinante em questão, foi possível isolar uma proteína de aproximadamente 42KDa. Tal achado corrobora com os alinhamentos lineares dos peptídeos recombinantes às proteínas de superfície e o estudo da estrutura tridimensional desta proteína contribui para a caracterização do sitio antigênico mapeado pelo anticorpo de fundamental interesse na busca de alvos vacinais mais direcionados e eficazes. CAPITULO III: A leishmaniose é uma doença tropical importante e com incidência crescente a nível mundial, pois não existem vacinas disponíveis e o seu controle é baseado no diagnóstico e tratamento, o que muitas vezes apresenta efeitos colaterais severos. Os testes não são eficazes, pois deixam de detectar com especificidade e sensibilidade as várias formas da doença, além de não identificarem recidiva de reinfecção. Portanto, testes diagnósticos altamente precisos, de baixo custo, de utilização simples e rápida são cruciais para o controle e tratamento das leishmanioses, mas novos antígenos se tornam necessários para o aprimoramento de tais testes. Neste sentido propomos desenvolver peptídeos miméticos de antígenos de Leishmania chagasi e Leishmania amazonensis pela técnica de Phage Display como estratégia proteômica para a descoberta de novos antígenos mais eficazes e sensíveis. Seleções de peptídeos randômicos por Phage Display foram realizadas contra IgG purificada de pacientes com Leishmaniose visceral e tegumentar como forma de mapear antígenos que reconhecessem a resposta imunológica especifica nas duas formas clínicas e que pudessem oferecer uma nova abordagem terapêutica. Os clones foram purificados, amplificados, sequenciados e analisados por bioinformática. Diversos peptídeos… Advisors/Committee Members: Marcelo Emílio Beletti, Luiz Ricardo Goulart Filho, Jair Pereira da Cunha Junior, Fernanda Caroline de Carvalho, Salvatore Giovanni de Simone.

▼ 

Strongyloides stercoralis, nematódeo parasita intestinal, é um dos responsáveis pelas infecções parasitárias mais prevalentes em humanos. A detecção precoce previne o desenvolvimento das síndromes clínicas de hiperinfecção e disseminação. Na procura por marcadores de resposta imune na estrongiloidíase, as propriedades antigênicas de componentes glicosilados de Strongyloides e o desempenho da avidez de anticorpos IgG foram testados em imunoensaios. Considerando a importância do imunodiagnóstico da estrongiloidíase e a capacidade de ligação a carboidratos das lectinas, como concanavalina-A (Con-A), foram testados o extrato salino total de larvas filarioides de Strongyloides venezuelensis (ES) e suas frações obtidas em coluna com Con-A: não ligante (FNL Con-A) e ligante Con-A (FL Con-A) na detecção de imunoglobulinas (IgG e IgA). A determinação de avidez de IgG foi realizada para detectar pacientes com estrongiloidíase e caracterizar origens de discrepância entre sorologia e coproparasitologia. Sensibilidade (Se), especificidade (Es), area under curve (AUC), likelihood ratio (LR) e coeficientes de correlação foram calculados; a análise estatística foi feita pelos testes de Mann Whitney e exato de Fisher. FNL Con-A mostrou os melhores parâmetros diagnósticos para detecção de IgG (Se 95,0%, Es 92,5%, AUC 0,99, LR 12,7) e alta correlação (r = 0,700) com o ES. As frações não demonstraram claramente utilidade na detecção de IgA. Índice avidez (IA) foi calculado para cada amostra de soro considerando: (a) IA de triagem (diluição 1:160) e (b) IA médio a diferentes diluições. Para diferenciar os grupos nos IA de triagem e médio foi estabelecido limiar de 75% (p <0,001). Immunoblot avidez foi auxiliar para a análise de casos discrepantes no ELISA e serviu como ferramenta complementar na identificação de antígenos responsáveis pela maturação da afinidade. Concluiu-se que FNL Con-A demonstrou conter fonte importante de peptídeos específicos eficientes na detecção de IgG no imunodiagnóstico da estrongiloidíase; e o ensaio de avidez de IgG distinguiu infecção ativa por S. stercoralis com eliminação de larvas dos casos suspeitos ou falso positivos.

Strongyloides stercoralis, a human intestinal nematode, causes one of the most common worldwide parasitic infections. Early detection prevines the development of disseminated and hyperinfection syndromes. In search for immune response markers for strongyloidiasis, antigenic properties of glycosylated components from Strongyloides and IgG avidity performance were tested in immunoassays. Considering sugar-binding capacity of lectins, as concanavalin-A (Con-A) and immunodiagnosis importance we tested total saline extract of Strongyloides venezuelensis filariform larvae (SE) and its fractions obtained in Con-A column: Con-A unbound (Con-A UF) and Con-A bound (Con-A BF) in immunoglobulin detection (IgG and IgA). IgG avidity determination was investigated to detect patients with strongyloidiasis and characterize sources of disagreement between serology and coproparasitology. Sensitivity (Se),…

Advisors/Committee Members: Julia Maria Costa-Cruz, Fabiana Martins de Paula, Heliana Batista de Oliveira, Jair Pereira da Cunha Junior.

▼ 

Atualmente não existem biomarcadores capazes de predizer o resultado ou evitar tratamentos desnecessários no câncer de mama (BC), e os marcadores de diagnóstico apresentam um comportamento variável, o que sugere uma maior complexidade e heterogeneidade dos subtipos de BC existentes. Nós caracterizamos como alvo biológico um novo anticorpo Fab em tecidos BC e avaliamos sua relevância clínica para o diagnóstico, prognóstico e estadiamento da doença. Uma biblioteca combinatória de anticorpos Fab foi construída utilizando uma mistura dos transcritos de 20 pacientes com carcinoma ductal invasivo. A seleção por phage display contra tecidos BC de todos os estadiamentos da mama identificou o anticorpo FabC-4, que foi intensamente investigado por imunohistoquímica (IHC) em um tissue microarray gerado de uma coorte com 232 pacientes BC. O ligante de FabC-4 foi determinado por espectrometria de massas. O FabC-4 foi selecionado baseado na sua elevada reatividade em todos os estádios de BC e seu poder de diferenciar de doenças benignas e controles saudáveis, com sensibilidade e especificidade significativa (70% e 62%, respectivamente). A sua expressão mais elevada em tecidos foi associada com BCs agressivos; por exemplo, menor idade, ausência do receptor de progesterona, graus histológicos maiores e fenótipos não-luminais e também foi identificado um subgrupo com bom prognóstico nos BCs triplo-negativo. O alvo biológico do FabC-4, identificado por espectrometria de massa, é um epítopo conformacional da citoqueratina-10 (CK10). Nosso anticorpo específico de um epítopo de CK10 é o primeiro grande biomarcador bi-funcional tecido específico para o diagnóstico e classificação histopatológica de BC, o qual também estar associado com agressividade de BCs. Além disso, o anticorpo identifica um subgrupo de BCs triplo negativos com bom prognóstico. Seu papel no BCs devem ser abordados em estudos futuros.

Background Currently there are no biomarkers capable of predicting the outcome or avoiding unnecessary treatment in breast cancer (BC), and diagnostic markers have variable behavior, suggesting a higher complexity and heterogeneity of existing BC subtypes. We have characterized the biological target of a new Fab antibody in BC tissues and assessed its clinical relevance in diagnostics, disease staging and prognosis. Methods A Fab antibody combinatorial library was constructed by mixing transcripts from twenty patients with invasive ductal carcinoma. Phage Display selections against BC tissues from all stages led to the breast specific FabC-4 antibody, which was thoroughly investigated by immunohistochemistry (IHC) in a tissue microarray generated by a cohort of 232 BC patients. The FabC-4 ligand was determined by mass spectrometry. Results The FabC-4 was selected based on its high reactivity to all BC stages and discrimination power from benign diseases and healthy controls, with significant sensitivity and specificity (70% and 62% respectively). Its higher tissue expression was associated with aggressive BCs; i.e., younger age, lack of…

Advisors/Committee Members: Luiz Ricardo Goulart Filho, Jair Pereira da Cunha Junior, Adriana Freitas Neves, Marcelo José Barbosa da Silva, Carlos Eduardo Paiva.

▼ 

Neurocisticercose (NC) é uma comum infecção do sistema nervoso central em humanos, seu diagnóstico é estabelecido pela combinação de dados clínicos, de neuroimagem (tomografia computadorizada e ressonância magnética), dados imunológicos e epidemiológicos. Testes sorológicos como o enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) e immunoblotting na detecção de anticorpos específicos contra metacestódeos de T. solium em amostras de soro ou líquor, podem ser uma ferramenta viável para o diagnóstico da NC. O uso de antígenos heterólogos de metacestódeos de Taenia saginata para o imunodiagnóstico da NC é importante, principalmente em lugares onde a obtenção de antígeno homólogo de metacestódeos de T. solium é difícil. O objetivo do estudo foi fracionar e caracterizar parcialmente frações obtidas a partir do extrato salino de metacestódeos de T. saginata (ES) através de cromatografia de troca iônica em resinas Carboximetil-sepharose (CM) e Dietilaminoetil-sepharose (DEAE), como fonte de marcadores antigênicos aplicáveis no imunodiagnóstico da NC. Para detecção de anticorpos IgG pelos testes ELISA e immunoblotting, 140 amostras de soro foram analisadas: 45 de pacientes com NC (G1), 50 de pacientes com outras infecções parasitárias (G2) e 45 indivíduos saudáveis (G3). Sensibilidade (Se), especificidade (Es), área sob a curva (AUC) e likelihood ratios (LR) foram calculadas. As frações CMS2 e DEAES2 apresentaram altos parâmetros de diagnóstico (Se 88,8% e 93,4%; Es 93,7% e 92,6%; AUC: 0,965 e 0,987, LR+: 14,07 e 12,67; LR−: 0,11 e 0,07,respectivamente). Em conclusão as frações CMS2 e DEAES2 são importantes fontes de peptídeos específicos, com alta eficiência para diagnosticar a NC.

Neurocysticercosis (NC), is common infection of the human central nervous system, diagnosis is established by the combined analysis of clinical data, neuroimaging (computerized tomography and magnetic resonance), immunological and epidemiological data. Serological tests as enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and immunoblotting to detect specific antibodies against metacestodes of T. solium in serum samples or cerebrospinal fluid may provide a viable tool for the diagnosis of NC. The use of heterologous antigen from Taenia saginata metacestodes for NC immunodiagnosis is important where the collection of T. solium metacestodes for the preparation of homologous antigen is difficult. The aim of this study was to fractionate and partially characterize fractions obtained from the total saline extract (SE) of T. saginata metacestodes after ion-exchange procedure in carboxymethyl sepharose (CM) and diethylaminoethyl sepharose (DEAE) resins, as a source of antigenic markers applicable in the immunodiagnosis of NC. For IgG detection by ELISA and Immunoblotting, 140 serum samples were analyzed: 45 from patients with NC (G1), 50 from patients with other parasitic infections (G2) and 45 from healthy individuals. Sensitivity (Se), specificity (Sp), area under curve (AUC) and likelihood ratios (LR) were calculated. CMS2 and DEAES2 fractions provided high…

Advisors/Committee Members: Julia Maria Costa-Cruz, Vanessa da Silva Ribeiro, Heliana Batista de Oliveira, Jair Pereira da Cunha Junior.

▼ 

CAPÍTULO II: O câncer de ovário é a neoplasia ginecológica mais frequente no mundo desenvolvido, que continua a matar mais mulheres do que todos os outros tipos de câncer ginecológicos juntos. A ausência de sinais e sintomas, aliada à falta de estratégias de rastreamento, contribuem para o diagnóstico tardio na maior parte das pacientes, resultando assim em baixas taxas de cura. A tecnologia de Phage Display permite a seleção de peptídeos e proteínas, incluindo anticorpos com alta afinidade e especificidade para vários alvos. As moléculas caracterizadas no presente estudo apresentam potencial como novas ferramentas tanto no diagnóstico clínico quanto na terapia do câncer de ovário, além de fornecer informações complementares aos parâmetros da rotina clínica utilizados atualmente. Nossa estratégia de Phage Display produziu, com sucesso, peptídeos miméticos a antígenos tumorais ovarianos, que foram capazes de discriminar tumores malignos de tumores benignos de ovário. Estes marcadores melhoram significativamente o valor diagnóstico do CA125. Finalmente, temos também produzido por Phage Display, anticorpos recombinantes Fab, ligantes específicos aos peptídeos miméticos e a antígenos tumorais ovarianos, que podem apresentar potencial papel imunoterapêutico no tratamento do câncer de ovário.

Ovarian cancer is the most common gynecologic cancer in the developed world, which continues to kill more women than all other gynecological cancers combined. The absence of signs and symptoms coupled with lack of screening strategies contribute to the late diagnosis in most patients, resulting in low cure rates. The Phage Display (PD) technology allows the selection of peptides and proteins including antibodies with high affinity and specificity for multiple targets. The molecules characterized in this study are potential new tools in both clinical diagnosis and therapy of ovarian cancer, and provide additional information to the parameters of the ongoing clinical routine. Our phage display strategy produced successful mimetic peptides to specific ovarian tumor antigens, which were able to discriminate malignant tumors from the benign ovarian disease. These markers have significantly improved the diagnostic value of the CA125. Finally, we have also generated through PD recombinant Fab antibodies that specifically bind to the mimetic peptides and to ovarian tumor antigens, which may present potential immunotherapeutic role in the ovarian carcinoma treatment.

Advisors/Committee Members: Marcelo José Barbosa da Silva, Adriano Mota Loyola, Leticia Batista Azevedo Rangel, Luiz Ricardo Goulart Filho, Etel Rodrigues Pereira Gimba, Ana Graci Brito Madurro, Jair Pereira da Cunha Junior.

▼ CAPÍTULO III: Objetivo: O objetivo do trabalho foi comparar a performance de três testes sorológicos em pacientes e seus contatos domiciliares utilizando dois testes quantitativos ELISA, um com o antígeno PGL-1 nativo (ELISA PGL-1), com o antígeno ND-O-HSA sintético (ELISA ND-O-HSA), e o teste semi-quantitativo do fluxo lateral (ML-FLow). Métodos: Os três testes imunológicos ELISA PGL-I, ELISA ND-O-HSA, e ML-Flow foram realizados utilizando soros de 156 pacientes com hanseníase e 191 contatos domiciliares. Resultados: Os resultados da sensibilidade dos testes ELISA PGL-1, ND-O-HSA e ML-FLow foram de 68.83%, 63.65%, e 60.65%, respectivamente. Os testes ELISA PGL-1 nativo e sintético detectaram anticorpos em 22,73% e 31,82% dos soros de pacientes paucibacilares (PB),e o teste ML-FLow não apresentou reatividade em nenhum soro. O ML-Flow foi capaz de discriminar entre os pacientes com as formas PB e multibacilares (MB), enquanto que o ELISA PGL-1 e ND-O-HSA correlacionaram com a carga bacilar e as formas clínicas de Ridley-Jopling. Em contatos domiciliares, os testes ELISA PGL-1 nativo, ND-O-HSA e Ml-FLow detectaram soropositividade de 25%, 17%, e 10%, respectivamente. Conclusões: O uso do teste ELISA e ML-Flow são recomendados no diagnóstico e classificação das formas clínicas, auxiliando na prescrição do tratamento correto e na prevenção do dano neural e da incapacidade. CAPÍTULO IV: Interação patógeno-hospedeiro é mediada principalmente por moléculas especializadas do envelope celular. Um dos componentes essenciais da parede celular das micobactérias é a lipoarabinomanana (LAM). A LAM tem um papel imunomodulador, mas a sua heterogeneidade pode ser responsável pela resposta imune diferenciada em pacientes com hanseníase e contatos. Espera-se que a pesquisa por motivos estruturais de M. leprae possam contribuir, como fatores de virulência ou epítopos de proteção, e assim, derivar biomarcadores eficazes para o diagnóstico, drogas e vacinas contra a hanseníase. Portanto, nosso objetivo foi desenvolver peptídeos miméticos específicos à LAM utilizando Phage Display de uma biblioteca aleatória de peptídeos heptameros que possam reconhecer uma resposta diferencial em pacientes com hanseníase e contatos. Nós utilizamos o anticorpo monoclonal anti-LAM, CS-35, como um alvo de três rodadas de seleção. Após seqüenciamento e tradução, os peptídeos foram pré-validados por ELISA e comparados com o antígeno sintético LAM-BSA. O motivo peptídeo mais reativo e repetitivo (A9) foi posteriormente testado contra o soro de 54 pacientes com hanseníase e 27 controles endêmicos por ELISA. O clone mimético A9 apresentou altos níveis de anticorpos IgG em pacientes paucibacibacilares (PB), sendo que 50% destes soros foram altamente reativos. Esta reação também ocorreu em pacientes tuberculóides, dimorfo-dimorfo e virchowiano. Controles endêmicos e pacientes reacionais apresentaram altos níveis de IgG1 no soro. Por outro lado, o perfil de IgG e suas subclasses em pacientes apresentou altos níveis de IgG e IgG2 e baixos níveis de IgG1. O clone A9… Advisors/Committee Members: Isabela Maria Bernardes Goulart, Norma Tiraboschi Foss, Luiz Ricardo Goulart Filho, Deise Aparecida de Oliveira Silva, Jair Pereira da Cunha Junior, Milton Ozório Moraes.

▼ 

A neurocistocercose humana (NC) é uma doença muito importante, porém negligenciada e é a maior causa de epilepsia em países em desenvolvimento onde a parasitose ocorre. A expressão de fragmentos de cadeia única das regiões variáveis de anticorpo (scFv) na superfície de bacteriófagos é amplamente utilizada para obter anticorpos com especificidades pré-definidas. Uma biblioteca de anticorpos foi utilizada para a seleção de clones específicos à peptídeos expostos em fagos acoplados a beads e ao extrato salino total de Taenia solium (S) imobilizado em placas de microtitulação. Após dois ciclos de seleção, 96 clones de anticorpos foram selecionados contra cada alvo, testados para expressão do scFv e especificidade pelo alvo. Aqueles clones que se mostraram específicos foram melhor analisados por ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), Dot blot, sequenciamento e imunofluorescência. Três clones foram selecionados para serem utilizados na captura antigênica e caracterização do antígeno verdadeiro e para captura de novos antígenos com potencial aplicação em testes diagnósticos. O extrato S foi fracionado em resina de troca iônica diethylaminoethyl (DEAE) para obter frações que foram posteriormente testadas por ELISA para detectar IgG em amostras de soro de pacientes: com NC, outras parasitoses e saudáveis, 40 amostras cada grupo. A fração com melhores parâmetros diagnósticos (sensibilidade, especificidade, área sob a curva e likelihood ratio, calculadas por TG-ROC) foi selecionada e sujeita à captura antigênica usando cada clone de scFv purificado. Cada fração capturada foi testada por ELISA para detectar IgG em 30 amostras de soro de cada grupo. Nos testes de imunofluorescência, nenhuma fluorescência foi observada com os controles negativos e todos os clones mostraram um padrão de marcação não uniforme, seus antígenos alvo foram elucidados por espectrometria de massas. Após fracionamento por troca iônica e ELISA, a fração DEAE S2 se mostrou a melhor e foi utilizada para a captura de novos antígenos. A fração DEAE S2 mostrou especificidade de 93,3%. Dentre todos os clones, o A4 e o B6 capturaram antígenos do extrato S e fração DEAE S2, respectivamente, com os melhores parâmetros diagnósticos. Em conclusão a tecnologia de exposição de anticorpos em fagos é uma técnica potencial para o estudo de interações antígeno-anticorpo utilizadas para melhor elucidar a a biologia da interação na NC e para capturar novos antígenos potencialmente aplicáveis para o diagnóstico da NC.

Human neurocysticercosis (NC) is an important but neglected cause of epilepsy in developing countries where the parasite occurs. Expression of single-chain variable fragment (scFv) antibodies on the surface of bacteriophage is widely used to prepare antibodies with pre-defined specificities. A phage antibody library was selected against peptides displayed on phages coupled to beads and total saline extract of Taenia solium metacestodes immobilized on microtiter plate wells. After two rounds of selection 96 phage clones of each panning were selected, tested…

Advisors/Committee Members: Luiz Ricardo Goulart Filho, Guilherme Rocha Lino de Souza, Jair Pereira da Cunha Junior, Heliana Batista de Oliveira, Rone Cardoso, Julia Maria Costa-Cruz.

▼ 

Anticorpos policlonais específicos podem ser obtidos em grandes quantidades a partir da gema do ovo de galinhas imunizadas, denominados anticorpos IgY. Embora semelhantes funcionalmente aos anticorpos IgG de mamíferos, os anticorpos IgY apresentam vantagens: (i) extração sem estresse para o animal; (ii) menor número de animais utilizados na produção; (iii) grandes concentrações de anticorpos por gema; (iii) não sofre interferência do fator reumatóide e de proteínas do sistema complemento de mamíferos; (iv) interage apenas com receptores para Fc de galinha. Os anticorpos IgY são utilizados em estudos da relação patógeno versus hospedeiro, proteômica e biologia de agentes infecciosos. Toxoplasma gondii é um parasito amplamente distribuído e com grande número de hospedeiros, incluindo o homem, e pode ocasionar lesões em fetos humanos e de animais domésticos. A relação T. gondii versus hospedeiros, o papel dos antígenos do parasito nos processos de infecção e manutenção do parasitismo intracelular, podem ser investigados pela incubação do parasito com anticorpos específicos obtidos de mamíferos. Os anticorpos de mamíferos são obtidos em concentrações limitadas e por meio de procedimentos dolorosos. Neste estudo, galinhas foram imunizadas com antígenos solúveis de T. gondii da cepa RH. Foram extraídos, em média, 4 mg de IgY/ mL de gema de ovo. Detectaram-se anticorpos IgY anti-STAg de alta avidez após o segundo booster, também reconheceram alvos antigênicos de distintos pesos moleculares. Os anticorpos IgY anti-STAg detectaram o parasito intracelular em cultivos de células HeLa e também em cortes histológicos de tecido fixado. Diferente dos anticorpos IgG de camundongos, nos ensaios Western blot 1D e 2D, os anticorpos IgY reconheceram proteínas antigênicas de pesos moleculares e pontos isoelétricos distintos, respectivamente. Em ensaio de proliferação do parasito, observou-se que a incubação dos taquizoítos de T. gondii com os anticorpos IgY específicos reduziu parcialmente o parasitismo intracelular. Concluiu-se que anticorpos IgY policlonais são ferramentas eficazes para estudos da biologia de T. gondii e podem auxiliar na pesquisa de alvos antigênicos para utilização em diagnóstico e produção de vacinas.

Specific polyclonal antibodies obtained from egg yolk of the immunized chicken are named immunoglobulin Y (IgY). Although functionally related to mammal immunoglobulin G (IgG), IgY presents advantages, as follows: (i) elevated purified amounts of antibodies from one egg; (ii) the reduced of immunized animal number (iii) no interference with rheumatoid factor or mammal Complement proteins; (iv) binds only to chicken specific Fc fragment receptor. Polyclonal IgY antibodies could be employed as a primary or secondary reagent to investigate pathogen and host relationship, proteomic studies or infectious microorganisms biology. Toxoplasma gondii is a worldwide intracellular parasite which infects warm-blood hosts, including human. Toxoplasmosis causes fetal disorders in human and domestic animals. Tachyzoites and…

Advisors/Committee Members: Deise Aparecida de Oliveira Silva, Marcelo José Barbosa da Silva, Joely Ferreira Figueiredo Bittar, Tiago Wilson Patriarca Mineo, Jair Pereira da Cunha Junior, Rodrigo Martins Soares.

▼ CAPÍTULO 2: A brucelose bovina é uma doença com grande impacto na produção animal e de repercussão na saúde humana. Estimativas mostram que a brucelose é responsável pela diminuição na produção de leite e de carne e pela redução da produção de bezerros. Apesar de testes diagnósticos oficiais e sensíveis serem utilizados, ainda não se tem um teste sorológico ideal para todas as situações epidemiológicas, pois são trabalhosos, complexos e de alto custo. Em relação às vacinas, buscam-se formulações vacinais protetoras diversas e que não interfiram no diagnóstico, mas somente as vacinas vivas atenuadas são efetivamente utilizadas nos programas de controle da brucelose. Neste trabalho, peptídeos recombinantes foram selecionados pela técnica de phage display, após três ciclos de seleção, utilizando uma biblioteca comercial Ph.D.-C7C contra anticorpos policlonais de animais positivos para brucelose. Nove clones foram selecionados, sequenciados, traduzidos. Dois peptídeos foram sintetizados quimicamente e verificamos suas potenciais aplicações diagnósticas e vacinais. Os peptídeos foram testados por ELISA com 80 soros positivos e negativos, e apresentaram uma sensibilidade de até 97,5% na detecção de anticorpos circulantes de animais com brucelose. Visando aplicação diagnóstica, o peptídeo Ba9 foi imobilizado sobre um eletrodo de grafite modificado com poli (3-HFA) e medidas voltamétricas foram realizadas na presença de soro positivo e negativo, que mostraram ser altamente efetivo para discriminar animais doentes, resultando em uma técnica simples, rápida e reprodutível podendo futuramente ser realizada em laboratórios ou em campo. Quanto aos ensaios vacinais em camundongos imunizados com extratos protéicos e a bactéria irradiada, demonstrou-se que as formulações vacinais com os peptídeos induziram uma resposta imune celular baseada na produção de TNFα, bem como uma resposta humoral com altos níveis de IgG2a e IgG1, sugerindo um provável efeito protetor, o que deve ser comprovado com infecção ativa em ensaios biológicos posteriores. Advisors/Committee Members: Vasco Ariston de Carvalho Azevedo, Tiago Wilson Patriarca Mineo, Jair Pereira da Cunha Junior, Ana Cláudia Arantes Marquez Pajuaba, Tatiana Amabile de Campos, Luiz Ricardo Goulart Filho.